欖香烯聯(lián)合生物大分子合成抑制劑對Hca

欖香烯聯(lián)合生物大分子合成抑制劑對Hca【摘要】目的本實驗采用欖香烯與生物大分子合成抑制劑聯(lián)合處理小鼠肝癌細胞Hca-F，觀察腫瘤細胞增殖、凋亡和形態(tài)學(xué)的變化，探討抑制/干擾腫瘤細胞的DNA、RNA或蛋白質(zhì)合成對欖香烯抗瘤作用的影響，以期為判斷欖香烯作用的可能靶點提供線索與依據(jù)。方法將Hca-F肝癌細胞用欖香烯、吡柔比星、單獨和復(fù)合處理，設(shè)單獨瘤細胞為陰性對照。Hca-F細胞濃度均為1×106/ml，每個觀察時間點均設(shè)3支復(fù)管，用臺盼藍拒染法計算細胞存活率，在透射電鏡下觀察欖香烯與THP聯(lián)合處理對腫瘤細胞超微結(jié)構(gòu)的影響，用流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期。結(jié)果欖香烯聯(lián)合吡柔比星處理Hca-F比單獨使用兩種藥物的抑瘤率都高。結(jié)論本實驗所用生物大分子合成抑制劑不能阻斷欖香烯的抗瘤作用，提示欖香烯抗腫瘤作用對新的蛋白質(zhì)表達依賴性較低。結(jié)合欖香烯處理后瘤細胞形態(tài)學(xué)的變化，提示欖香烯可能作用于腫瘤細胞膜或細胞中的某些蛋白質(zhì)等而直接殺傷腫瘤靶細胞，使對欖香烯抗瘤作用靶點的認識又進了一步。本實驗結(jié)果表明欖香烯和THP合用可使抗癌作用增強，這對欖香烯聯(lián)合其他藥物治療腫瘤可能有一定參考意義。

【關(guān)鍵詞】欖香烯；抑制劑；肝細胞癌

Theeffectofelemenecombinedwithinhibitorsofmacromolecularsynthesisforhepaticcancer

【Abstract】ObjectiveInthisexperimentofHca-Fcells(amurinehepaticcellcarcinoma)weretreatedwithelemenecombinedwithinhibitorsofmacromolecularsynthesis，theirproliferation，survival，cellcycle，apoptosisandmorphologywereobserved.ToclarifytheinfluencesofinhibitionofDNA，RNAandproteinontheantitumoreffectsofelemeneandtofindthepossibletargetsiteofTheHca-Fcellsweresingledormingledtreatedwithelemene，aloneorcombinedwithTHP，theHca-Fcells(withouttreatment)wereusedtobethenegativecompare.TheendconsistenceofHca-Fcellsis1×106/ml，threetublesineverytimepoint.Tocalculatetheproportionofsurvivalwithtrypanblue，andobservetheimpactontheultrastructureofHca-FcellstreatedwithelemeneandTHPintransmissionelectronmicroscope，andexaminetheapoptosisandcellcyclesinflowcytometer.ResultsTheinhibitionrateofproliferationofHca-FtreatedwithelemeneandTHPwashigherthanthatofHca-FtreatedwithelemeneTheseresultsshowedthattheantitumoreffectsofelemenecouldnotabolishedbycombinedtreatmentorpretreatmentwiththeinhibitorsofDNA，RNA，proteinsynthesis，whichsuggestthattheantitumoreffectsofelemenemaybeindependentontheirsynthesis.CombinedusageofelemenewithTHPtocancertherapyisadvisable.

