高效液相色譜法3

第三章高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography

(HPLC)一、高效液相色譜中的速率方程

遷移的流動相滯留的流動相渦流擴散項縱向擴散流動相傳質(zhì)滯留區(qū)傳質(zhì)固定相內(nèi)傳質(zhì)結(jié)論:

提高柱效的關鍵是用小粒徑填料：超高壓液相UPLC

流動相粘度↓,n↑：高溫液相色譜低流速，高柱效二、高效液相色譜儀1.儀器流程2.檢測器

紫外檢測器（UVD）示差折光檢測器（RID）熒光檢測器（FD）蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）電化學檢測器固定波長可變波長二極管陣列(DAD)(1)紫外檢測器A.固定波長的紫外檢測器典型的流通池結(jié)構(gòu)

B.可變波長的紫外檢測器C.二極管陣列檢測器3-DplotofDAD可得到每個峰的光譜圖可進行譜庫檢索可進行純度檢驗可進行多波長定量D.紫外檢測器的特點選擇性檢測器高靈敏度線性寬穩(wěn)定可做梯度HPLC的常規(guī)檢測器通過衣選擇涉合適竄的檢地測波早長來戚提高暮方法裳的選吹擇性(2故)示差需折光污檢測科器A.結(jié)構(gòu)通用靈敏媽度低溫度硬敏感改變船流動搖相要同重新棍平衡繪體系不能驗做梯勒度B.示差群折光敲檢測籌器的答特點(3店)熒光耕檢測殃器A.結(jié)構(gòu)高選偏擇性高靈祥敏度干擾話少可做猶梯度激發(fā)專波長纏和發(fā)炒射波攜長皆呈可變白化B.特性(4殺)蒸發(fā)要光散紀射檢魂測器(E想LS準D)A.原理菊和結(jié)險構(gòu)I=a.mblg裝I=bl欠gm+lg變a1-色譜四柱；2-噴霧牙氣體袖；3-蒸發(fā)沈漂移么管；4-樣品堤液滴滅；5-激光斧光源慕；6-光二榴極管乓檢測般器7-散射巧室通用恰型靈敏喂度較泄高方便可梯脂度響應疲與質(zhì)回量有怒關B.誕E直LS跪D的特攀性(5認)電化刻學檢繭測器Co董nd辟uc純ti約vi區(qū)ty堂d陷et品ec似ti頂on蒸:電導凡檢測馳器DCAm甚pe那ro移me瘋tr滾icde膝te案ct飯io藝n:直流文安培牙檢測會器In敢te貪gr餅at鑰ed沈a乖nd巖p車ul劉se壇dam賢pe斯ro譜me旬tr薄ic：積分寒或脈街沖安寄培A.分類選擇峰性檢賞測器靈敏幸度高電導撥檢測拆器是懶離子須色譜疾的常詳規(guī)檢頂測器DCam舅pe唐ro幸me茄tr遞y:神經(jīng)被化學顏類物兩質(zhì)的傻檢測Pu光ls期edam夸pe亡ro喇me病tr聞y:碳水個化合賭物的羊檢測B.特點3.儀器星附件De史ga評s脫氣督機Gr誓ad抬ie來nt梯度挽裝置Co叢lu渣mn揉T遠he刑rm仆os張ta榴t柱溫場箱Au弟to狠s束am淺pl輪er自動荒進樣均器Fr急ac許ti充on聚c撿ol傭le植ct覺or餾分占收集腹器梯度筍洗提梯度飽洗脫烏即程歌序控會制流君動相進的組蓮成，灑使在軟整個價分離型過程層中，智溶劑碗強度條按照近特定妨的變比化規(guī)我律增濾加。優(yōu)點界：分擇離復錘雜混絹合物袖，使喉所有休組分功都處灰在最麻佳的k值范姜圍內(nèi)鋼。溶劑A溶劑B電磁閥A電磁閥B混合室泵溶劑A溶劑B高壓泵A

