抗氯霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備及篩選

抗氯霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備及篩選【摘要】目的獲得穩(wěn)定、高效分泌抗氯霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。方法以CAPHSBSA免疫BALB/c小鼠，用細(xì)胞融合技術(shù)篩選抗氯霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，體內(nèi)誘生腹水法大量制備單抗。捕獲ELISA法測定小鼠免疫球蛋白亞型，間接ELISA法測定腹水效價(jià)；用兩步硫酸銨法和G蛋白親和層析法來純化腹水。結(jié)果成功建立了一株分泌抗CAP單克隆抗體(McAb)的雜交瘤細(xì)胞4D10。經(jīng)檢測,其分泌的抗體亞類為IgG1,雜交瘤染色體數(shù)目90～110條,間接ELISA檢測誘生小鼠腹水的抗體效價(jià)達(dá)1∶×105，純度達(dá)95%，該細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)生物學(xué)性狀穩(wěn)定。結(jié)論成功制備的抗氯霉素單克隆抗體4D10效價(jià)高、純度高，為利用該單抗研制檢測氯霉素殘留試劑盒提供原材料。

【關(guān)鍵詞】氯霉素；細(xì)胞融合；單克隆抗體；間接ELISA

Abstract:ObjectiveToacquirestableandsecretorymonoclonalantibodiesagainstchloramphenicolhybridomacelllines.MethodsBALB/cmicewereimmunizedwithCAPHSBSAandhybridomalinessecretingmonoclonalantibodyagainstchloramphenicol(CAPMcAb)werescreenedbycellfusion,andtheimmunologicaltitersofCAPMcAbweredetermined.CaptureELISAmethodwasusedtodetermineisotypesofthemousemonoclonalantibodyandtheindirectELISAmethodwasperformedtodeterminethetitersofMcAbs.TwostepammoniumsulfateprecipitationandprotnGaffinitychromatographyprotnpurificationmethodswereusedtopurifyascites.ResultsOnehybridomacelllinesecretingCAPMcAb4D10wasestablished.ThetiterofpurifiedMcAb4D10was1∶×105,andthepuritywas95%.ConclusionTheantichloramphenicolMcAb4D10preparedhadhightiterandhighpurity,anditcouldbeusedtodevelopCAPimmunoassaykitfordetectionofCAPresidues.

Keywords:chloramphenicol；cellfusion；monoclonalantibody；indirectELISA

氯霉素﹙chloramphenicol，CAP﹚一種人工合成的廣譜抗生素，因其效價(jià)高，價(jià)格低廉而廣泛用于畜牧業(yè)，成為畜禽疾病防治的重要藥物。但氯霉素在肉、蛋、奶中即使是微量的殘留也會(huì)對人類的健康造成直接或潛在的威脅，如能抑制人體骨髓造血功能、引起人再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥、新生兒和早產(chǎn)兒灰色綜合征等疾?。?］。因此氯霉素殘留問題已經(jīng)引起國際和世界上許多國家和地區(qū)的高度重視。美國最早規(guī)定不允許在家禽飼養(yǎng)中使用CAP,出售的家禽必須做CAP殘留檢測。在我國，2002年部第235號(hào)公告《動(dòng)物源性食品中獸藥最高殘留限量》中明確規(guī)定氯霉素禁止使用，在動(dòng)物性食品中不得檢出。所以，建立檢測動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留的分析方法具有重要意義［2］。

到目前為止，國內(nèi)外用于氯霉素殘留檢測的方法已近十幾種，其中主要有微生物法、儀器分析法和免疫分析法［3］。免疫分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。免疫反應(yīng)具有很高的選擇性和靈敏性，因此，免疫分析技術(shù)無論作為獸藥殘留分析的檢測手段還是樣本凈化方法都能使分析過程特別是前處理步驟大大簡化。目前使用最普遍的酶聯(lián)免疫法(ELISA)，具有操作簡便、靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度和分析成本低的優(yōu)點(diǎn)，是目前最理想的殘留篩選性分析方法之一［1］。本實(shí)驗(yàn)擬采用雜交瘤技術(shù)制備并篩選出能穩(wěn)定、高效分泌抗氯霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為開發(fā)氯霉素ELISA試劑盒提供特異性材料。

