代謝工程與調(diào)控第五章

代謝工程與調(diào)控第五章第一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五目錄蛋白質(zhì)支架DNA支架RNA支架RNA干擾第二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五支架技術？？？第三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五代謝途徑的中間產(chǎn)物可能對宿主產(chǎn)生毒性，被競爭途徑消耗，或通過分泌丟失。解決這些問題的一個新興的策略是將合成途徑的酶組合成多酶復合物。多酶復合物在自然界中很常見，例如：由絲氨酸合成色氨酸的反應過程中，催化色氨酸合成的最后兩個步驟的酶可以形成復合物，中間產(chǎn)物吲哚通過一個通道由一個活性位點到達另一個。酶支架技術產(chǎn)生的背景第四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五αreaction由絲氨酸合成色氨酸絲氨酸

色氨酸

第五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五多酶復合物的晶體結(jié)構(gòu)多酶復合物形成一個分子內(nèi)通道，該疏水性通道連接α和β活性位點。中間產(chǎn)物吲哚，由α亞基產(chǎn)生(αreaction)，通過該疏水性通道，分子內(nèi)轉(zhuǎn)運到β亞基，與L-絲氨酸反應生成L-色氨酸(βreaction)中間產(chǎn)物吲哚是一個疏水性物質(zhì)，如果在反應過程中不加以引導，它可能會穿過細菌細胞膜而無法發(fā)揮作用。該通道可以防止吲哚在催化反應的過程中擴散到溶劑中。第六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五將合成途徑的酶組合成多酶復合物是將途經(jīng)中的酶共定位形成最優(yōu)比例的復合物，可以增加途徑代謝產(chǎn)物和酶的局部濃度，限制途徑中間體的積累，減少與其他細胞成分之間不必要反應的發(fā)生。將酶組合成復合物的一種方法是將催化連續(xù)反應的酶進行融合。酶-酶融合策略在某些情況下能夠增強途徑通量。但是其存在以下缺點：①不適用于包含超過兩個酶的途徑；②融合之后經(jīng)常會導致一個或者兩個酶活性的降低；③不能輕易地改變復合物中酶的比例。第七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五酶的合成支架技術為途徑中兩個或多個酶的共定位提供了新的方法。蛋白質(zhì)、DNA和RNA都可以作為支架用于酶復合物的形成。proteinscaffoldsRNAscaffoldsDNAscaffolds第八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五許多信號蛋白包含模塊化的蛋白質(zhì)相互作用域，可以特異性地與其他域或短肽結(jié)合。當這些域融合到其他蛋白的N端或者C端時，還可以保持結(jié)合功能。攜帶多個蛋白質(zhì)相互作用域的支架蛋白可以和帶有多肽配體標簽的酶相互作用，用于共定位途徑中連續(xù)的酶。蛋白質(zhì)支架及其應用原理優(yōu)點1.可用于兩個或多個酶的共定位2.只需要在每個酶上加一條短肽，因此蛋白質(zhì)支架技術對酶活性的影響要低很多3.通過改變蛋白支架上結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，可以控制不同酶的相對比例。第九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)支架的應用---甲羥戊酸的生物合成甲羥戊酸的生物合成途徑，由乙酰輔酶A生產(chǎn)甲羥戊酸，包括三個酶：乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(AtoB)羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)合成酶(HMGS)羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶(HMGR)HMGR甲羥戊酸的生物合成途徑圖解

DueberJE,WuGC,Nat.Biotechnol，2009,27:753-759.第十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五

三種酶的活性不同，存在HMGS和HMGR之間流量不平衡的問題，導致中間產(chǎn)物羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)的積累。HMG-CoA對宿主大腸桿菌細胞具有很強的毒性。蛋白質(zhì)支架第十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五通過蛋白質(zhì)支架將HMG-CoA這個中間產(chǎn)物的產(chǎn)生酶(HMGS)和消耗酶(HMGR)之間共定位。調(diào)節(jié)兩個酶的比例，使甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了10倍。通過另外一個支架分子將途經(jīng)的第一個酶(AtoB)引入到復合物中，使甲羥戊酸的產(chǎn)量較無蛋白支架的對照提高了77倍。

