淺論壓力超負荷對大鼠心肌高能磷酸鹽代謝的影響

淺論壓力超負荷對大鼠心肌高能磷酸鹽代謝的影響【摘要】目的探討壓力超負荷大鼠肥厚心肌高能磷酸鹽含量及分布變化的特點。方法成年雄性SD大鼠行腹主動脈縮窄術，術后5周及15周觀察大鼠血流動力學參數(shù)、心室重構指標，密度梯度法提取大鼠心肌線粒體，高效液相色譜法測量心肌組織及心肌線粒體高能磷酸鹽含量。結果大鼠腹主動脈縮窄術后5周出現(xiàn)左心室肥厚，術后15周加重并有心功能減退；CAA5周組與CAA15周組心肌組織ATP、ADP、AMP及總腺苷酸池含量均降低，且CAA15周組心肌PCr降低，其總腺苷酸池及ATP含量低于CAA5周組；CAA15周組線粒體內(nèi)ATP、ADP、AMP及總腺苷酸池含量降低。結論壓力超負荷可影響心肌高能磷酸鹽的含量和分布，肥厚心肌組織能量消耗增多且能量產(chǎn)生及儲備均不足，可能是心肌發(fā)生肥厚及心功能異常的機制之一。

【關鍵詞】心室肥厚線粒體高能磷酸鹽大鼠

Abstract:ObjectiveToexploretheeffectsofpressureoverloadonhighenergyphosphatescontentanditsdistributionofleftventricularhypertrophyinrats.MethodsMaleSDratswererandomizedinto4groups：coarctationofabdominalaorta5weekgroup(CAA5group)，15weekgroup(CAA15group)andshamoperationgroup(SH5,SH15group).Thehemodynamicsandventriclarremodelingparametersweremeasured.Ventricleofheartwereremovedandmitochondriawereisolatedbycentrifugation.Thesizeofadenineacidpool(ATP,ADP,AMP)andcreatinephosphoricacid(PCr)inmyocardiumandmitochondriaweremeasuredbyhighperformanceliquidchromatography(HPLC).ResultsLeftventricularhypertrophywasobservedinoperativegroup.Comparedtoshamoperationgroup,ATPandcontentofadenineacidpooldecreasedsignificantlyinmyocardiumbothinCAA5groupandCAA15groupaswellasPCrdecreasedsignificantlyinmyocardiuminCAA15group.ATPandcontentofadenineacidpoolinmitochondriadecreasedsignificantlyinCAA15group.ConclusionMyocardialhighenergyphosphatescontentanditsdistributionderangedduringpressureoverloadinrat.Thesefindingssuggestedthatimbalanceofenergygenerationandutilizationmightplayacriticalroleinhypertrophyanddisfunctionofheart.

Keywords:ventricularhypertrophy;mitochondria;highenergyphosphates;rat

心肌肥厚是心力衰竭發(fā)展、猝死、心肌梗死等心血管事件發(fā)生的重要危險因素。心臟是高耗能的器官，代謝率高，高能磷酸鹽是心肌細胞生命活動可以直接利用的能源，心肌的收縮有賴于ATP和肌酸磷酸(PCr)水解所產(chǎn)生的能量。已有研究證明梗死后重構心肌能量產(chǎn)生不當可能是心力衰竭發(fā)生及發(fā)展的重要因素［1］。但對于壓力超負荷后肥厚心肌高能磷酸鹽含量和分布的改變卻少有報道，因此研究心肌能量代謝狀態(tài)的變化，有助于揭示壓力超負荷時心功能障礙的機制，對改善肥厚心肌的心功能，預防心力衰竭等心血管惡性事件的發(fā)生具有重要意義。

1材料與方法

試劑與儀器

Epaverlab電生理記錄儀(Powerlab/85P，澳大利亞生產(chǎn))；牛血清白蛋白(上海生工生物工程公司生產(chǎn))；epeddof低溫離心機(epeddof，德國生產(chǎn))；高壓液相色譜議(Waters，美國生產(chǎn))。