1材料與方法

材料

BALB/c小鼠購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK20030002；昆明小鼠購自廣州市白云區(qū)穗北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠；免疫抗原CAPHSBSA，檢測抗原CAPHSOVA由本實(shí)驗(yàn)室合成［4］。小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品；Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞株購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫。CAP、弗氏佐劑CFA、IFA、細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640、HAT、HT為Gibco公司產(chǎn)品；酶標(biāo)二抗羊抗鼠IgG為Santa進(jìn)口分裝產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)、AR級試劑。

方法

動(dòng)物免疫

取8～10周齡雄性BALB/c小鼠，將CAPHSBSA與等體積的弗氏完全佐劑乳化，皮下注射，劑量為100μg/只，以后每隔2周加強(qiáng)免疫1次，改用弗氏不完全佐劑，腹腔注射。融合前3天強(qiáng)化免疫1次，不用佐劑，但劑量加倍。

細(xì)胞融合

按常規(guī)方法操作，操作流程參考文獻(xiàn)［5］。

雜交瘤細(xì)胞篩選及克隆化培養(yǎng)

當(dāng)融合后的細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)上清用間接ELISA法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞篩選，選擇陽性強(qiáng)、細(xì)胞生長旺盛孔的細(xì)胞，用有限稀釋法進(jìn)行克隆，而后擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存并進(jìn)行鑒定。

雜交瘤細(xì)胞染色體的計(jì)數(shù)

方法參照文獻(xiàn)［5］。

CAPMcAb的制備及效價(jià)測定

采用體內(nèi)誘生腹水法進(jìn)行。取8～10周齡雄性BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟,0.5mL/只,1個(gè)星期后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1～2×106個(gè)/只,10d后視小鼠腹水生長情況，抽取腹水,離心取上清,間接ELISA法測定效價(jià),以A值大于陰性的倍的稀釋比例的倒數(shù)即為該抗體效價(jià)，-20℃凍存腹水。

McAb的純化及亞類鑒定

將收集的小鼠腹水用硫酸銨鹽析法和G蛋白層析法進(jìn)行純化。按小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書操作進(jìn)行單抗亞類鑒定。

2結(jié)果

雜交瘤細(xì)胞的篩選

細(xì)胞融合后5～6d，可見有單克隆細(xì)胞集落，用間接ELISA方法測定培養(yǎng)上清的效價(jià)，選取一株效價(jià)高又能被CAP強(qiáng)抑制的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)4次克隆后，克隆陽性率達(dá)100%。擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)凍存、復(fù)蘇后仍能穩(wěn)定分泌抗體。將該細(xì)胞株命名為4D10。

雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性測定

將凍存的4D10細(xì)胞株復(fù)蘇后，測定其培養(yǎng)上清的效價(jià)。結(jié)果顯示，經(jīng)凍存、復(fù)蘇后該雜交瘤細(xì)胞仍能穩(wěn)定分泌抗體，結(jié)果見表1。表1雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性測定

雜交瘤細(xì)胞染色體分析

正常小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目為40條，小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0為62～68條，4D10細(xì)胞株染色體條數(shù)為90～110，說明4D10為雜交瘤細(xì)胞(見1)。

單克隆抗體小鼠抗體亞類鑒定

以捕獲ELISA法測定雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，結(jié)果顯示4D10為IgG1亞型

。表2單克隆抗體亞類鑒定

單克隆抗體分子量測定

電泳結(jié)果如圖2所示。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白Maker各條帶為標(biāo)準(zhǔn)，利用凝膠成像分析系統(tǒng)對抗體重鏈與輕鏈進(jìn)行了相關(guān)分析。從泳道可看出，單抗的重鏈位于kD與kD之間，輕鏈位于kD與kD之間，根據(jù)分子量與遷移率的線性關(guān)系，求出4D10重鏈分子量為54kD，輕鏈分子量為23kD，故單抗4D10的分子量約為154kD。

