化學(xué)微生物學(xué)第六章氨基酸谷發(fā)酵

化學(xué)微生物學(xué)第六章氨基酸谷發(fā)酵第一頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五氨基酸發(fā)酵第二頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五氨基酸簡(jiǎn)介氨基酸是構(gòu)成蛋白成分大約20種L-氨基酸構(gòu)成了數(shù)目龐大的各種肽類和蛋白質(zhì)，以及生命體。其中8種氨基酸是人體所必需，它們分別是L-賴氨酸、L-蘇氨政、L-異亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-亮氨酸和L-纈氨酸；另一方面，D-氨基酸也在細(xì)菌細(xì)胞壁、膚類抗生素和植物中發(fā)現(xiàn)。目前世界上可用發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸有20多種。

第三頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五氨基酸α碳原子分別以共價(jià)鍵連接氫原子、羧基和氨基及側(cè)鏈。側(cè)鏈不同，氨基酸的性質(zhì)不同。上述氨基酸結(jié)構(gòu)通式具有兩個(gè)特點(diǎn)：①具有酸性的一COOH和堿性的一NH2，為兩性電解質(zhì)；①如果R≠H，則具有不對(duì)稱碳原子，因此是光學(xué)活性物質(zhì)。甘氨酸(分子式中R＝H)無不對(duì)稱碳原子，因而無D-型及L-型之分，其余α-氨基酸的α-碳原子皆為不對(duì)稱碳，故都有D-型及L-型2種異構(gòu)體。氨基酸的D—?jiǎng)t或L別是以L-甘油醛或L-乳酸為參考的。凡α-位上的構(gòu)型與L-甘油醛(或L-乳酸)相同的氨基酸皆為L(zhǎng)-型，相反者為D-型。第四頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五氨基酸的用途1.食品工業(yè)：強(qiáng)化食品(賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸于小麥中)增鮮劑：谷氨酸單鈉和天冬氨酸苯丙氨酸與天冬氨酸可用于制造低熱量二肽甜味劑(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此產(chǎn)品1981年獲FDA批準(zhǔn),現(xiàn)在每年產(chǎn)量已達(dá)數(shù)萬噸。第五頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.飼料工業(yè)：甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造動(dòng)物飼料3.醫(yī)藥工業(yè)：多種復(fù)合氨基酸制劑可通過輸液治療營(yíng)養(yǎng)或代謝失調(diào)苯丙氨酸與氮芥子氣合成的苯丙氨酸氮芥子氣對(duì)骨髓腫瘤治療有效,且副作用低。4.化學(xué)工業(yè)：谷氨基鈉作洗滌劑,丙氨酸制造丙氨酸纖維。第六頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五氨基酸的生產(chǎn)方法發(fā)酵法：直接發(fā)酵法：野生菌株發(fā)酵、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵和營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株發(fā)酵。添加前體法第七頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五酶法：利用微生物細(xì)胞或微生物產(chǎn)生的酶來制造氨基酸。提取法：蛋白質(zhì)水解，從水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。傳統(tǒng)的提取法、酶法和化學(xué)合成法由于前體物的成本高,工藝復(fù)雜,難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的目的。第八頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五生產(chǎn)氨基酸的大國(guó)為日本和德國(guó)。日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國(guó)的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭。它們能生產(chǎn)高品質(zhì)的氨基酸,可直接用于輸液制劑的生產(chǎn)。日本在美國(guó)、法國(guó)等建立了合資的氨基酸生產(chǎn)廠家,生產(chǎn)氨基酸和天冬甜精等衍生物。第九頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五國(guó)內(nèi)生產(chǎn)氨基酸的廠家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前無論生產(chǎn)規(guī)模及產(chǎn)品質(zhì)量還難于與國(guó)外抗衡。在80年代中后期,我國(guó)從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿(mào)合作的方式引進(jìn)輸液制劑的制造技術(shù)和仿造產(chǎn)品,1991年銷售量為二千萬瓶,1996年達(dá)六千萬瓶,主要廠家有無錫華瑞,北京費(fèi)森尤斯,昆明康普萊特,但生產(chǎn)原料都依賴進(jìn)口。據(jù)專家估計(jì),到2000年,世界氨基酸產(chǎn)值可達(dá)45億美元,占生物技術(shù)市場(chǎng)的7%,國(guó)內(nèi)的氨基酸產(chǎn)值可達(dá)40億元,占全國(guó)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值的12%。第十頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)展的歷史回顧所謂氨基酸發(fā)酵,就是以糖類和銨鹽為主要原料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物,積累特定的氨基酸。這些方法成立的一個(gè)重要原因是使用選育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。第十一頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五菌株的育種從自然界中篩選有產(chǎn)酸能力的菌株,并建立其培養(yǎng)條件.