動物分組及動物模型建立

雄性成年健康SD系大鼠28只，11～14周齡，由大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，分為5組，每組7只。①腹主動脈縮窄組(coarctationofabdominalaortagroup，CAAgroup)：采用腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉后，打開腹腔、暴露左腎，距左腎動脈開口上方5mm處剝離腹主動脈，旁置一6號針(直徑)，一號絲線結扎后抽出針，使腹主動脈縮窄達65%～70%，術后常規(guī)抗感染3d，觀察5周(CAA5周)、15周(CAA15周)。②假手術組(shamoperationgroup，SH)：在腹主動脈相同部位穿線但不結扎血管，余同腹主動脈縮窄組，術后分別觀察5周(SH5周)、15周(SH15周)。③對照組：正常對照。所有動物自由飲食水。

指標測定及方法

心功能測定：術后觀察期滿，將各組大鼠麻醉滿意后，行右頸動脈插管，應用生理記錄儀記錄主動脈、左心室壓力曲線。測量左室舒張末壓(LVEDP)、平均主動脈壓(MAP)及左室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。完成壓力曲線記錄后立即取出心臟，稱取左心室(包括室間隔)重，以左心室重/體重作為相應的心肌肥厚指數(shù)(LVW/BW)。

提取心肌線粒體：采用高速離心蔗糖梯度離心法，參考Mariuaz等［2］的方法加以改進。在帶冰渣的線粒體分離介質(zhì)中充分剪碎心室肌組織，4℃條件下分離心肌線粒體，1h內(nèi)完成。線粒體蛋白質(zhì)濃度測定用Lowry‘s法。

心肌組織高能磷酸鹽含量測定［3-4］：新鮮心肌組織塊約100mg，迅速置于液氮中，然后放入預冷的HClO4中剪碎、勻漿。冰上放置5min破細胞膜。12000rpm、4℃離心20min。取上清200μL加入適量1mol/LK2CO3充分混和，調(diào)整體系pH值在～之間，于冰上放置5min。12,000r/min、4℃離心10min。取上清液20μL于高壓液相色譜儀分離并測定ATP、ADP、AMP及PCr含量，計算總腺苷酸池(ATP＋ADP＋AMP)大小，結果以nmol/mg組織表示。色譜條件：色譜柱hypersil18，5u，mm×250mm。流動相為/L磷酸鹽緩沖液()，流速/min，恒速洗脫。紫外檢測波長254nm，靈敏度。

心肌線粒體內(nèi)高能磷酸鹽含量測定：取新鮮制備的線粒體懸液100μL，加入100μL/LHClO4，于冰上放置5min破線粒體膜。其余步驟如上所述，行高壓液相色譜分析。單位為nmol/mg·pro。

統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)均以±s表示；統(tǒng)計學處理采用SPSS統(tǒng)計軟件的單因素方差分析，各組均值的多重比較采用FLSD法，以P＜為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

壓力超負荷大鼠心臟功能及心肌肥厚指數(shù)的改變

SH組大鼠各指標與對照l組比較無統(tǒng)計學意義。與同期SH相比，CAA15周及CAA5周組大鼠LVW/BW增加、MAP及LVEDP均增高(P＜)，其中CAA15周LVW/BW高于CAA5周組(P＜)；CAA15周組±dp/dtmax降低，(P＜)，且CAA15周-dp/dt低于CAA5周組(P＜)。見表1。

壓力超負荷大鼠心室肌組織高能磷酸鹽含量變化

SH組大鼠心室肌組織高能磷酸鹽含量與對照組比較無統(tǒng)計學意義。與同期SH組相比，CAA5周組與CAA15周組心肌組織內(nèi)ATP、ADP、AMP及總腺苷酸池含量均降低(P＜)；CAA15周組PCr較SH15周組降低(P＜)，同時其總腺苷酸池及ATP含量也低于CAA5周組(P＜，P＜)。見表2。表1大鼠心功能和心室重塑指標的改變(略)表2壓力超負荷大鼠心室肌組織高能磷酸鹽含量變化(略)

壓力超負荷大鼠心肌線粒體高能磷酸鹽含量變化

SH組大鼠心肌線粒體高能磷酸鹽含量與對照組比較無統(tǒng)計學意義。與同期SH組相比，CAA5周組大鼠心肌線粒體高能磷酸鹽含量無明顯改變(P＞)，CAA15周組線粒體ATP、ADP、AMP及總腺苷酸池含量均減低(P＜)，且低于CAA5周組(P＜，P＜)。見表3。表3壓力超負荷大鼠心肌線粒體高能磷酸鹽含量變化(略)

