微生物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一 微生物培養(yǎng)基的制備方法

------------------------------------------------------------------------微生物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一微生物培養(yǎng)基的制備方法實(shí)驗(yàn)一微生物培養(yǎng)基的制備方法培養(yǎng)基(medium)培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。任何培養(yǎng)基中均需含有微生物所必需的能源、碳源、氮源、礦質(zhì)元素、水和生長(zhǎng)因素，但不同營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型、不同種類(lèi)的微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的要求又有很大差異。目前已使用的各種培養(yǎng)基都是前人經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)踐，比較設(shè)計(jì)的成果。

二、培養(yǎng)基的基本成分

●能源、碳源：自養(yǎng)微生物以二氧化碳為碳源，光或無(wú)機(jī)物為能源，在無(wú)機(jī)物組成的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。例如化能自養(yǎng)型的氧化硫桿菌培養(yǎng)基中，加入粉末狀硫?yàn)槟茉矗钥諝庵械腃O2為碳源。異養(yǎng)微生物以有機(jī)物為碳源和能源，培養(yǎng)基中常需加入葡萄糖、蔗糖或麥芽糖、乳糖等單糖或雙糖，有的可利用淀粉、纖維素等多糖，或利用動(dòng)物組織中的糖類(lèi)。例如培養(yǎng)細(xì)菌常用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其中牛肉膏即為主要碳源和能源?！竦矗鹤责B(yǎng)微生物以含氮無(wú)機(jī)物銨鹽、硝酸鹽等為氮素營(yíng)養(yǎng)，例如氧化硫桿菌以(NH4)2SO4為氮源；異養(yǎng)微生物以無(wú)機(jī)物銨鹽、硝酸鹽或含氮有機(jī)物為氮源。自生固氮菌利用空氣中的N2為氮素營(yíng)養(yǎng)，其培養(yǎng)基中無(wú)須加入氮源，稱(chēng)為無(wú)氮培養(yǎng)基。

●礦質(zhì)元素、生長(zhǎng)因子：微生物生長(zhǎng)繁殖需要P、K、Na、S、Mg、Ca等主要礦質(zhì)元素以及Fe、Cu等微量元素，因此培養(yǎng)基中常加入K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、KCl、FeSO4等無(wú)機(jī)鹽類(lèi)；生長(zhǎng)因子主要是調(diào)節(jié)微生物代謝活動(dòng)的B族維生素，常由酵母膏、肝浸出液等提供。許多天然成分的原料如牛肉膏、麥芽汁、玉米粉、豆芽汁等，含有各種無(wú)機(jī)元素和生長(zhǎng)因子，不需另外添加。

三、培養(yǎng)基的類(lèi)型根據(jù)原料來(lái)源不同，可將培養(yǎng)基分為合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基與天然培養(yǎng)基。

●合成培養(yǎng)基：由化學(xué)成分已知的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物配制而成。成分精確，重復(fù)性強(qiáng)。但營(yíng)養(yǎng)局限，微生物生長(zhǎng)緩慢。適用于菌種分離、選育、遺傳分析及生物測(cè)定等。如培養(yǎng)放線(xiàn)菌的高氏培養(yǎng)基、培養(yǎng)霉菌的察氏培養(yǎng)基以及各種化能自養(yǎng)菌培養(yǎng)基等。

●半合成培養(yǎng)基：由某些天然物質(zhì)與少量已知成分的化學(xué)物質(zhì)配制而成。營(yíng)養(yǎng)全面，能有效地滿(mǎn)足微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求。廣泛應(yīng)用于微生物的培養(yǎng)。如培養(yǎng)細(xì)菌用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)霉菌的土豆葡萄糖培養(yǎng)基，工業(yè)生產(chǎn)中常用的玉米粉等天然物質(zhì)加無(wú)機(jī)鹽配制的各種發(fā)酵培養(yǎng)基等。

●天然培養(yǎng)基：由化學(xué)成分不清楚或不衡定的天然有機(jī)物配制而成。成分復(fù)雜，但營(yíng)養(yǎng)豐富全面。常用于實(shí)驗(yàn)研究和生產(chǎn)。如麥芽汁培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基，以及生產(chǎn)中使用的麩皮、鋸末等。

四、培養(yǎng)基的形態(tài)

根據(jù)培養(yǎng)基的物理性質(zhì)，可分為液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。

●液體培養(yǎng)基：用各種營(yíng)養(yǎng)成分加水配成，或用天然物質(zhì)的浸汁(麥芽汁、豆芽汁等)制成。組分均一，適宜各類(lèi)微生物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。主要用于增菌培養(yǎng)，觀察細(xì)菌不同的生長(zhǎng)現(xiàn)象以及檢測(cè)細(xì)菌的生化特性以供鑒別之用。

●固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑，或用麩皮等固體原料配制。常用的凝固劑是瓊脂(又稱(chēng)瓊膠、洋菜)，由石花菜等海藻中提取加工制成。市售瓊脂為條狀、片狀或粉末狀，主要成分為多聚半乳糖的硫酸酯，絕大多數(shù)微生物不能將其分解，在培養(yǎng)基中僅起支撐作用。其熔點(diǎn)約98℃，凝固點(diǎn)42℃，1.5～2％的水溶液在一般培養(yǎng)溫度下呈凝膠狀態(tài)。瓊脂固體培養(yǎng)基廣泛應(yīng)用于微生物的分離培養(yǎng)、菌種鑒定和保藏。

●半固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入0.2～0.5％瓊脂制成。用于觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、菌種鑒定及測(cè)定噬菌體的效價(jià)等。

五、培養(yǎng)基的種類(lèi)根據(jù)培養(yǎng)基的用途，可分為選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基等。