在確立突變技術(shù)和闡明氨基酸生物合成系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上發(fā)展為營(yíng)養(yǎng)缺陷變異株、抗藥性菌株的育種。隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展,接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、細(xì)胞融合等手段首先用于體內(nèi)基因重組,是早期用基因重組方法構(gòu)建生產(chǎn)菌株的嘗試。隨著載體、受體系統(tǒng)的構(gòu)建及體外基因重組技術(shù)的日益完善,氨基酸生物工程菌的構(gòu)建有了長(zhǎng)足的發(fā)展。蘇氨酸等的生產(chǎn)菌株被成功地構(gòu)建并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。第十二頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.1用野生株的方法這是從自然界獲得的分離菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的一種方法。典型的例子就是谷氨酸發(fā)酵。改變培養(yǎng)條件的發(fā)酵轉(zhuǎn)換法中,有變化銨離子濃度、磷酸濃度，使谷氨酸轉(zhuǎn)向谷氨酰胺和纈氨酸發(fā)酵第十三頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.2用營(yíng)養(yǎng)缺陷變異株的方法這一方法是誘變出菌體內(nèi)氨基酸生物合成某步反應(yīng)阻遏的營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異體，使生物合成在中途停止，不讓最終產(chǎn)物起控制作用。這種方法中有用高絲氨酸缺陷株的賴氨酸發(fā)酵，有用精氨酸缺陷株的鳥氨酸發(fā)酵，還有用異亮氨酸缺陷株的脯氨酸發(fā)酵。第十四頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.3類似物抗性變異株的方法用一種與自己想獲得的氨基酸結(jié)構(gòu)相類似的化合物加入培養(yǎng)基內(nèi)，使其發(fā)生控制作用，從而抑制微生物的生長(zhǎng)。這樣，就可以得到在這種培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)的變異株，而這種變異株正是解除了調(diào)控機(jī)制的，能夠生成過量的氨基酸。利用此方法發(fā)酵的有:蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、組氨酸和精氨酸。第十五頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.4體內(nèi)及體外基因重組的方法基因工程包括細(xì)胞內(nèi)基因重組方法和試管內(nèi)的體外基因重組方法。體內(nèi)基因重組在應(yīng)用上又稱為雜交育種，主要方法包括：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞融合等，這都是在細(xì)胞內(nèi)暫時(shí)地產(chǎn)生染色體的局部二倍體，在兩條DNA鏈之間引起兩次以上的交叉，是遺傳性重組現(xiàn)象。細(xì)胞內(nèi)基因重組技術(shù)的缺點(diǎn)是，現(xiàn)在只在同種或有近緣關(guān)系的微生物之間進(jìn)行并較難成功。第十六頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五代謝工程在闡明代謝途徑及其調(diào)控規(guī)律的基礎(chǔ)上，應(yīng)用重組DNA技術(shù)可以改變代謝途徑分支點(diǎn)上的流量或引入新的代謝步驟與構(gòu)建新的代謝網(wǎng)絡(luò)。其主要步驟為:鑒定目標(biāo)代謝途徑涉及的酶(特別是限速酶);取得酶基因，必要時(shí)可用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，如定點(diǎn)誘變，基因剪接等，使蛋白具有新的特點(diǎn)(增強(qiáng)活性或穩(wěn)定性、解除反饋抑制等);將一種或多種異源的或改造后的酶基因與調(diào)節(jié)元件一起克隆進(jìn)目標(biāo)生物;使調(diào)節(jié)元件的作用及培育條件最優(yōu)化。第十七頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五氨基酸發(fā)酵的代謝控制控制發(fā)酵的條件控制細(xì)胞滲透性控制旁路代謝降低反饋?zhàn)饔梦锏臐舛认K產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用促進(jìn)ATP的積累，以利氨基酸的生物合成第十八頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五控制發(fā)酵的條件專性需氧菌，控制環(huán)境條件可改變代謝途徑和產(chǎn)物。第十九頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五控制細(xì)胞滲透性生物素、油酸和表面活性劑，引起細(xì)胞膜的脂肪酸成分的改變。青霉素：抑制細(xì)胞壁的合成，由于細(xì)胞面內(nèi)外的滲透壓而泄露出來。第二十頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五控制旁路代謝第二十一頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五降低反饋?zhàn)饔梦锏臐舛壤脿I(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株進(jìn)行氨基酸發(fā)酵必須限制所要求的氨基酸的量。限制精氨酸的濃度可解除反饋抑制，實(shí)現(xiàn)鳥氨酸的生物合成。第二十二頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用使用抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的方法。是一種與初級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似但缺乏生理功能的化合物。例1：黃色短桿菌AHVr突變株可解除Thr的反饋抑制而積累蘇氨酸第二十三頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