第十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五蛋白與蛋白的相互作用區(qū)域與配體來自于動物細胞SH3和PDZ域-----mouseGBD域----rat將其插入到大腸細胞中，設計調(diào)節(jié)機制蛋白支架上結(jié)構(gòu)域的數(shù)量直接控制酶的比例配體第十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五途徑中的限速酶是HMGR，需要增加羥甲戊二酰輔酶A到甲羥戊酸這一步的流量。HMGS的C端可以與不同數(shù)量的SH3配體結(jié)合，HMGR的N端可以與一個SH3配體結(jié)合，從而形成不同酶比例的酶復合物甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了10倍HMGS和HMGR的雙酶支架第十四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五AtoB以及HMGS和HMGR的三酶支架甲羥戊酸途徑中酶的表達由啟動子PTET控制，支架的表達由啟動子PBAD控制配體GBD、SH3、PDZ分別與AtoB、HMGS以及HMGR這三個酶結(jié)合，通過改變配體的數(shù)量(X、Y、Z)形成不同比例的多酶復合物第十五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五九個不同的多酶復合物表現(xiàn)出很大的差異，最終GBD1SH32PDZ2多酶復合物相比于無支架的酶，產(chǎn)量提高了77倍第十六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)支架的應用---葡糖二酸的合成該途徑中，限速步驟的酶是(Ino1)和肌醇氧化酶(MIOX)。MIOX可以被其底物肌醇激活。通過蛋白支架，增加了MIOX周圍肌醇的濃度，進而使葡糖二酸產(chǎn)量提高5倍第十七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五DNA之間可以通過雜交進行結(jié)合，DNA和蛋白質(zhì)之間可以通過鋅指DNA結(jié)合域?qū)崿F(xiàn)相互作用DNA支架及其應用原理優(yōu)缺點優(yōu)點：可以通過控制DNA支架的結(jié)構(gòu)從而控制多酶復合物中酶與酶之間的距離缺點：將寡核苷酸共價結(jié)合到酶上以及組裝DNA納米結(jié)構(gòu)，操作煩瑣，使該策略難以實際應用第十八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五DNA支架應用---用于GOx和HRPGOx與HRP共作用反應機理ABST-為顯色物質(zhì)2--+H202HWilnerOI,WeizmannY,Nat.Nanotechnol.,2009,4:249-254第十九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五組裝的DNA納米結(jié)構(gòu)，由單條的核苷酸鏈組成，每條鏈預先設計好互補序列，通過雜交可以形成六邊形結(jié)構(gòu)。剩余的10個堿基相當于一個鉸鏈，可以使得DNA支架與生物大分子結(jié)合。(注意：將此結(jié)構(gòu)描述成六邊形是為了闡明DNA自主裝結(jié)構(gòu)的形式，實際情況下，該結(jié)構(gòu)會發(fā)生扭曲，但由于雜交，它們保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)）60base+10base

90base+10baseDNA支架的結(jié)構(gòu)第二十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五酶與DNA支架結(jié)合通過賴氨酸殘基與DNA寡核苷酸共價交聯(lián)第二十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五分別以兩個六面體和四個六面體的DNA結(jié)構(gòu)作為葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶的DNA支架當酶的間距由從4個六面體(約33nm)縮短到2個六面體(約13nm)，產(chǎn)物的產(chǎn)量有了顯著的增加。原因：距離遠使得生成的H2O2擴散到體系中，導致HRP活性位點周圍的H2O2濃度較低，從而最終產(chǎn)量低第二十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五DNA支架需要與生物大分子結(jié)合，設計時應注意使支架的結(jié)構(gòu)靈活，穩(wěn)定性較低，以避免其對生物大分子的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而影響生物大分子的催化作用設計DNA支架時需注意的問題第二十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五RNA支架及其應用原理優(yōu)缺點在RNA結(jié)構(gòu)模塊中包含蛋白質(zhì)的適配體域，用于結(jié)合需要共定位的蛋白優(yōu)點：可根據(jù)需要將RNA支架聚合成一維支架或者二維支架。缺點：RNA結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定，設計結(jié)構(gòu)時較為復雜，操作繁瑣第二十四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五RNA支架可合成一維或者二維的RNA支架，將酶定位在支架上RNA支架應用---氫酶和鐵氧還蛋白的共定位DelebecqueCJ,LindnerAB,Science,2011,333:470-474.第二十五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五

RNA支架(D0)結(jié)構(gòu)模塊中包含PP7和MS2適配體域用于結(jié)合PP7(氫酶)和MS2(鐵氧化還原蛋白)