高壓泵B混合室低壓挨溶劑穴梯度向方框達圖高壓止溶劑敬梯度頓方框澆圖實現(xiàn)房誠方式對于六復雜積樣品籮，線騰性梯繳度是假最好喇的。正相模色譜輪中，茫常用礦二氯言甲烷鬼加入青到正策己烷倒中來寬實現(xiàn)掌。反相袋色譜海中，頑乙腈及，甲扁醇加濁入到舍水中施是最折常用系的。三、HP占LC主要太類型椅及其顛選擇化學訊鍵合里相色步譜法液固圓色譜概法離子痕對色口譜法離子磚色譜據(jù)法體積梨排阻很色譜值法1.鍵合的相色吧譜法（1）鍵絕合相獸色譜柱法的厭分類裁和分番離機快理正相凡色譜買：流動獲相極嚼性<固定拉相極司性分配瓶機理反相勾色譜佳：流動費相極帽性>固定疾相極險性疏溶漂劑（金水）視作用萄機理拓展動知識唐：HI舒LI謙C（親旬水相陽互作去用色過譜）反相什鍵合嶺相色再譜法員的疏水征機理：溶質(zhì)鄰進入坐極性藝流動調(diào)相(水）頭后，束其疏獄水基搭團由掃于水伍的斥曠力與味非極賞性固醋定相徐上的供烷基痰締合呢，構(gòu)備成單務分子倡吸附旱層。販當流翅動相漲極性醒減小蹤蝶時，坦這種圍疏水就斥力輝下降陰。類型分離方式應用特點C-18反相、離子對普適性好，保留值大。溶于水的高極性化合物、中等極性化合物C-8反相、離子對與C-18類似，保留值略小C-3,C-4反相保留值小，適合肽類和蛋白質(zhì)苯基反相保留適中，選擇性不同。非極性、中等極性化合物-CNHILIC、正相、選擇性與硅膠類似，保留小，用途較廣-NH2HILIC、正相分離糖類、核苷酸、固醇等二醇基HILIC、正相分離有機酸、排阻分蛋白質(zhì)等醚基反相、正相分離酚類、芳硝基化合物，保留比C-18強聚苯乙烯基反相pH使用范圍廣，對部分分離峰形好，壽命長（2）常用固西定相固定捷相的灘碳鏈槽長度嚇對保繁留時之間的腔影響固定懂相的宇商品得牌號邪對分聽離的顫影響（3）流動輩相表征摘溶劑免特性炊的重悲要參賄數(shù)溶劑辣強度ε°：溶疏劑分弦子與則吸附蒜劑的負親合帝程度溶解桃度參手數(shù)δ：衡量幣溶劑織極性應強度睡的指灰標。凈是溶口劑和拉溶質(zhì)鍛分子里間色束散力彎、偶朗極力拐、接開受質(zhì)身子或腫給予騾質(zhì)子搞能力佳的總捷和。δ相近炎的溶睬劑，以選擇糾性α不同踩。粘度η：溶劑怪的選北擇原予則具有最穩(wěn)定蛋的化溝學性銳質(zhì)；站溶劑恐與檢泊測器伯兼容粘度適要小腎；沸姻點不退太低睡；純砍度高榴且價元格便魯宜正相卻：正己擁烷/正庚引烷為齒主體憤，加嫂入質(zhì)急子受榮體乙亦醚或質(zhì)甲基算叔丁賭基醚伶，質(zhì)枕子給袋體氯篇仿，岔偶極焦溶劑報二氯逮甲烷支等反相特：以水銜為主領體，前加入涼質(zhì)子疫受體呼甲醇回，質(zhì)弱子給濟體乙辛腈，籠偶劑覽溶劑駐四氫坑呋喃綁。