Brevibacteriumflavum(AK)第二十四頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五ThreonineAHV

a-Amino-b-hydroxyvalericacid

a-氨基-b-羥戊酸第二十五頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五篩選突變株中常用的幾種結(jié)構(gòu)類似物積累的物質(zhì)結(jié)構(gòu)類似物

Arg刀豆氨酸

Phe對(duì)-氟苯丙氨酸、噻恩基丙氨酸

Trp5-甲基色氨酸、6-甲基色氨酸

Vala-氨基丁酸鹽

IleValMeta-氨基-4-乙硫基丁酸腺嘌呤2,6-二氨基嘌呤尿嘧啶5-氟尿嘌呤第二十六頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五促進(jìn)ATP的積累，以利氨基酸的生物合成ATP的積累可促進(jìn)氨基酸的生物合成第二十七頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基pH溫度氧第二十八頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五培養(yǎng)基1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烴碳源濃度過高時(shí)，對(duì)菌體生長(zhǎng)不利，氨基酸的轉(zhuǎn)化率降低。菌種性質(zhì)、生產(chǎn)氨基酸種類和所采用的發(fā)酵操作決定碳源種類第二十九頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、氮源：銨鹽、尿素、氨水；同時(shí)調(diào)整pH值。營(yíng)養(yǎng)缺陷型添加適量氨基酸主要以添加有機(jī)氮源水解液。需生物素和氨基酸，以玉米漿作氮源。尿素滅菌時(shí)形成磷酸銨鎂鹽，須單獨(dú)滅菌?？煞峙骷?。氨水用pH自動(dòng)控制連續(xù)流加第三十頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五3、合適C/N氮源用于調(diào)整pH。合成菌體生成氨基酸，因此比一般微生物發(fā)酵的C/N高。第三十一頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五4、磷酸鹽：對(duì)發(fā)酵有顯著影響。不足時(shí)糖代謝受抑制。5、鎂：是已糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶和羧化酶的激活劑，并促進(jìn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力。6、鉀：促進(jìn)糖代謝。谷氨酸產(chǎn)酸期鉀多利于產(chǎn)酸，鉀少利于菌體生長(zhǎng)。第三十二頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五7、鈉：調(diào)節(jié)滲透壓作用，一般在調(diào)節(jié)pH值時(shí)加入。8、錳：是許多酶的激活劑。9、鐵：是細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過氧化氫酶的活性基的組成分，可促進(jìn)谷氨酸產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)。10、銅離子：對(duì)氨基酸發(fā)酵有明顯毒害作用。第三十三頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五生長(zhǎng)因子：生物素作用：影響細(xì)胞膜透性和代謝途徑。濃度：過多促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，氨基酸產(chǎn)量低。過少菌體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期長(zhǎng)。與其它培養(yǎng)條件的關(guān)系：氧供給不足，生物素過量時(shí)，發(fā)酵向其它途徑轉(zhuǎn)化。種類：玉米漿、麩皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜為來源。第三十四頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五pH對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及其控制作用機(jī)理：主要影響酶的活性和菌的代謝。控制pH方法：流加尿素和氨水流加方式：根據(jù)菌體生長(zhǎng)、pH變化、糖耗情況和發(fā)酵階段等因素決定。第三十五頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五控制：（1）菌體生長(zhǎng)或耗糖慢時(shí)，少量多次流加尿素，避免pH過高（2）菌體生長(zhǎng)或耗糖過快時(shí)，流加尿素可多些，以抑制菌體生長(zhǎng)。（3）發(fā)酵后期，殘?zhí)巧?，接近放罐時(shí)，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困難。