分子生物學(xué)課件

分子生物學(xué)課件第一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五基因操作(genemanipulation)基因工程(geneengineering)遺傳工程genecloningmolecularcloning基因操作的核心部分為重組DNA技術(shù)。RecombinationDNAtechnology第二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五基因工程與建筑工程生物反應(yīng)器3第三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五DNARecombination1定義：

對(duì)目的基因進(jìn)行體外重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使這個(gè)基因在受體細(xì)胞中復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的過程?？寺。╟lone）：n,無性繁殖系及其后代。基因完全相同;v,指從同一祖先產(chǎn)生這類同一的DNA分子群或細(xì)胞群的過程。

（Gene,cell,個(gè)體）20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的遺傳學(xué)的一個(gè)分支學(xué)科。第四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五理論上三大發(fā)現(xiàn)：Avery肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：

證實(shí)了遺傳物質(zhì)的本質(zhì)是DNA（1944年）Watson

和Crick：

提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（1953年）Nirenberg等：

確定了遺傳信息的傳遞方向（1961-1966年）

DNA

RNA蛋白質(zhì)第五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五技術(shù)上三大發(fā)明：工具酶：分子手術(shù)刀，切割與縫合基因，包括限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等，對(duì)DNA或RNA進(jìn)行各種各樣的修飾。

載體(vector,vehicle)：本意是媒介體，在基因工程上指能將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞的DNA分子。

逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscription,RT)：打破了中心法則，使真核基因制備成為可能，RT-PCR。

RNADNA第六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五genemanipulation過程1、目的基因的獲?。≒CR,genelibrary)；2、載體(vector)的選擇與構(gòu)建(工具酶等）；3、目的基因與載體連接，構(gòu)建重組DNA分子；4、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子篩選；5、受體細(xì)胞中目的基因的功能表達(dá)。第七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五基因工程的基本過程

分(合成)、切、連、轉(zhuǎn)、選、鑒第八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五重組DNA技術(shù)的意義打破了自然種的界限真核/原核生物間基因的交流對(duì)生物進(jìn)行定向改造基因治療（基因矯正/添加，RNAi）基因工程藥物（生長激素，細(xì)胞生長因子，重組疫苗等）第九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五組織纖溶酶原激活物（tissueplasminogenactivator，tPA）Oneexample---

10第十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五How？載體，工具酶第十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五基因操作的工具酶限制性內(nèi)切核酸酶(restrictionendonuclease)DNA聚合酶連接酶（Ligase）反轉(zhuǎn)錄酶(Reversetranscriptase)堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）末端轉(zhuǎn)移酶等第十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五1、限制性內(nèi)切酶定義：是一類能夠識(shí)別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶。EcoRI,HandIII,SalI第十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五命名：3-4個(gè)字母組成,方式是:屬名+種名+株名+序號(hào)第1字母（大寫）產(chǎn)生該酶細(xì)菌的屬名的第一字母；第2、3字母（小寫）細(xì)菌的種名；第4字母（大寫）細(xì)菌菌株名；羅馬數(shù)字代表該菌株中發(fā)現(xiàn)的第幾個(gè)酶。

EcoRI:Escherichiacoli

R

(大腸桿菌R株)14第十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五限制與修飾（Restriction-modification）細(xì)菌體內(nèi)存在限制和修飾系統(tǒng)（R-M）對(duì)自身的DNA進(jìn)行甲基化修飾，免受自己限制酶的分解，對(duì)外來的DNA通過限制性內(nèi)切酶降解，一般是指對(duì)外源DNA侵入的限制。應(yīng)用：正是對(duì)限制和修飾現(xiàn)象的深入研究，導(dǎo)致限制性內(nèi)切核酸酶的發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用甲基化處理保護(hù)免受限制性內(nèi)切酶降解第十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五分類

根據(jù)限制性內(nèi)切核酸酶的作用特點(diǎn)，分為三大類。第十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五I類限制性內(nèi)切核酸酶Ⅲ類限制性內(nèi)切核酸酶

第十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五是基因工程中最常用的酶，該類酶的分子量小，專一性強(qiáng),切割的方式有平切和交錯(cuò)切。Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶:18第十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列的長度：一般為4-8個(gè)堿基，最常見6個(gè)堿基。識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)：大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，切割位點(diǎn)在DNA兩條鏈相對(duì)稱的位置。

回文結(jié)構(gòu)：一條單鏈以中心軸對(duì)折可以形成互補(bǔ)的雙鏈。

第十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五

粘性末端（cohesiveend）--在DNA雙鏈的不同位置切割DNA，形成有單鏈突出的末端。

平末端（Bluntend）--在DNA雙鏈的相同位置切割DNA分子。

限制酶產(chǎn)生的末端：第二十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五常用的限制性內(nèi)切酶21第二十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五DNA連接酶（ligase）

作用：使DNA的3’羥基末端和5’磷酸末端形成3’-5’磷酸二酯鍵，將兩段DNA連接起來種類：T4DNAligase

（噬菌體來源）

E.coliDNAligase注意：連接DNA片段是否粘端；反應(yīng)溫度（16℃）和時(shí)間22第二十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五23第二十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五DNA聚合酶復(fù)制（DNAReplication）:

親代DNA雙鏈分子(D.SDNA)在DNA聚合酶的作用下，分別以每單鏈DNA分子(S.SDNA)為模板，聚合與自身堿基可以互補(bǔ)配對(duì)的游離的dNTP，合成兩條與親代分子完全相同的子代DNA分子的過程。24第二十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五DNA5’…ATGACTG…3’3’…TACTGAC…5’RNA5’…AUGACUG…3’轉(zhuǎn)錄：以S.SDNA為模板，在依賴DNA的RNA聚合酶的作用下….逆轉(zhuǎn)錄：….依賴RNA的DNA聚合酶…DNA聚合酶25第二十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五DNA聚合酶與DNA復(fù)制26第二十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五常用的DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ；E.coliDNApolymeraseⅠ的Klenow片段（Klenow酶）；耐熱DNA聚合酶；反轉(zhuǎn)錄酶27第二十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliDNApolymeraseⅠ）及其大片段（Klenow片段）35KD76KD枯草蛋白酶水解Klenow片段28第二十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌DNA聚合酶I的酶活性5‘-3’DNA聚合活性3‘-5’外切酶活性5‘-3’外切酶活性Klenow片段的酶活性5‘-3’DNA聚合酶活性3‘-5’外切酶活性29第二十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五主要用途:用切口平移法（nicktranslation）標(biāo)記DNA，制備探針。30第三十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五5‘-3’外切酶活性5‘-3’DNA聚合活性3‘-5’外切酶活性31第三十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五耐熱DNA聚合酶

TaqDNA酶是一類耐熱的DNA聚合酶。具有5’-3’聚合酶活性和5’-3‘外切酶活性多數(shù)Taq酶缺乏3’-5’外切酶活性，反應(yīng)溫度～70℃

PCR（polymersechainreaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))32第三十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五逆轉(zhuǎn)錄酶（ReverseTranscriptase）

催化以RNA為模板的聚合反應(yīng)，稱依賴RNA的DNA聚合酶。以mRNA為模板，催化合成出互補(bǔ)的DNA，稱為cDNA(complementaryDNA)；RT-PCR常見的逆轉(zhuǎn)錄酶:AMV:禽病毒來源反應(yīng)溫度42℃

MMLV:鼠來源病毒反應(yīng)溫度38℃

33第三十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五RT-PCR34第三十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）活性：催化dNTP加到3’羥基末端用途：制造人工粘端進(jìn)行末端標(biāo)記35第三十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五堿性磷酸酶alkalinephosphatase

作用：去除5’磷酸基團(tuán)，防止自身連接。種類：BAP-細(xì)菌性堿性磷酸酶

CIP-牛小腸堿性磷酸酶用途：基因克隆中防止載體自身環(huán)化

36第三十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五其它：多聚核苷酸激酶：提供磷酸基團(tuán)RNase-ribonucleaseDNase-deoxyribonuclaese37第三十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五基因操作的載體攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的運(yùn)載工具（vector）質(zhì)粒載體λ噬菌體(Lambdaphage)第三十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五克隆載體：目的基因的克隆、擴(kuò)增序列分析等表達(dá)載體（expressionvector）：表達(dá)外源基因,帶有啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及表達(dá)標(biāo)簽等。原核表達(dá)載體：E.coli真核表達(dá)載體：酵母，哺乳動(dòng)物，昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體39第三十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五腺苷脫氨酶(adenosinedeaminase,ADA)SevereCombinedImmunodeficiency,重癥聯(lián)合免疫缺陷40第四十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五載體的條件：1含有獨(dú)立自主復(fù)制起點(diǎn)，便于在宿主中擴(kuò)增；2一個(gè)或多個(gè)篩選標(biāo)記，如抗性基因-氨芐青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene,ampr)；表型的顯色反應(yīng)等。3多克隆位點(diǎn)，便于目的基因的克隆。4高拷貝，便于分離提純。第四十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五篩選標(biāo)記：

用來區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒。當(dāng)一個(gè)外源DNA片段插入到一個(gè)質(zhì)粒載體上時(shí)，可通過該標(biāo)記來篩選插入了外源片段的質(zhì)粒，即重組質(zhì)粒。

第四十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五篩選標(biāo)記：

當(dāng)一個(gè)外源DNA片段克隆到一個(gè)質(zhì)粒載體上時(shí)，可通過該標(biāo)記來篩選插入了外源片段的質(zhì)粒，即重組質(zhì)粒。用來區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒。

α-互補(bǔ)：（α-complementation）藍(lán)白斑篩選

第四十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五插入失活(pBR322)

該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標(biāo)記。當(dāng)外源DNA片段插入tetr基因后，導(dǎo)致tetr基因失活，變成只對(duì)氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過對(duì)抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。

第四十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五多克隆位點(diǎn)（MultipleCloningSite）是一段人工合成的DNA序列，含有密集排列的多種限制性酶切位點(diǎn)，以利于不同來源的外源DNA片段插入載體。第四十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒載體(plasmidvector)1.概念：細(xì)菌染色體以外的，能自主復(fù)制雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。其大小可從2-3kb到200kb（kilobase)左右，能夠在宿主內(nèi)利用宿主的酶系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制,賦予寄主一些新的遺傳性狀。

第四十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.質(zhì)粒載體分類質(zhì)粒拷貝數(shù)(plasmidcopynumbers)：

指細(xì)菌中質(zhì)粒的分子個(gè)數(shù),常用質(zhì)粒數(shù)/每染色體來表示。嚴(yán)緊型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒47第四十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)：

復(fù)制只受本身的遺傳結(jié)構(gòu)的控制，有較多的拷貝數(shù)。嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringentplasmid)：在寄主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制除了受本身復(fù)制機(jī)構(gòu)的控制外，還受染色體的嚴(yán)緊控制，因此拷貝數(shù)較少。第四十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五Example:pBR322質(zhì)粒

第四十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五pUC18/1950第五十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五噬菌體phagevector感染細(xì)菌的