PCR技術(shù)(包含引物設(shè)計)

〔PCR〕原理：原理：DNA聚合酶與啟動子的參與下，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在試驗條件下，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)PCRDNA的自然復(fù)制過程，其特異性依靠于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR退火(復(fù)性〕延長三個根本反響步驟構(gòu)成：DNA94℃左右確定時間PCRDNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反響作預(yù)備；DNA經(jīng)加熱變性成單鏈DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；DNA-DNAdNTPDNA鏈互補(bǔ)的半保存復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)就可獲得更多的“半保存復(fù)制鏈”，而且這種鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。技術(shù)分類〔常用〕PCR,IPCR)PCR是克隆序列旁側(cè)序列的一種方法．主要原理是用一種在序列中DNA的引物，擴(kuò)增夾在中間的未知序列。該擴(kuò)增產(chǎn)物是線性的DNA序列內(nèi)部的酶切位點分布狀況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，PCR獲得未知片PCR,APCR)：用酶法在一通用然后以此序列為cDNA進(jìn)展擴(kuò)增APCR。PCR)：兩種引物濃度比例PCR。在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同的引物濃度50～100÷110～15個循環(huán)中,高濃度引DNA。transcriptionPCRRT-PCR)：當(dāng)RNA時cDNA才能進(jìn)展擴(kuò)增。應(yīng)用格外廣泛無論是分子生物學(xué)還是臨床檢驗等都常常承受。增以提高模板量,然后再用一對內(nèi)引物擴(kuò)增以得到特異的PCR帶,此為巢式PCR。假設(shè)用一條外引物作內(nèi)引物則稱之為半巢式PCR的操作步驟可將外引物設(shè)計得比內(nèi)引物長些且用量較少PCR時承受較高的退火溫度而PCR時,由于較高退火溫度下內(nèi)引物不能與模板結(jié)合故只有外引物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過假設(shè)干次循環(huán)待外引物根本消耗盡PCR產(chǎn)物,PCR擴(kuò)增。這不僅削減操作步驟,PCRPCR，DNA模板的擴(kuò)增。PCR)：在同一反響中用多組引物同時擴(kuò)增幾種基因片段,假設(shè)基因的某一區(qū)段有缺失,則相應(yīng)的電泳譜上這一區(qū)帶就會消逝。主要用于同一病原體的分型及同時檢測多種病原體、多個點突變的分子病的診斷。PCRPCRPCR擴(kuò)增體系中,5’-3’-端引物上帶上一段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)變性和復(fù)性,PCR產(chǎn)PCR條件下發(fā)生聚合延長反響,產(chǎn)生一個包含兩個不同基因的雜合基因。PCR技術(shù)：利用完整的細(xì)胞作為一個微小的反響體,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進(jìn)展ＰＣＲ擴(kuò)增，可進(jìn)展細(xì)胞內(nèi)定位，適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列。PCR技術(shù)反響動力學(xué)反響動力學(xué)DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升，最Y=(1+X)n計算，YDNA片段擴(kuò)增后的n表示循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)100%，但實際狀況達(dá)不到，反響初期靶序列產(chǎn)物的漸漸積存，被擴(kuò)DNA聚合酶數(shù)量和活性、PCR擴(kuò)增效率、非特異性產(chǎn)物的競爭等因素有關(guān)。擴(kuò)增產(chǎn)物5’端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短、長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不同而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反響周期中，以兩條互補(bǔ)的35’端是固定的，內(nèi)，形成長短全都的短產(chǎn)物片段。由于短產(chǎn)物片段是按指數(shù)倍數(shù)增加，而長產(chǎn)物片段則以算術(shù)倍數(shù)增加，故可無視不計，使DNA內(nèi)，形成長短全都的短產(chǎn)物片段。由于短產(chǎn)物片段是按指數(shù)倍數(shù)增加，而長產(chǎn)物片段則以算術(shù)倍數(shù)增加，故可無視不計，使DNA片段供分析、監(jiān)測。DNAdNTP、Mg2+引物設(shè)計20bp左右。的片段。