【Keywords】elemene；inhibitor；hepatocellularcarcinoma

欖香烯(elemene)是從中藥溫莪術(shù)揮發(fā)油中提取的抗癌有效成分，它是一種僅含碳氫(C15H24)，分子量只有204的小分子、脂溶性的倍半萜類化合物，此類物質(zhì)有抗癌活性屬我國首報［1］。動物實驗與臨床應(yīng)用均表明欖香烯的抗癌作用確切，而且不良反應(yīng)很低。我們過去的研究表明欖香烯處理除可抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡外，還能增強腫瘤細胞的免疫原性，欖香烯處理能增強腫瘤細胞膜HSP70的表達，用表達譜基因芯片技術(shù)的研究表明欖香烯處理引起基因表達譜的變化。過去對欖香烯抗癌作用機制的研究僅限于欖香烯對腫瘤細胞增殖、分化和凋亡、免疫原性等的影響，關(guān)于它的作用靶點及其信號傳導(dǎo)通路迄今研究很少。本實驗在上述研究的基礎(chǔ)上，采用欖香烯與生物大分子合成抑制劑聯(lián)合處理小鼠肝癌細胞Hca-F，觀察腫瘤細胞增殖、凋亡和形態(tài)學(xué)的變化，探討抑制或干擾腫瘤細胞的DNA、RNA或蛋白質(zhì)合成對欖香烯抗瘤作用的影響，以期為判斷欖香烯作用的可能靶點提供線索與依據(jù)。

1材料與方法

1．1動物Balb/c系小鼠，引自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥物研究所，由本室自行繁殖提供。

1．2瘤株小鼠腹水型肝癌H22的高淋巴道轉(zhuǎn)移亞系Hca-F［2］，由本校病理學(xué)教研室凌茂英教授贈送，本室常規(guī)傳代、保種。

主要藥品和試劑1%欖香烯注射液(elemene，大連市醫(yī)藥科學(xué)研究所)。吡柔比星(Pirarubicin，THP，深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。RPMI1640培養(yǎng)基。

Hca-F細胞懸液的制備將傳代保種的Hca-F腹水型肝癌細胞常規(guī)接種于小鼠腹腔，/只，收集第7～8天的腹水，HS液破除紅細胞，PBS洗3次，計活細胞數(shù)，用含20%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)細胞數(shù)至所需濃度。

Hca-F肝癌細胞的處理將Hca-F肝癌細胞用欖香烯、吡柔比星按本室常規(guī)方法單獨或復(fù)合處理，設(shè)單獨瘤細胞對照。Hca-F細胞濃度均為1×106/ml，每個觀察時間點均設(shè)3支復(fù)管，加入相應(yīng)的藥品，以臺盼藍拒染法于不同時間計數(shù)活細胞數(shù)，計算存活率。

單純欖香烯處理和欖香烯聯(lián)合THP處理對Hca-F增殖的影響用MTT法測其OD值。

欖香烯聯(lián)合THP處理對瘤細胞超微結(jié)構(gòu)的影響［3］Hca-F細胞用欖香烯、THP單一或復(fù)合處理，細胞濃度和處理方法同前，處理時間為1h，收細胞，用PBS洗3次，以%戊二醛固定，常規(guī)包埋制片，鈾—鉛雙染色，透射電鏡下觀察攝片。

細胞凋亡的檢測和細胞周期的測定細胞收集同前，用PBS洗3次，加入PI染色液染色30min。上機檢測，Cellquest軟件低速獲取。用軟件分析。

2實驗結(jié)果

欖香烯聯(lián)合THP處理對Hca-F存活的影響單純用欖香烯處理，Hca-F的存活率就明顯降低，在30min～1h的時間內(nèi)，細胞死亡率隨著藥物濃度增加而增加，單用THP處理，也可導(dǎo)致Hca-F細胞死亡、藍染，其細胞死亡率也隨著藥物濃度增加而增加，欖香烯聯(lián)合THP處理，腫瘤細胞死亡率可達100%。

表1欖香烯單獨或聯(lián)合THP處理對Hca-F細胞存活的影

欖香烯和THP聯(lián)合處理對Hca-F細胞周期與凋亡的影響實驗結(jié)果表明欖香烯與THP聯(lián)合處理對Hca-F細胞周期變化的影響及凋亡細胞百分率變化與單用THP相比也無明顯區(qū)別，欖香烯處理與不處理Hca-F對照組細胞各時相百分率及凋亡細胞百分率變化無明顯區(qū)別。