（4）影響難保留易值的彼因素溶質(zhì)與結(jié)構(gòu)獲對保仇留值絞的影閉響：正相璃：溶質(zhì)躺極性俊越強危，官封能團漢越多初，保僻留值悅越大反相昆：溶質(zhì)元極性氣越弱匹，疏駛水性槳越強返，保秤留值渠越大輕。溶植質(zhì)的洞保留沒值與榜其分仗子非樸極性剛部分企的總景面積陣有關炸，面浙積大甲，保粉留值暗大。烷基舌鍵合燭固定如相特津性對楚保留托值的商影響醉：反相帝：鍵汁合相宴烷鏈喊長，k大，練選擇孝性好溶劑張性質(zhì)框：正相孫：溶后劑極境性越兇弱，漂保留善越大反相鳴：流奪動相挺表面糊張力畝大、衣介電峰常數(shù)盈大，醒則極昌性越拍強。巡壽其斥現(xiàn)力越之大，戴溶質(zhì)辰與固松定相沫鍵合犬越強溝，保輸留值貪越大羊。pH值的姨影響加入何酸、斷堿或迫緩沖偶液，?？刂苝H，抑禽制溶謹質(zhì)的謀離子冊化，覽改善爐峰形近。用遷于分山析弱罪酸、書堿。鹽的標影響抽：通常醒加入魄醋酸厭鹽、尿硼酸痰鹽、花磷酸自鹽等燥。抑丑制溶拆質(zhì)的近離子浪化，忙改善鑼峰型貓，抑扯制拖撕尾，勿提高粘保留緊時間姓的重鉗復性演。影響知流動贏相的詞表面瓣張力預，所躺以對啄中性把化合忠物的踏保留幫時間稻也略仍有影壁響。8種人升參皂什苷的k值與分流動滅相離贊子濃艙度的銷關系應用2離子迫對色鄭譜法Io者n-披pa燈ir目c劇hr泡om職at常og青ra嶺ph距y（1）基本原抵理將一問種或希數(shù)種吹與樣茫品離臟子電顯荷（A+）相反綢的離序子(B-)（稱為酸對離居子或鎮(zhèn)反離啊子）嫂加入閱到色愛譜系移統(tǒng)流預動相東中，歐使其完與樣鏡品離和子結(jié)秋合生凱成弱刻極性坐的離犬子對?。ㄖ屑刃跃喤搴衔镂穑┑膯畏蛛x東方法及。多強為反膽相離胖子對院色譜（2）固定相閘、流粥動相濾和離漠子對于試劑固定悉相：多為C1揉8,假C8反相疲鍵合糞相流動小相：是以聰水為識主的毛緩沖漸液，業(yè)或水-甲醇攏、水-乙腈榆等混共合溶濱劑離子并對試釀劑：四差丁基玩銨正轉(zhuǎn)離子顆、十們六烷累基三玩甲基冶銨正錦離子澡，Cl窄O4-，十二亦烷基禿磺酸厚根等（3）生影響攝保留求值的納因素pH的影理響：改善初分離挽選擇敞性的芬有效百方法撤。反相劃中，殘對于蛋陰離寬子的恢分離根，pH下降斑，k減小乒。離子本對試硬劑的集性質(zhì)獵與濃鑼度：反踐相中醋，離踏子對曠試劑利烷基足鏈越爆長，飯疏水竟性越倒大，k越大沸。溶劑餅的極電性：反相蛾中，泊甲醇扒、乙填腈等與含量闊增加砍，洗號脫強兄度增糠大，k下降隱。洗糠脫強蓋度與糊極性罩參數(shù)才、介帝電常燥數(shù)同扯時相麻關離子因強度：反塵相中闊，離犯子強巡壽度增癢加，征溶質(zhì)k下降（4）應著用有機盤酸、速有機圖堿特段別是強酸擠、強編堿的分堂析：如羧族酸、顯磺酸瀉、胺繭類、嬌酚類時、藥巷物、偽染料臨等反相笨離子叔對色尚譜分額析有六機酸固定句相：C1何8烷基祖鍵合麻相流動斷相：0.畢03巖mo過l/喊L四丁驗基銨+戊醇1.萍4搶-氨基芽苯甲言酸；2.嬸3舒-氨基籍苯甲爐酸；3.甘4利-羥基敢苯甲肥酸；4.挽3申-羥基融苯甲脖酸；5.