單克隆抗體純度測定

從圖3可看出4D10的純化效果。硫酸銨鹽析法之后仍殘留較多的雜蛋白，經(jīng)過親和層析后的4D10基本已無雜蛋白，經(jīng)過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，4D10純度可達(dá)95%，腹水純化后蛋白濃度為mg/mL，可用于研制檢測氯霉素殘留試劑盒。

單克隆抗體效價(jià)測定

純化后抗體效價(jià)結(jié)果如表3所示。4D10原腹水效價(jià)為1∶×106，經(jīng)過硫酸銨沉淀以后效價(jià)下降了一個(gè)滴度為1∶×105，G蛋白親和層析以后再下降了一個(gè)滴度為1∶×105，總體來說抗體的活性還是保持良好的。表3單克隆抗體效價(jià)測定(略)

3討論

免疫分析方法作為一種特殊的分析技術(shù),近幾年來在獸藥、農(nóng)藥等小分子化合物的殘留分析中的越來越廣泛。而抗體是免疫分析技術(shù)中的試劑,其質(zhì)量好壞是影響檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化的一個(gè)重要因素。McAb由于本身所具備的優(yōu)勢，如特異強(qiáng)、質(zhì)量易于控制、易于標(biāo)準(zhǔn)化等，所以與普通抗血清相比，在藥物殘留的免疫分析中有著更廣闊的應(yīng)用前景［6］。

在CAP單抗制備過程中，因?yàn)镃AP是一種半抗原，本身不具備免疫原性，所以需要將其與大分子載體物質(zhì)相偶聯(lián)成完全抗原，免疫動(dòng)物時(shí)才能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)用CAPHSBSA免疫小鼠，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。篩選雜交瘤細(xì)胞時(shí)，用CAPHSOVA包被酶標(biāo)板，這樣可以在第一步就能排除大量的針對CAPHSBSA中的載體分子BSA抗體的雜交瘤。

克隆化的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過凍存后，有可能會(huì)出現(xiàn)分泌抗體能力下降甚至喪失的情況出現(xiàn)，因此克隆出來的細(xì)胞必須經(jīng)過連續(xù)培養(yǎng)并經(jīng)多次凍存、復(fù)蘇后仍能穩(wěn)定分泌抗體的才能確定為建株成功。本實(shí)驗(yàn)制備的4D10細(xì)胞經(jīng)多次凍存、復(fù)蘇后，仍保持穩(wěn)定分泌抗體的能力，說明該株細(xì)胞在凍存復(fù)蘇過程中并沒有丟失其分泌抗體的能力，復(fù)蘇后仍能分泌高效價(jià)抗體。

本實(shí)驗(yàn)使用捕獲ELISA法進(jìn)行4D10抗體亞類的測定，結(jié)果示4D10抗體亞類為IgG1。經(jīng)采用兩步硫酸銨法粗純及G蛋白親和層析純化后，得到純度高達(dá)95%的抗體，比王穎等制備的抗氯霉素單克隆抗體的純度高［7］。純化后效價(jià)為1∶×105比原腹水效價(jià)降低了2個(gè)滴度，但仍保持較高的效價(jià)。本實(shí)驗(yàn)成功制備出一株抗氯霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株4D10，該細(xì)胞株能高效、穩(wěn)定分泌抗體，下一步將對該抗體的特異性、親和力等相關(guān)性質(zhì)做進(jìn)一步研究，為利用該抗體制備氯霉素檢測試劑盒做準(zhǔn)備。

【參考文獻(xiàn)】

［1］張宇.氯霉素在動(dòng)物體內(nèi)的殘留與檢測［J］.論壇，2007，1：68．

［2］何佳琪，段振娟，張燕，等.氯霉素殘留ELISA檢測方法［J］.中國獸醫(yī)雜志，2008，44(2)：88-89．

［3］宋巍巍，柴春彥，劉國艷，等．動(dòng)物性食品中殘留氯霉素檢測方法的研究進(jìn)展［J］.畜牧與獸醫(yī)，2007，39：54-56．

［4］