●選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某一類(lèi)或某種微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，用于提高所需微生物的分離效率。如分離固氮微生物的無(wú)氮培養(yǎng)基、加入濾紙條或纖維素粉為碳源分離纖維分解菌的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入某種化合物，可有效地分離出對(duì)這種化合物有抗性的微生物，例如在放線(xiàn)菌培養(yǎng)基中加入數(shù)滴10％的酚，可抑制細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)；加入一定量的青霉素、鏈霉素，可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)等。

●鑒別培養(yǎng)基：根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑，通過(guò)顯色反應(yīng)以鑒別不同的微生物。例如檢查乳制品和飲用水中是否有腸道細(xì)菌污染所用的伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基。當(dāng)大腸桿菌等腸道細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳糖，使加入的伊紅-美藍(lán)變色，在菌落上沉積為紫黑色，并呈現(xiàn)金屬光澤。

●加富培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某些特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促使某種特殊性能的微生物迅速生長(zhǎng)，有利從混合菌群中分離出所需種類(lèi)微生物。如為分離能夠利用石蠟的微生物，常在培養(yǎng)基中加入石蠟作為碳源。

六、培養(yǎng)基的制備方法（常規(guī)方法，如配方中有特殊規(guī)定或要求，以配方為依據(jù)）根據(jù)配方，計(jì)算各種營(yíng)養(yǎng)成分用量。一般藥品可用普通藥物天平稱(chēng)量，用量少的藥品，可按比例配成高濃度溶液，再按所需量用移液管吸取。稱(chēng)好的藥品放入玻璃燒杯中。

2.在另一容器中將所需量的水(一般可用自來(lái)水，有特殊要求時(shí)需用蒸餾水)加熱，取全量的1/3左右倒入放藥品的容器中，用玻璃棒攪拌，待藥品全溶后，再將其余熱水全部倒入。若配制固體培養(yǎng)基，則稱(chēng)取1.5～2％的瓊脂放入已溶化的營(yíng)養(yǎng)液中，繼續(xù)加熱至瓊脂全部溶解。加熱中隨時(shí)攪拌，防止溢出或糊底。燒糊的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)破壞，并產(chǎn)生有毒物質(zhì)，不宜再用。

4.待溶化的培養(yǎng)基稍冷卻后，按配方要求調(diào)整pH值。先取10毫升培養(yǎng)基裝入試管中，用pH試紙測(cè)其自然pH，再用1％NaOH(或1％HCl)調(diào)至所需pH，根據(jù)用量計(jì)算，換用10％NaOH(或10％HCl)調(diào)整所配全量培養(yǎng)基的pH。加堿(或酸)溶液時(shí)，應(yīng)邊滴加邊攪拌，至應(yīng)加量將近用完時(shí)，再次測(cè)試，最后調(diào)至要求的pH值。

5.配好的培養(yǎng)基，根據(jù)需要趁熱分裝至試管或錐形瓶中。分裝需用漏斗，以免瓊脂粘在管口或瓶口上。裝瓶量一般為瓶容量的1/3～1/2；裝試管一般為試管高度的1/5～1/4，以免滅菌時(shí)培養(yǎng)基上溢，粘濕棉塞。

6.用預(yù)先制好的棉塞塞住管口或瓶口。棉塞既有利于通氣，又有濾菌作用，故松緊、大小應(yīng)適當(dāng)，以免使用時(shí)影響操作。

最后用牛皮紙或報(bào)紙包住棉塞，扎緊在瓶頸或試管上方，以免滅菌時(shí)水蒸汽沾濕棉塞或脫落。

7.滅菌后取出的固體培養(yǎng)基，根據(jù)需要可將試管立即斜放，冷凝后即成斜面培養(yǎng)基，用于菌種擴(kuò)大培養(yǎng)及保藏；錐形瓶中的培養(yǎng)基，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，冷凝后即制成平板培養(yǎng)基，可用于菌種的分離、鑒定等。液體培養(yǎng)基冷卻后可直接根據(jù)需要接入菌種。七、高壓蒸汽滅菌這種滅菌方法是基于水的沸點(diǎn)隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計(jì)的。當(dāng)蒸汽壓力達(dá)到1.05kg/cm2時(shí)，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15～30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌。操作方法和注意事項(xiàng)打開(kāi)滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線(xiàn)。立式消毒鍋?zhàn)詈糜靡阎箝_(kāi)過(guò)的水，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。注意水要加夠，防止滅菌過(guò)程中干鍋。2、滅菌材料放入器皿內(nèi)，注意間隔，不能擺的太緊。材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。3、根據(jù)滅菌材料的要求，設(shè)置相應(yīng)的壓力和滅菌時(shí)間。注意事項(xiàng)：使用高壓蒸氣滅菌器時(shí)，首先應(yīng)注意在開(kāi)放蒸氣的同時(shí)，排除滅菌器內(nèi)的冷空氣。必須將器內(nèi)冷空氣全部排除后，才可關(guān)閉排氣孔。假如滅菌器內(nèi)仍存留有部分空氣時(shí)，剛壓力表上雖已達(dá)到了某一壓力值，但器內(nèi)之溫度仍未達(dá)到相應(yīng)之度數(shù)。存留的空氣越多，剛二者相差也越大。差也越大，器內(nèi)溫度不足，滅菌則不徹底。表蒸汽壓力與溫度的關(guān)系蒸汽壓力（kPa）密度（kg/cm2）溫度（℃）34.480.35210955.160.56311368.950.703115103.431.055121137.901.406126

表高壓蒸汽滅菌器中溫度與冷空氣排出量的關(guān)系

蒸汽壓力（kPa）所達(dá)溫度（℃）冷空氣完全排除2/3排除1/2排除1/3排除全未排除34.4810910