RNA與蛋白結(jié)合原理圖第二十六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五RNA結(jié)構(gòu)中包含二聚區(qū)域(DD)和多聚區(qū)域(PD)，為了防止回文序列的倒塌多聚區(qū)域分子內(nèi)折疊，形成具有保護功能的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)與DD區(qū)域重疊，阻止序列倒塌，之后自組裝形成功能區(qū)域。構(gòu)建一維及二維RNA支架的“磚”第二十七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五將帶有兩個蛋白適配體域的RNA支架與組裝結(jié)構(gòu)結(jié)合，自組裝之后形成納米管最終形成一維RNA支架先將帶一個蛋白適配體域的結(jié)構(gòu)進行自組裝，再加入帶另一個蛋白適配體域的結(jié)構(gòu)，再進行自組裝，最終形成二維RNA支架RNA支架的形成第二十八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五熒光互補實驗表明，二維RNA支架在細胞中形成穩(wěn)定的約100nm的球形結(jié)構(gòu)，使融合蛋白能夠近距離聚集。利用RNA支架進行氫酶和鐵氧化還原蛋白的共定位，使氫氣產(chǎn)量提高了約48倍第二十九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五RNA干擾第三十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五RNAinterference的發(fā)現(xiàn)早在1990年，Jorgensen等在研究如何增加矮牽?；ǖ念伾珪r，觀察到一種無法解釋的現(xiàn)象：通過添加過量色素基因拷貝來增加植物花的著色，結(jié)果事與愿違，不但花未著色，反而部分花變?yōu)榘咨?。進一步的試驗表明，這些導入的基因不僅不表達，反而使植物本身的基因表達也受到了抑制，即所謂的共抑制第三十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五法爾和梅洛則首次在線蟲身上揭示，基因“沉默”的原因在于RNA干擾。實際上，法爾在接受諾貝爾獎網(wǎng)站采訪時提到，第一個在線蟲中觀察到(RNA干擾)這種特別現(xiàn)象的是康奈爾大學研究生郭蘇?！?995年，從復旦大學畢業(yè)后赴美的郭蘇在坎菲斯(Kenneth

Kemphues)指導下，試圖阻斷秀麗新小桿線蟲的某個基因時，意外地發(fā)現(xiàn)反義和正義這兩種單鏈RNA都阻斷了該基因的表達。√1998年，卡耐基研究院AndrewFire的研究證明，在正義RNA也阻斷了基因表達的試驗中，真正起作用的是微量雙鏈RNA（污染）。是體外轉(zhuǎn)錄正義RNA時生成的。這種雙鏈RNA對基因表達的阻斷作用被稱為RNA干擾。（RNAinterference,RNAi）。第三十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五可惜的是，郭蘇和坎菲斯一直沒能解釋這個奇怪現(xiàn)象。直到3年后，法爾和梅洛才揭開了謎底：在郭蘇的實驗中，體外轉(zhuǎn)錄所得RNA污染了微量的雙鏈RNA，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA能夠高效率地阻斷相應基因的表達。這就是RNA干擾。