（4）氨水對(duì)pH影響大，應(yīng)采取連續(xù)流加。第三十六頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五溫度對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及其控制菌體生長(zhǎng)達(dá)一定程度后再開始產(chǎn)生氨基酸，因此菌體生長(zhǎng)最適溫度和氨基酸合成的最適溫度是不同的。菌體生長(zhǎng)溫度過高，則菌體易衰老，pH高，糖耗慢，周期長(zhǎng)，酸產(chǎn)量低。采取措施：少量多次流加尿素，維持最適生長(zhǎng)溫度，減少風(fēng)量等，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。第三十七頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五氧對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及其控制要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸發(fā)酵：生物合成與TCA循環(huán)有關(guān)。適宜在缺氧條件下進(jìn)行的亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸發(fā)酵：菌體呼吸受阻時(shí)產(chǎn)量最大。供氧不足時(shí)產(chǎn)酸受輕微影響的天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵第三十八頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五谷氨酸生產(chǎn)工藝工業(yè)化生產(chǎn)開始于由水解小麥面筋或大豆蛋白質(zhì)而制取。1957年，日本率先采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，并投入大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，這是被譽(yù)為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的重大創(chuàng)舉，使發(fā)酵工業(yè)進(jìn)入調(diào)節(jié)代謝的調(diào)控階段。目前世界產(chǎn)谷氨酸鈉30噸/年，占氨基酸總量的2/3。我國(guó)現(xiàn)已有200余家生產(chǎn)，年產(chǎn)量達(dá)15萬噸，居世界首位。第三十九頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五產(chǎn)生菌株特點(diǎn)：革蘭氏陽(yáng)性不形成芽胞沒有鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)需要生物素作為生長(zhǎng)因子在通氣條件下才能產(chǎn)生谷氨酸。第四十頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五第四十一頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五谷氨酸生物合成機(jī)理及代謝控制谷氨酸生物合成機(jī)理：由三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脫氫酶和氫供體存在下進(jìn)行還原性氨化作用而得到。第四十二頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五三、谷氨酸的發(fā)酵第四十三頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五1.谷氨酸生產(chǎn)菌中存在2個(gè)糖酵解途徑EMP/HMP生物素參與糖代謝作用：增加糖代謝的速度而丙酮酸氧化脫羧的速度未改變丙酮酸積累乳酸積累2.α-酮戊二酸脫氫酶缺失TCA環(huán)阻斷，α-酮戊二酸積累第四十四頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五3.四碳二羧酸的來源Δ在生產(chǎn)菌中檢出CO2固定反應(yīng)酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和蘋果酸酶谷氨酸對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到81.7%ΔDCA循環(huán)標(biāo)志酶：異檸檬酸裂解酶在谷氨酸發(fā)酵中，DCA環(huán)一方面可以作為TCA循環(huán)有缺陷時(shí)C4二羧酸的補(bǔ)充在谷氨基酸生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)中提供能量作用谷氨酸生成期中要封閉DCA環(huán)？通過DCA環(huán)提供C4二羧酸時(shí)谷氨酸對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率僅為54.4%第四十五頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五TCA的補(bǔ)充途徑（DCA循環(huán)）