苯磺忘酸；6.苯甲瓶酸；7.甲苯-4杏-磺酸3.液固拘色譜坡法（1）分預離機嚇理以固氣體吸卡附劑折為固畜定相非的液叼相色測譜法溶質(zhì)矩分子郊和流赴動相宅分子斗在吸奔附劑惱表面歌的吸她附活午性中柿心上障進行嘉競爭跡吸附（2）秩固定史相極性軍：硅駝膠、此氧化填鎂、桂氧化觀鋁等非極恨性：云活性輪炭、牽高分林子多厚孔微慕球、羽碳多般孔微定球等（3）流率動相ε°越大符，洗蛾脫力疑越強蛇。硅膠痕為固蓋定相峽時：幻玉以正浪構(gòu)烷倦烴為微主體扔，加票入二冶氯甲聾烷調(diào)落節(jié)合押適的傅洗脫殼強度椒?？捎谜舅畬ξ枘z漲進行掙減活捐處理雕，或款加入米四氫美呋喃奸、乙趙腈、敞甲醇勁、異夢丙醇姨等改漂性劑（4）影響初保留蘇值的田因素樣品道分子道結(jié)構(gòu)溶質(zhì)誤分子只的官干能團濫極性誕增加已，保斃留值熊增加溶質(zhì)秋分子泄的官除能團詳數(shù)目份增加泡，保袖留值額增加保留洽值與預溶質(zhì)偉的空抖間效胸應有讓關保留種值與笛吸附寬中心帥的幾待何分砌布有祖關吸附挖劑吸附幣劑的稻孔徑竿越小早，表亞面積旁越大宗，保惰留值跡越大吸附答劑的鉤活性愁越強懂，保形留值碼越大流動稱相D.應用中等劃分子慈量的抄油溶怨性樣顏品如舌油品獎、脂國肪、僻芳烴羽等不同湊極性肝取代六基的捕化合盡物結(jié)構(gòu)酸異構(gòu)那體和梯幾何菌異構(gòu)眨體混吧合物蜜的分沸離4.離子押色譜帳法(1總)分離務機理不同糖的離尊子與貴樹脂石離子翁的交顯換能窯力（拜親和靠能力稼）不廊同，陪親和債力越跟大，潔離子確越難砍洗脫愧，從脅而得籠以分扁離（2）離飄子色扁譜的干儀器離子聞色譜章的分鐮離原撈理與偽離子傷交換應色譜黃一樣圍。最大編的改鏡進是啦解決叨了微評量組島分的仔檢測勾問題夾。雙柱符抑制竿型：在分社離柱騎和檢屢測器余之間購加一騰個化里學抑哪制器愁，其權(quán)作用則有二傭，一躁是降沖低淋痛洗液偽的背們景電腔導，厚二是開增加脾被測鹽離子憐的電象導值睬，改父善信低噪比侵。靈噸敏度畢高。單柱湊非抑翼制型鵲：淋洗彎液直須接進膚入電遺導檢弟測器眨。簡班單、盤分辨嚴率較收好。（2）固膽定相離子音交換縮慧劑，暈根據(jù)綠功能午基可呼分為饑：強槽酸型箭（磺插酸基堆團）考、強帥堿型符（季觀銨基瀉）、塊弱酸省型（燙羧酸尋）、撓弱堿爛型（拉伯、港仲、絞叔胺妻）等（3）流弊動相雙柱膚抑制哲型：浮分離您陽離虎子，區(qū)一般查采用魔無機始酸如HC柔l，HN恥O3等；股分離示陰離倡子，團一般機采用Na祥OH、Na鈔HC古O3/N殘aC敞O3。單柱趁非抑帖制型積：分侵離陽艘離子老，用影低濃潑度的HC厚l，HN陰O3等；失分離扎陰離溜子，囑可用憶苯甲昏酸及澇其鹽記、酒彎石酸趙、檸妖檬酸扮等（4）影逮響保渣留值順的因惹素溶質(zhì)無機疑陰離銳子：壤與水駝合離猛子的匠半徑題有關洗，半蘋徑越消大，真保留喪值越夕大。遠還與燒離子最的價臺態(tài)有蓮關，構(gòu)價數(shù)林越高仇，保撈留越快強。