郭蘇后來到加州大學舊金山分校（UCSF）任職。她說：“他們在我們工作的基礎上，解釋了我們那個讓人迷惑的現(xiàn)象，是一個飛躍……我和坎菲斯通過話，我們的工作在這個獎項中有所貢獻，我們?yōu)榇烁械阶院?，也都認為安德魯·法爾和克雷格理應獲獎?！眴⑹荆涸趯嶒灂r，要認真觀察每個現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)懷疑并給予證明，不要被誤導。第三十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五RNAi現(xiàn)象的普遍性RNAi現(xiàn)象廣泛存在于線蟲，果蠅，斑馬魚，真菌以及植物等生物體內(nèi)，這些生物體利用RNAi來抵御病毒的感染，阻斷轉(zhuǎn)座子的作用。第三十四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五RNA干擾的機理第三十五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五參與RNAi反應的酶Dicer酶：是RNA酶Ⅲ家族的一個成員。RNA酶Ⅲ是一種能切割雙鏈RNA的酶。Dicer酶參與RNAi反應，廣泛存在于蠕蟲，果蠅，真菌，植物及哺乳動物。結(jié)構(gòu)中包括一個螺旋酶結(jié)構(gòu)域，兩個RNA酶Ⅲ結(jié)構(gòu)域，一個雙鏈RNA結(jié)合位點。Dicer酶的作用下，雙鏈RNA被裂解成21到23個核苷酸的片斷，稱為siRNA（shortinterferenceRNA），它啟動了細胞內(nèi)的RNAi反應。RdRP：細胞內(nèi)存在RNAi效應的擴增系統(tǒng)。能以RNA為模板指導RNA合成的聚合酶（RNA-directedRNApolymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，進入細胞內(nèi)的雙鏈RNA通過類似于PCR的反應過程，呈指數(shù)級的數(shù)量擴增Dicer第三十六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五RNA誘導的沉默復合體(RISC)在RNA干擾機制中，雙鏈RNA誘導同源RNA降解的過程依賴于RNA誘導的沉默復合體的活性。RISC由Dicer酶，Argonaute蛋白，siRNA等多種生物大分子裝配而成。RISC中的Dicer具有RNAaseш結(jié)構(gòu)域，在RNAi的起始階段負責催化siRNA的產(chǎn)生，在RISC裝配過程中起穩(wěn)定RISC中間體結(jié)構(gòu)和功能的作用；Argonaute蛋白是RISC中的核心蛋白，有PAZ和PIWI兩個主要的結(jié)構(gòu)域，前者為siRNA的傳遞提供結(jié)合位點，后者是RISC中的酶切割活性中心；siRNA是RISC完成特異性切割作用的向?qū)?，在成熟的RISC中雖然只包含siRNA一條鏈，但siRNA在RISC形成過程中的雙鏈結(jié)構(gòu)是保證RNAi效應的決定因素。第三十七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五RNAi的反應過程

1.雙鏈RNA進入細胞后，Dicer酶的作用下被裂解成siRNA；

2.在RdRP的作用下自身擴增后，再被Dicer酶裂解成siRNA；

3.SiRNA的雙鏈解開變成單鏈，并和某些蛋白形成復合物，同與siRNA互補的mRNA結(jié)合，一方面使mRNA被RNA酶降解，另一方面以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈。4.結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過這個聚合酶鏈式反應，細胞內(nèi)的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達的抑制。第三十八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五RNAi的應用RNA干擾作為一種簡單快速、特異、高效、經(jīng)濟、效果可預測的技術，具有明顯的優(yōu)勢，它比反義核酸優(yōu)越，比基因敲除簡單，具有很好的應用前景，具體可用于以下幾個方面：1.基因功能分析2.研究信號傳導通路的新途徑3.新藥物的研究與開發(fā)4.基因治療5.其他應用RNA干擾技術自被發(fā)現(xiàn)以來在不斷地發(fā)展中，由繁變簡，近年來一些RNA干擾技術被應用于代謝工程中，并取得了一定的成果……第三十九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五1真核體系中的RNA干擾23最先發(fā)現(xiàn)的RNA干擾機制，但因其機制較為復雜，過程中涉及到酶及復合體等，設計實驗運用到實際中較為繁瑣，有一定的操作困難需要蛋白輔助的RNA干擾不需蛋白輔助的RNA干擾sRNA需要在蛋白的幫助下，與靶標mRNA結(jié)合，輔助的蛋白可以提高sRNA與靶標mRNA的雜交效率、穩(wěn)定sRNA、促進靶標mRNA的降解。設計實驗及操作較為簡單sRNA不需要蛋白的幫助就可以與靶標mRNA結(jié)合，整個干擾機制較為簡單，設計簡便，操作相對較為容易第四十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五sRNA應用在代謝工程中的應用示意圖a.篩選抑制效果最好的菌株及sRNA組合b.通過調(diào)整代謝流量提高產(chǎn)量第四十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五優(yōu)點1.較高特異性：能夠非常特異地降解與之序列相應的單個內(nèi)源基因的mRNA。2.高效性：相對少量的dsRNA就可以使相應的基因表達受抑制。3.可遺傳性及遠距離效應：RNAi基因表達的效應可以突破細胞的界限，可傳遞給子一代。4.對細胞的有害性?。褐苯忧贸承┗蚩赡軙е录毎Щ?，用RNA干擾可避免這種情況第四十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五在大腸桿菌中使用小RNA干擾基因的表達