I乙醛酸循環(huán)（TCA循環(huán)支路）

（異檸檬酸裂合酶）（乙酰--CoA合成酶）（蘋果酸合成酶）乙酰-CoA異檸檬酸琥珀酸+乙醛酸乙酸蘋果酸第四十六頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五4.異檸檬酸脫氫酶活力強(qiáng)提供NADPH,用于還原α-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化還原共扼體系5.氨的導(dǎo)入合成谷氨酸的反應(yīng)有3種：α-酮戊二酸+NH4+NADPH+谷氨酸H2ONADP++谷氨酸脫氫酶α-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶谷氨酸α-酮戊二酸+α-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶第四十七頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五生產(chǎn)菌中谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活力低，轉(zhuǎn)氨作用可以不考慮谷氨酸合成酶由于不受高濃度谷氨酸抑制，其作用值得重視谷氨酸脫氫酶是合成積累谷氨酸的主要酶氨的導(dǎo)入時(shí)生物素缺乏，NH4+影響糖代謝速度：提高糖代謝速度高效合成谷氨酸生物素充足時(shí)，NH4+不影響糖代謝速度6.谷氨酸合成的調(diào)節(jié)機(jī)制谷aa比天冬aa優(yōu)先合成谷aa脫氫酶谷aa對(duì)其反饋抑制和反饋?zhàn)瓒魴幟仕岷铣擅窽CA的關(guān)鍵酶，受能荷調(diào)節(jié)，谷aa反饋?zhàn)瓒?，烏頭酸反饋抑制異檸檬酸脫氫酶α-酮戊二酸反饋抑制α-酮戊二酸脫氫酶先天喪失或微弱PEP受天冬aa反饋抑制，受谷aa和天冬aa反饋?zhàn)瓒舻谒氖隧?yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五7.細(xì)胞膜通透性控制第四十九頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五生物素阻斷脂肪酸的合成影響細(xì)胞膜的合成表面活性劑對(duì)生物素有拮抗阻斷脂肪酸的合成影響細(xì)胞膜的合成在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期添加青霉素抑制細(xì)胞壁合成細(xì)胞膜損傷甘油缺陷型磷脂的合成受阻影響細(xì)胞膜的合成油酸缺陷型阻斷不飽和脂肪酸的合成影響細(xì)胞膜的合成第五十頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

谷氨酸積累的理想途徑，應(yīng)具備：（1）一定的糖酵解速度，不能走向乳酸等的發(fā)酵。（2）生成丙酮酸后，一部分氧化脫羧生成乙酰CoA，一部分固定CO2生成草酰乙酸或蘋果酸，草酰乙酸與乙酰CoA在檸檬酸合成酶作催化作用下，縮合成檸檬酸，再經(jīng)下面的氧化還原共軛的氨基化反應(yīng)生成谷氨酸。（3）生成的乙酰CoA不向脂肪酸途徑轉(zhuǎn)化，全部趨于合成檸檬酸。第五十一頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（4）α-酮戊二酸氧化能力微弱，即不轉(zhuǎn)化為琥珀酸，而成為馬蹄形不完整的三羧酸環(huán)。（5）異檸檬酸裂解酶活性弱，即不形成二羧酸環(huán)。（6）異檸檬酸脫氫酶活性強(qiáng)。第五十二頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（7）L-谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng)，在NH3存在下，由α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為谷氨酸。（這點(diǎn)特別重要）（8）NADPH再氧化能力欠缺。谷氨酸菌有兩種該類酶，即異檸檬酸脫氫酶和L-谷氨酸脫氫酶。（9）造成強(qiáng)的細(xì)胞膜透性，以便克服終產(chǎn)物反饋抑制和阻遏，使生產(chǎn)菌產(chǎn)生的谷氨酸不斷地滲到細(xì)胞外進(jìn)入培養(yǎng)基中。第五十三頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五谷氨酸發(fā)酵過程一、淀粉水解糖的制備：酸水解或酶水解1、調(diào)漿：干淀粉用水調(diào)成10-11Bx的淀粉乳，加鹽酸0.5-0.8％至pH1.5。2、糖化：蒸汽加熱，加壓糖化25min。冷卻至80℃下中和。3、中和：燒堿中和，至pH4.0-5.04、脫色：活性炭脫色和脫色樹脂。活性炭用量為0.6-0.8％，在70度及酸性條件下攪拌后過濾。第五十四頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五酶法糖化：以大米或碎米為原料時(shí)采用大米進(jìn)行浸泡磨漿，再調(diào)成15Bx，調(diào)pH6.0，加細(xì)菌a-淀粉酶進(jìn)行液化，85℃30min，加糖化酶60℃糖化24h，過濾后可供配制培養(yǎng)基。第五十五頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五糖蜜原料：不宜直接用來作為谷氨酸發(fā)酵的碳源，因含豐富的生物素。預(yù)處理方法：活性碳或樹脂吸附法和亞硝酸法吸附或破壞生物素。也可以在發(fā)酵液中加入表面活性劑吐溫60或添加中青霉素。第五十六頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