G+C40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不G+C過多易消滅非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，引物3個，一對引物間也不易多于四個Tm值應(yīng)當(dāng)協(xié)調(diào)：Tm=4〔G+C〕+2〔A+T〕】④避開引物內(nèi)部消滅二級構(gòu)造，避開兩條引物間互補(bǔ)，特別是3”端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。PCR延長的起始端，不能進(jìn)展任3‘端也不能發(fā)生PCR擴(kuò)增特異性影響不大，因此常用來引進(jìn)修飾位點或標(biāo)記物。適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。同源性。最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的時機(jī)。0.1～1umol10～100pmol最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的時機(jī)。TaqDNA聚合酶供給，一種是從棲熱水生桿菌中提純的自然酶，另一種為大腸菌合成的基因PCR0.5-2.5U/50ml，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量削減。的質(zhì)量與濃度：dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成1MTris-HCLPH調(diào)整dNTPdNTP50～200umol/L，尤其是留意4dNTP的濃度要相等等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。靶基因)PCR成SDS和K來消化處理標(biāo)本。SDS的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDSK能水解DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核PCR反響。PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的dNTP濃度為200umol/L為宜。Mg2+濃度過高，反TaqDNA聚合酶的活性，使反響產(chǎn)物削減。RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄〔RT〕cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增〔PCR〕相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR法：1mlTrizol冰上抽打勻漿〔邊勻漿邊暫?！?min5min12023rpm，15min1.5mlEP管中，加等體10min12023rpm，10min〔4℃保存〕，振蕩混合7500rpm，5min20min(EP管倒置在濾紙上)RNA沉淀枯燥〔不能完全枯燥〕3-5min(或手握充分溶解〔-70℃〕RNA18s、28s條帶，分光光度吸光度比值DEPC水+5ulRNA〔150倍〕ug/ml=OD260×40×150ug/ml=OD260×6ug/ul之間260/280的比值看是不是28s、18s、5s的三條帶是不是清楚，一般質(zhì)量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1-20℃保存，長期-70℃保存〕反響體系：20ul體系一步：約20分鐘抽提物 引物 RNAsin 0.5μl6515分鐘2、馬上放入冰浴其次步：約2小時RNAsin 0.5μl10mMdNTP 緩沖液 4μl25mMMgCl2 AMV 3μl1.5小時5-10分鐘-20PCRPCR反響體系：100μl體系小時5小時25mMMgCl22μl3μl緩沖液5μl5μl10mMdNTP1μl1μl上游引物2.5μl2.5μl下游引物2.5μl2.5μl模板2.5μl5μlddH2O34μl30μl酶 0.5μl 1μl輕質(zhì)石蠟油 50μl 50μl1分鐘，7221個循環(huán)秒，72130/40個循環(huán)7210分鐘4℃保存，5分鐘后-20℃保存或走電泳1.25小時300ml1.7%〔40ml0.5×TBE0.68g膠〕，微波2μl〔10mg/ml0.5μg/ml〕，充分混勻30-后現(xiàn)進(jìn)展電泳反響產(chǎn)物+2μlDNAmarker5V/cm6、在紫外燈下觀看,DNA存在則顯示出紅色熒光條帶,承受凝膠)：Tris54g27.5g、0.5M1000ml5×TBE0.5×TBE就可以在電泳時使用(工作濃度)。(6×緩沖液，4℃保存)：0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二30%甘油〔1.0%〕1.0g瓊脂糖+100ml電泳緩沖液，(假設(shè)首次煮膠，確定要煮透，以不消滅泡沫6010mg/ml溴化乙錠5μl，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在4度冰箱加快瓊脂糖凝固)后現(xiàn)1.5g。試劑：DEPC1000ml容量瓶中加雙蒸水定1‰DEPC水，并充分振蕩混勻備用。乙醇：用無水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存。1.DEPC水的瓶子在蓋子40-45分鐘，所以水要適當(dāng)多加一點；3.高壓完畢后，不要強(qiáng)行放氣，要讓壓力自然下降，不然水會噴出)。3、異丙醇：放入棕色瓶中。4、氯仿：放入棕色瓶中。5、輕質(zhì)石蠟油RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中胞并