3討論

能量代謝是心肌細胞各種生理功能的重要基礎。心肌細胞內(nèi)的能源物質(zhì)包括腺苷酸、PCr以及其它高能磷酸化合物。ATP是細胞內(nèi)主要的高能磷酸載體，有3個磷酸基，通常磷酸基被分裂和轉移后生成ADP、AMP，ATP是可供應細胞利用的直接能源，直接用于心肌纖維收縮。PCr是心肌內(nèi)可被迅速動用的能量儲備，由ATP及肌酸在線粒體肌酸激酶(mito-CK)的正向催化下生成。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，在代償性心肌肥大及心衰時能量代謝受到影響，其心肌PCr含量降低，伴或不伴有ATP含量的降低［5-7］。Bunsw等也發(fā)現(xiàn)：在靜息狀態(tài)下肥厚心肌ATP含量、PCr及總肌酸含量下降［8］。本實驗結果表明：腹主動脈縮窄致壓力超負荷后5周出現(xiàn)左室心肌肥厚，MAP、LVEDP增高，左室壓最大上升和下降速率降低，術后15周上述指標進一步加重。同時，手術后5周及15周心肌組織內(nèi)ATP、ADP、AMP及總腺苷酸池含量均降低，且15周組總腺苷酸池及ATP含量較術后5周組進一步降低；術后15周時出現(xiàn)PCr含量降低。結果提示心肌高能磷酸化合物的降低是壓力超負荷時心肌肥厚及心功能障礙的直接原因。

線粒體是能量產(chǎn)生的重要場所。合成的ATP通過線粒體內(nèi)膜上的腺苷酸轉運體從線粒體輸出參與細胞的各種活動，同時胞質(zhì)中的ADP交換進入線粒體，或通過線粒體內(nèi)膜外側的mito-CK轉化為PCr后逸出線粒體。線粒體內(nèi)的ATP還供線粒體自身內(nèi)部需要，包括蛋白質(zhì)等生物大分子的合成、物質(zhì)進出線粒體的轉運耗能和內(nèi)部的化學反應等。本實驗發(fā)現(xiàn)：與同期假手術組相比，腹主動脈縮窄術后5周大鼠心肌線粒體高能磷酸鹽含量無顯著改變，術后15周時出現(xiàn)ATP、ADP、AMP及總腺苷酸池含量降低，且低于術后5周組。結果提示，在壓力超負荷后心肌肥厚早期，線粒體內(nèi)能量的生成和儲備未發(fā)生改變，但由于肥厚心肌作功增多，能量需求增加，因此出現(xiàn)心肌組織能量消耗增多，總腺苷酸池及ATP含量降低；隨心肌肥厚逐漸加重，至出現(xiàn)心功能減退的心肌肥厚后期(15周)，線粒體氧化磷酸化功能受損漸加重，線粒體內(nèi)ATP合成減少，雖然PCr未改變，但因耗能增多，導致心肌組織的ATP含量和能量儲備進一步降低。說明線粒體能量產(chǎn)生不足，而心肌組織能量需求增加在壓力超負荷后心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展及心功能減退的過程中起重要的作用。

肥厚心肌線粒體高能磷酸鹽含量減少的原因及具體機制尚不清楚?？赡芘c下列因素有關，包括腺苷酸前體的耗失，心肌細胞膜損傷致攝取能力降低，毛細血管與線粒體之間的彌散距離的變化等，可能與心肌細胞線粒體本身的產(chǎn)能機制及能量轉運的改變有關。

總之，壓力超負荷致心肌肥厚和心功能障礙，心肌能量供應和需求之間平衡關系的失調(diào)可能是心肌肥厚發(fā)生、發(fā)展及向心力衰竭轉變的重要因素。

【參考文獻】

［1］HugelS，HornM，RemkesH，etofcardiacfunctionandenergyreservebytheangiotensin-convertingenzymeinhibitorquinaprilduringpostmyocardialinfarctionremodelingintherat［J］.JCardiovascMagnReson，2001,3(3)：215-225.

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［3］SchonfeldP，Bohnensackchangesoftheadeninenucleotidetranslocationinratbrain［J］.BiochimBiophysActa，1995,1232(1-2)：75-80.

［4］SchonfeldP，SchildL，BohnensackoftheADP/ATPcarrierandexpansionofthemitochondrial(ATP+ADP)poolcontributetopostnatalmaturationoftheratheart［J］.EurJBiochem，1996，241(3)：895-900.

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