二、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)1、斜面培養(yǎng)：主要產(chǎn)生菌是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬、節(jié)桿菌屬。我國(guó)各工廠目前使用的菌株主要是鈍齒棒桿菌和北京棒桿菌及各種誘變株。生長(zhǎng)特點(diǎn)：適用于糖質(zhì)原料，需氧，以生物素為生長(zhǎng)因子。斜面培養(yǎng)基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉組成的pH7.0-7.2瓊脂培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)18-24h。第五十七頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、一級(jí)種子培養(yǎng)：由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳組成。pH6.5-6.8。1000ml裝200-250ml振蕩，32℃培養(yǎng)12h。3、二級(jí)種子培養(yǎng)：用種子罐培養(yǎng)，料液量為發(fā)酵罐投料體積的1％，用水解糖代替葡萄糖，于32℃進(jìn)行通氣攪拌7-10h。種子質(zhì)量要求：二級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，無雜菌或噬菌體污染，菌體大小均一，呈單個(gè)或八字排列?；罹鷶?shù)為108-109/ml。第五十八頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五三、發(fā)酵1、適應(yīng)期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。措施：接種量和發(fā)酵條件控制使期縮短。2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急劇下降后維持在一定水平。菌體濃度迅速增大，菌體形態(tài)為排列整齊的八字形。不產(chǎn)酸。12h。措施：及時(shí)供給菌體生長(zhǎng)必須的氮源及調(diào)節(jié)pH，在pH7.5-8.0時(shí)流加尿素；維持溫度30-32℃第五十九頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五3、菌體生長(zhǎng)停止期：谷氨酸合成。措施：提供必須的氨及pH維持在7.2-7.4。大量通氣，控制溫度34-37℃。4、發(fā)酵后期：菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑?。措施：營(yíng)養(yǎng)物耗盡酸濃度不增加時(shí)，及時(shí)放罐。發(fā)酵周期一般為30h。第六十頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五谷氨酸發(fā)酵控制（1）生物素：作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA的輔酶，參與脂肪酸的生物合在，進(jìn)而影響磷酯的合成。當(dāng)磷酯含量減少到正常時(shí)的一半左右時(shí)，細(xì)胞發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內(nèi)滲出，積累于發(fā)酵液中。生物素過量，則發(fā)酵過程菌體大量繁殖，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，代謝產(chǎn)物中乳酸和琥珀酸明顯增多。第六十一頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五怎樣克服生物素過量帶來的問題為了控制生物素的數(shù)量，除了選用的菌種必須是生物素缺陷型以外，所用的原料（主要是玉米漿）每批都要通過搖床實(shí)測(cè)后確定加入量。當(dāng)前還有一些措施可以使用。第六十二頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五1、選用油酸缺陷型：在大量的研究工作中，發(fā)現(xiàn)了這樣的現(xiàn)象，即培養(yǎng)基中缺乏生物素時(shí)，只要加入油酸，就能起到和生物素相同的效果。如上所述，生物素的作用在于影響細(xì)胞膜中的脂肪酸，而油酸的加入直接增加了合成磷脂所需的不飽和脂肪酸，所以選育油酸缺陷型就成為了重要的替代手段。當(dāng)選用油酸缺陷型時(shí)，只要控制油酸的亞適量，就能控制細(xì)胞膜的透性，而與生物素的含量無關(guān)。第六十三頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、選用甘油缺陷型：試驗(yàn)證明，限量甘油（0.02%）培養(yǎng)，細(xì)胞膜的磷脂含量只有非甘油缺陷型菌株的50%。只有甘油的加入量起作用，而與生物素以及油酸的含量無關(guān)。這些現(xiàn)象都可以解釋一個(gè)問題，那就是因?yàn)榱字怯芍舅?、甘油、磷酸和R（膽堿、乙醇酸、絲氨酸、肌醇）4部分組成，缺少其中的一個(gè)都不可能和成，控制其中之一，都可以控制磷脂的含量。圖6-4第六十四頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五第六十五頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五3、溫度敏感性變異株：當(dāng)細(xì)菌進(jìn)行誘變處理后，可以獲得溫度敏感性變異株。例如在30゜C時(shí)生長(zhǎng)旺盛，而在較高溫度（37゜C