有機凱陰離疫子：暗一元嫁脂肪特酸<一元革芳香稿酸<二元南脂肪匪酸<二元尚芳香在酸，宵并于Pk續(xù)a有關陽離捐子：掩與價竭數(shù)及堡分子歌大小埋有關固定伍相：選擇忠性的排改變聚主要膀通過紡固定喚相來衛(wèi)實現(xiàn)偷。選認擇性兩與固打定相安的組沈成（單如交緞聯(lián)度私）、根交換惱基團狹的結(jié)漿構(gòu)、矮位置誕都有坐關。流動滴相的宜組成房誠：組成睡不同飼，保薦留和諸選擇輕性不旁同。流動檢相的倘濃度亡：濃度淚高，k下降化，由冊于下閃降幅淋度與顧離子勸電荷秒數(shù)有訂關，贏因此參用于讓改變莊一價擱離子毒和二韻價離乎子的耀選擇脖性流動互相的縣離子條強度淡：離子育強度瞎增加且，k下降流動纖相的pH：pH升高智，陽鋤離子蘿交換準色譜牲中，雙陽離吩子的嘆保留四值下給降；刮因離紗子交曲換色肌譜中匙，陰拌離子虜保留壓值增譽加有機咱調(diào)節(jié)錯劑：如甲儉醇、揮丁醇讀、乙河腈等凱。影源響選蜓擇性懂。注炮意與輕柱的邊匹配躬。（5）應晨用分析公無機蓬陰離側(cè)子的衰首選婆方法還可乒用于丑分析鴿無機修陽離稈子，歡有機塌酸、何堿，瀉糖類儲、蛋饅白質(zhì)項等。多聚蒼磷酸軌鹽的逢分析常見策陰離籠子分酷析5.體積邊排阻技色譜饑法（1）分離容原理以多用孔凝寺膠為陷固定描相，苦利用叨精確千控制崖的凝鑼膠孔綿徑，綢使樣吳品中鉗不同涉分子辮大小奪的組鍬分得恭以分濫離。用于圈分子粒大小鼓差大介于10絕%的樣購品。VR=V0+KD·Vp0<武KD<1增.0洗脫溉體積事在V0和V0+Vp之間鄙，峰鄉(xiāng)豐容量瘦有限微，10純-1娘2個峰GF湯C難(G涌el銹F述il節(jié)tr聯(lián)at準io老n移Ch赤ro句ma鞠to叼gr標ap移hy棟)使用碧水溶格液的鉛凝膠燙過濾濤色譜鬧法，轉(zhuǎn)用于芒分析凱多肽單、蛋烈白質(zhì)晶、核吳酸、始多糖霧等。GP槳C耽(G猾el龜P賊er翼me眨at浮io貝n膝Ch幕ro欣m(xù)a師to宅gr旺ap笨hy痛)使用境有機匆溶劑觸的凝垮膠滲害透色派譜法奮，用狹于高魯聚物砌（如惹聚乙叨烯、花聚氯出乙烯浸等）劉分子椒量的男測定駱。（2）固定相硬質(zhì)卷凝膠高交教聯(lián)度貧苯乙瞎烯、妙二乙子烯苯鑒共聚城物：凝膠遼滲透便色譜承法多孔閑球形杯硅膠：凝膠白過濾癢色譜晉法、猜凝膠恨滲透尋色譜姿法羥基冷化聚動醚多敬孔微枯球：版凝膠涂過濾稈色譜順法特性沖參數(shù)農(nóng)：滲透嗎極限賞，分孤離范辛圍，數(shù)固流蠶相比麥（凝渴膠孔頑體積Vp/顆粒燭間體廟積Vo），異柱效（3）流動相改善北分離毀主要錢通過企固定處相來璃實現(xiàn)渡。流動拾相的卸選擇枕原則啄是：能溶狀解樣旗品與凝復膠浸剩潤與檢間測器淘匹配粘度逗小如四巴氫呋附喃；俱緩沖籃溶液（4）應用豪（分吸子量鋒的測司定）（1）了困解分璃析對法象和棄分析嗽要求6.液相末色譜襖分離仇類型銹及條泄件選丑擇Wh面at料i皇s險th沿e暢sa哈mp染le疲?Co構(gòu)nc聞en叔tr討at房誠io業(yè)n反of眠t煤he宣i私nt嚼er輔es相te倚d訴co擾mp蛛on榮en宰