表2欖香烯聯(lián)合THP處理對Hca-F細胞周期與凋亡的影響

欖香烯聯(lián)合THP處理對Hca-F細胞形態(tài)學(xué)的影響見圖2。圖2可示：當欖香烯與THP聯(lián)合處理的腫瘤細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細胞核染色質(zhì)濃縮，核縮小，細胞腫脹破裂，細胞完整性受到明顯破壞，而單純用THP處理的30min內(nèi)大多數(shù)沒有明顯改變，受損細胞形態(tài)學(xué)變化不典型，偶可見到凋亡、壞死的細胞，但比率并不高。圖1A：對照組；B：欖香烯50μg/ml；C：THP10μmol/ml；

D：欖香烯50μg/ml聯(lián)合THP10μmol/ml對Hca-F細胞周期影響的流式細胞儀分析結(jié)果

圖1流式細胞儀分析結(jié)果

A：THP10μmol/ml；B：欖香烯50μg/ml聯(lián)合THP10μmol/ml；

C：對照組；D：欖香烯50μg/ml

圖2欖香烯聯(lián)合THP處理對后Hca-F細胞的形態(tài)學(xué)改變【摘要】目的本實驗采用欖香烯與生物大分子合成抑制劑聯(lián)合處理小鼠肝癌細胞Hca-F，觀察腫瘤細胞增殖、凋亡和形態(tài)學(xué)的變化，探討抑制/干擾腫瘤細胞的DNA、RNA或蛋白質(zhì)合成對欖香烯抗瘤作用的影響，以期為判斷欖香烯作用的可能靶點提供線索與依據(jù)。方法將Hca-F肝癌細胞用欖香烯、吡柔比星、單獨和復(fù)合處理，設(shè)單獨瘤細胞為陰性對照。Hca-F細胞濃度均為1×106/ml，每個觀察時間點均設(shè)3支復(fù)管，用臺盼藍拒染法計算細胞存活率，在透射電鏡下觀察欖香烯與THP聯(lián)合處理對腫瘤細胞超微結(jié)構(gòu)的影響，用流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期。結(jié)果欖香烯聯(lián)合吡柔比星處理Hca-F比單獨使用兩種藥物的抑瘤率都高。結(jié)論本實驗所用生物大分子合成抑制劑不能阻斷欖香烯的抗瘤作用，提示欖香烯抗腫瘤作用對新的蛋白質(zhì)表達依賴性較低。結(jié)合欖香烯處理后瘤細胞形態(tài)學(xué)的變化，提示欖香烯可能作用于腫瘤細胞膜或細胞中的某些蛋白質(zhì)等而直接殺傷腫瘤靶細胞，使對欖香烯抗瘤作用靶點的認識又進了一步。本實驗結(jié)果表明欖香烯和THP合用可使抗癌作用增強，這對欖香烯聯(lián)合其他藥物治療腫瘤可能有一定參考意義。

【關(guān)鍵詞】欖香烯；抑制劑；肝細胞癌

Theeffectofelemenecombinedwithinhibitorsofmacromolecularsynthesisforhepaticcancer

【Abstract】ObjectiveInthisexperimentofHca-Fcells(amurinehepaticcellcarcinoma)weretreatedwithelemenecombinedwithinhibitorsofmacromolecularsynthesis，theirproliferation，survival，cellcycle，apoptosisandmorphologywereobserved.ToclarifytheinfluencesofinhibitionofDNA，RNAandproteinontheantitumoreffectsofelemeneandtofindthepossibletargetsiteofTheHca-Fcellsweresingledormingledtreatedwithelemene，aloneorcombinedwithTHP，theHca-Fcells(withouttreatment)wereusedtobethenegativecompare.TheendconsistenceofHca-Fcellsis1×106/ml，threetublesineverytimepoint.Tocalculatetheproportionofsurvivalwithtrypanblue，andobservetheimpactontheultrastructureofHca-FcellstreatedwithelemeneandTHPintransmissionelectronmicroscope，andexaminetheapoptosisandcellcyclesinflowcytometer.ResultsTheinhibitionrateofproliferationofHca-FtreatedwithelemeneandTHPwashigherthanthatofHca-FtreatedwithelemeneTheseresultsshowedthattheantitumoreffectsofelemenecouldnotabolishedbycombinedtreatmentorpretreatmentwiththeinhibitorsofDNA，RNA，proteinsynthesis，whichsuggestthattheantitumoreffectsofelemenemaybeindependentontheirsynthesis.CombinedusageofelemenewithTHPtocancertherapyisadvisable.