）則不生長(zhǎng)，或稍生長(zhǎng)，而能大量生成谷氨酸。于是可用這樣的變異株在富含生物素的培養(yǎng)基中，前期進(jìn)行30゜C培養(yǎng)，當(dāng)菌的生長(zhǎng)達(dá)到最大時(shí)，提高溫度至40゜C

，使其大量積累谷氨酸。第六十六頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五4、在生物素豐富的條件下，添加聚氧乙烯乙二醇的棕櫚酸（C18）、十七烷酸（C17）、硬脂酸（C16）等的飽和脂肪酸酯類或飽和脂肪酸，都能使大量谷氨酸排出于菌體外。表面活性劑、高級(jí)飽和脂肪酸的作用，不在于它的表面效果，而是在不飽和脂肪酸的合成過程中，作為抗代謝物具有抑制作用，對(duì)生物素或油酸又拮抗作用，阻遏脂肪酸生物合成，于是磷脂形成減少，膜透性加大，有利于谷氨酸向外滲漏。第六十七頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五5、在生物素豐富時(shí)，培養(yǎng)中途如果添加青霉素、頭孢霉素C，可以使谷氨酸生成。青霉素的作用機(jī)制與控制生物素、控制油酸或添加表面活性劑以及控制甘油的機(jī)制都不同。添加青霉素是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的后期合成，對(duì)細(xì)胞壁糖肽生物合成系統(tǒng)起作用。這是因?yàn)榍嗝顾厝〈铣商请牡牡孜锒兔傅幕钚灾行慕Y(jié)合，使網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)連接不起來，結(jié)果形成不完全的細(xì)胞壁。沒有細(xì)胞壁保護(hù)的細(xì)胞膜由于膜內(nèi)外的滲透壓差，是細(xì)胞膜受到機(jī)械損傷，失去了作為滲透障礙物的作用，從而使谷氨酸排出。另一種解釋是：青霉素雖不能抑制磷脂的合成，但能造成磷脂向胞外分泌。表6-5第六十八頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五第六十九頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（2）種齡和種量的控制一級(jí)種子控制在11-12h，二級(jí)控制在7-8h。種量為1％。過多，菌體嬌嫩，不強(qiáng)壯，提前衰老自溶，后期產(chǎn)酸量不高。第七十頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（3）pH。發(fā)酵前期，幼齡細(xì)胞對(duì)pH較敏感，pH過低，菌體生長(zhǎng)旺盛，營(yíng)養(yǎng)成分消耗大，轉(zhuǎn)入正常發(fā)酵慢，長(zhǎng)菌不長(zhǎng)酸。谷氨酸脫氫酶最適pH為7.0-7.2，轉(zhuǎn)氨酶最適pH7.2-7.4。在發(fā)酵中后期，保持pH不變。過高轉(zhuǎn)為谷氨酰胺，過低氨離子不足。第七十一頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

（4）溫度：谷氨酸菌的最適生長(zhǎng)溫度與產(chǎn)物生成所需溫度不同。發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)繁殖所需溫度為30～32゜C

。前期溫高，菌種容易衰老。后期是酶的作用溫度，要比前期高。菌體增殖到穩(wěn)定期，適當(dāng)提高溫度有利于產(chǎn)酸。因此，后期溫度可在３４～３６゜C

第七十二頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（5）通風(fēng)：不同種齡、種量，培養(yǎng)基成分，發(fā)酵階段及發(fā)酵罐大小要求通風(fēng)量不同。在長(zhǎng)菌體階段，通風(fēng)量過大，生物素缺乏，抑制菌體生長(zhǎng)。在發(fā)酵產(chǎn)酸階段，需要大量通風(fēng)供氧，以防過量生成乳酸和琥珀酸，但過大通風(fēng)，則大量積累a-酮戊二酸。第七十三頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

（6）氨：谷氨酸生產(chǎn)菌除利用氨作為氨源合成菌體蛋白脂外，大部分是生成谷氨酸所需。因此谷氨酸發(fā)酵中，加入的尿素等氨源比較大。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，當(dāng)Ｃ：Ｎ＝１００：０．５～２時(shí)，只合成菌體，幾乎不積累谷氨酸；當(dāng)Ｃ：Ｎ＝１００：１１以上時(shí)，開始積累谷氨酸。加入的氮量中，作為菌體固定的只有３％～６％，而３０％～８０％作為積累谷氨酸用。在生產(chǎn)上通過控制Ｃ：Ｎ，促進(jìn)以生長(zhǎng)為主的階段向以發(fā)酵為主的階段轉(zhuǎn)化是必要的。在一定的時(shí)間里，流加一定量氮源，不僅加速了糖的消耗，也加速了谷氨酸的積累。