---需要蛋白的輔助Solomon,K.V.,Sanders,,2012.Metab.Eng.14,661–671.在Hfq蛋白的幫助下，sRNA與mRNA結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄第四十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五sRNA質(zhì)粒庫的構(gòu)建a.模板質(zhì)粒中插入表達組件(啟動子、支架序列、轉(zhuǎn)錄終止序列)b.選擇sRNA與目的基因結(jié)合序列及設計引物c.通過定向位點突變PCR，插入選擇的靶標結(jié)合位點d.轉(zhuǎn)入大腸桿菌中e.通過序列分析，確認合成的sRNAsf.sRNA質(zhì)粒庫構(gòu)建完成第四十四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五應用a.篩選菌株b.篩選基因靶標c.優(yōu)化和控制代謝流量d.遺傳和代謝電路的調(diào)控第四十五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五應用實例

-----在大腸桿菌中通過利用sRNA抑制翻譯提高產(chǎn)物產(chǎn)量Na,D.,Yoo,S.M.,Chung,Nat.Biotechnol.31,170–174sRNA在Hfq蛋白的幫助下與mRNA結(jié)合，mRNA不能與核糖體結(jié)合，從而抑制翻譯第四十六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五合成的sRNA的結(jié)構(gòu)大部分sRNAs由兩部分功能序列組成：結(jié)合靶標mRNA的序列和支架序列(E.coli中大部分sRNAs中都有一個二級結(jié)構(gòu),為招募Hfq蛋白提供支架Hfq蛋白可以提高sRNA與靶標mRNA的雜交效率、穩(wěn)定sRNA、促進靶標mRNA的降解)？？結(jié)合能越低，結(jié)合越穩(wěn)定，抑制效果越好第四十七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五支架的篩選101個已知的sRNAs，篩掉：靶向結(jié)合序列未鑒定的Hfq蛋白結(jié)合序列未鑒定或者缺失的靶向不唯一的最終篩選出三個符合標準的sRNAsC--空白對照，無sRNA-不帶結(jié)合靶標mRNA序列的支架+帶結(jié)合靶標mRNA序列的支架最終篩選出最優(yōu)的支架MicC第四十八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五不同結(jié)合區(qū)域與抑制效果的關系結(jié)合區(qū)域的選擇：1.靶標mRNA的翻譯起始位點(TIR)范圍內(nèi)：從SD序列到下游20-30個核苷酸全部結(jié)合部分結(jié)合2.靶標mRNA的翻譯起始位點(TIR)范圍外抑制效果最好的D1、D2，抑制效率能達到90%以上翻譯起始位點（TIR）第四十九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五具體實例一：運用sRNA干擾策略在E.coli中提高酪氨酸產(chǎn)量綠色---過表達基因紅色---sRNA抑制的靶標大腸桿菌中Hfq蛋白輔助的RNA干擾第五十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒4、3-4、1-4、2-4、及質(zhì)粒2的兩個突變體與質(zhì)粒4組合，分別導入14株不同的菌中，篩選出產(chǎn)量最高的最優(yōu)組合產(chǎn)量最高的是S17-1與質(zhì)粒1-4的組合質(zhì)粒1:可編碼帶anti-csrA序列的sRNA的質(zhì)粒質(zhì)粒2:可編碼帶anti-pgi序列的sRNA的質(zhì)粒質(zhì)粒3:可編碼帶anti-ppc序列的sRNA的質(zhì)粒質(zhì)粒4:可編碼帶anti-tyrR序列的sRNA的質(zhì)粒第五十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五具體實例二：運用sRNA干擾策略在E.coli中提高1.5戊二胺的產(chǎn)量紅色代表候選靶基因運用sRNA對候選靶基因進行抑制，產(chǎn)量最高的是對murE進行抑制的體系第五十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五在大腸桿菌中使用小RNA干擾基因的表達

---不需要蛋白的輔助YapingYang,YuhengLin，MetabolicEngineering29(2015)217–226莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以增加反義RNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，該結(jié)構(gòu)與靶標mRNA結(jié)合，阻止其與核糖體結(jié)合，達到干擾基因表達的效果(mRNA的翻譯起始區(qū)，包括RBS和起始密碼子被認為是最理想的靶標)第五十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期五asRNA的環(huán)的長度與干擾效率的關系研究了四種不同長度環(huán)的asRNA(100,150,200and300nt)與干擾效率的關系1.

PT---空白對照，只有支架沒有環(huán)pZE