【Keywords】elemene；inhibitor；hepatocellularcarcinoma

欖香烯(elemene)是從中藥溫莪術(shù)揮發(fā)油中提取的抗癌有效成分，它是一種僅含碳氫(C15H24)，分子量只有204的小分子、脂溶性的倍半萜類化合物，此類物質(zhì)有抗癌活性屬我國首報［1］。動物實驗與臨床應(yīng)用均表明欖香烯的抗癌作用確切，而且不良反應(yīng)很低。我們過去的研究表明欖香烯處理除可抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡外，還能增強腫瘤細胞的免疫原性，欖香烯處理能增強腫瘤細胞膜HSP70的表達，用表達譜基因芯片技術(shù)的研究表明欖香烯處理引起基因表達譜的變化。過去對欖香烯抗癌作用機制的研究僅限于欖香烯對腫瘤細胞增殖、分化和凋亡、免疫原性等的影響，關(guān)于它的作用靶點及其信號傳導(dǎo)通路迄今研究很少。本實驗在上述研究的基礎(chǔ)上，采用欖香烯與生物大分子合成抑制劑聯(lián)合處理小鼠肝癌細胞Hca-F，觀察腫瘤細胞增殖、凋亡和形態(tài)學(xué)的變化，探討抑制或干擾腫瘤細胞的DNA、RNA或蛋白質(zhì)合成對欖香烯抗瘤作用的影響，以期為判斷欖香烯作用的可能靶點提供線索與依據(jù)。

1材料與方法

1．1動物Balb/c系小鼠，引自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥物研究所，由本室自行繁殖提供。

1．2瘤株小鼠腹水型肝癌H22的高淋巴道轉(zhuǎn)移亞系Hca-F［2］，由本校病理學(xué)教研室凌茂英教授贈送，本室常規(guī)傳代、保種。

主要藥品和試劑1%欖香烯注射液(elemene，大連市醫(yī)藥科學(xué)研究所)。吡柔比星(Pirarubicin，THP，深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。RPMI1640培養(yǎng)基。

Hca-F細胞懸液的制備將傳代保種的Hca-F腹水型肝癌細胞常規(guī)接種于小鼠腹腔，/只，收集第7～8天的腹水，HS液破除紅細胞，PBS洗3次，計活細胞數(shù)，用含20%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)細胞數(shù)至所需濃度。

Hca-F肝癌細胞的處理將Hca-F肝癌細胞用欖香烯、吡柔比星按本室常規(guī)方法單獨或復(fù)合處理，設(shè)單獨瘤細胞對照。Hca-F細胞濃度均為1×106/ml，每個觀察時間點均設(shè)3支復(fù)管，加入相應(yīng)的藥品，以臺盼藍拒染法于不同時間計數(shù)活細胞數(shù)，計算存活率。

單純欖香烯處理和欖香烯聯(lián)合THP處理對Hca-F增殖的影響用MTT法測其OD值。

欖香烯聯(lián)合THP處理對瘤細胞超微結(jié)構(gòu)的影響［3］Hca-F細胞用欖香烯、THP單一或復(fù)合處理，細胞濃度和處理方法同前，處理時間為1h，收細胞，用PBS洗3次，以%戊二醛固定，常規(guī)包埋制片，鈾—鉛雙染色，透射電鏡下觀察攝片。

細胞凋亡的檢測和細胞