第七十四頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

當(dāng)ＮＨ４＋缺乏時(shí)，積累α－酮戊二酸，適量時(shí)積累谷氨酸，如果ＮＨ４＋太高，發(fā)酵液ＰＨ在５．５～６．５，谷氨酸會(huì)進(jìn)一步生成谷酰胺。第七十五頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

（7）磷酸鹽：磷酸鹽是谷氨酸發(fā)酵所必需的。但不能過高，否則轉(zhuǎn)向氨酸發(fā)酵。第七十六頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五防止噬菌體和雜菌的污染從空氣過濾、培養(yǎng)基、設(shè)備、環(huán)境等環(huán)節(jié)嚴(yán)格把關(guān)。第七十七頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五四、谷氨酸的提取1、等電點(diǎn)法：操作簡(jiǎn)單，收率60％。周期長(zhǎng)，占地面積大。谷氨酸在水中的接力常數(shù)ＰＫ１＝２．１９；ＰＫ２＝４．２８，故等電點(diǎn)時(shí)的ＰＨ為：第七十八頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五第七十九頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、離子交換法：用陽(yáng)離子交換樹脂提取吸附谷氨酸形成的陽(yáng)離子，再用熱堿洗脫，收集相應(yīng)流分，再加鹽酸結(jié)晶。用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹脂（７３２）氫型吸附后，用６０゜C的ＮａＯＨ洗脫。樹脂再生用５．４％ＨＣｌ。第八十頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

三、雙柱法：將發(fā)酵液先通過弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂（氫型），以處去陽(yáng)離子雜志（ＮＨ４＋，Ｋ＋，Ｍｇ２＋等），不吸附谷氨酸。再通過磺酸性陽(yáng)離子交換樹脂，以吸附谷氨酸，用堿液洗脫谷氨酸（第二柱），因濃度集中，谷氨酸含量可達(dá)到６０％。再分別用酸使第一柱和第二柱進(jìn)行再生。第八十一頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

四、鹽酸鹽法：發(fā)酵液中除含谷氨酸外，尚有一定量的谷氨酰胺以及焦谷氨酸，用等電點(diǎn)以及離子交換提取均無法回收，可用鹽酸水解來提高收率。鹽酸水解時(shí)也使菌體蛋白水解成氨基酸并可使碳水化合物破壞，生成腐殖質(zhì)而被除去，提高水解液質(zhì)量，利用谷氨酸鹽在濃鹽酸中溶解度低而將谷氨酸與其它雜質(zhì)分離。第八十二頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

五、鋅鹽法：利用谷氨酸鋅在水溶液中的溶解度低的原理，將發(fā)酵液中谷氨酸一次進(jìn)行回收。第八十三頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五第八十四頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

六、直接濃縮法：適用于醋酸為原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸。七、離子交換膜電滲法。第八十五頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五谷氨酸發(fā)酵研究新進(jìn)展繼續(xù)選育各種生化突變菌株：轉(zhuǎn)化率提高，或可在富含生物素的培養(yǎng)基中保持較高產(chǎn)酸水平。提高原料利用率，拓寬原料來源或簡(jiǎn)化操作工藝。生物工程新技術(shù)的應(yīng)用：體外DNA重組的基因工程和原生質(zhì)體融合技術(shù)和固定化細(xì)胞技術(shù)使產(chǎn)量提高近1倍。改進(jìn)發(fā)酵工藝：開拓原料，改進(jìn)流加工藝，通過電子計(jì)算機(jī)控制發(fā)酵條件。第八十六頁(yè)，共九十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五非糖質(zhì)原料的谷氨酸發(fā)酵1、醋酸發(fā)酵谷氨酸機(jī)理：醋酸形成乙酰CoA，再進(jìn)入TCA，因此凡能利用葡萄糖原料的菌種也可作為醋酸發(fā)酵谷氨酸的菌株。以醋酸鈉或醋酸銨與醋酸的混合液為原料，且濃度不超過4％