醫(yī)療藥品管控化學(xué)藥物申報(bào)模板藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則

（醫(yī)療藥品管理化學(xué)藥物申報(bào)模板藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則【 ZH 】 G P T 2 - 1指導(dǎo)原則編號(hào):【 ZH 】 G P T 2 - 1藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則二OO七年月目錄壹、概述… 1二、基本原則… 2（壹）實(shí)驗(yàn)管理… 2（二）具體問(wèn)題具體分析… 2（三）隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)… 2三、基本內(nèi)容… 2（壹）受試物… 21、中藥、天然藥物… 22、化學(xué)藥物… 3（二）試驗(yàn)設(shè)計(jì)的總體考慮… 31、體外試驗(yàn)基本要求… 42、體內(nèi)試驗(yàn)基本要求… 6（三）標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合… 71、標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合應(yīng)具備的特征… 82、推薦的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合… 83、標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合的調(diào)整… 10（四）和致癌試驗(yàn)關(guān)聯(lián)的附加遺傳毒性試驗(yàn)… 四、結(jié)果分析和評(píng)價(jià)… 11（壹）體外試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)… 121、體外試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果… 122、體外試驗(yàn)陰性結(jié)果… 12（二）體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)… 131、體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果陰性時(shí)，確定靶組織暴露水平的原則… 132、生殖細(xì)胞誘變劑的檢測(cè)… 14（三）綜合分析和評(píng)價(jià)… 15五、遺傳毒性研究進(jìn)行的時(shí)間… 16六、參考文獻(xiàn)… 16七、著者… 18八、關(guān)聯(lián)注釋… 18九、附錄… 24藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則壹、概述遺傳毒性研究（GenotoxicityStudy）是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)毒性試驗(yàn)。遺傳毒性試驗(yàn)是指用于檢測(cè)通過(guò)不同機(jī)制直接或間接誘導(dǎo)遺傳學(xué)損傷的受試物的體外和體內(nèi)試驗(yàn)，這些試驗(yàn)?zāi)軝z出DNA損傷及其損傷的固定。以基因突變、較大范圍染色體損傷、重組和染色體數(shù)目DNA且且是惡性腫瘤發(fā)展過(guò)程的環(huán)節(jié)之壹（這種遺傳學(xué)改變僅于復(fù)雜的惡性腫瘤發(fā)展變化過(guò)程中起了部分作用。于檢測(cè)此類損傷的試驗(yàn)中呈陽(yáng)性的化合物為潛于致癌劑和/或致突變劑，即可能誘導(dǎo)癌和/或遺傳性疾病。由于于人體中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之間的關(guān)系，而對(duì)于遺傳性疾病尚難以證明有類似的關(guān)系，故遺傳毒性試驗(yàn)主要用于致癌性預(yù)測(cè)?？墒?，因?yàn)橐呀?jīng)確定生殖細(xì)胞突變和人類疾病有關(guān)，所以對(duì)可能引起可遺傳效應(yīng)的化合物和可能引起癌癥的化合物應(yīng)引起同樣的關(guān)注；此外，這些試驗(yàn)的結(jié)果可能仍有助于解釋致癌性的機(jī)制和試驗(yàn)結(jié)果。因此，于藥物開(kāi)發(fā)的過(guò)程中，遺傳毒性試驗(yàn)的目的是通過(guò)壹系列試驗(yàn)來(lái)預(yù)測(cè)受試物是否有遺傳毒性，于降低臨床試驗(yàn)受試者和藥品上市后使用人群的用藥風(fēng)險(xiǎn)方面發(fā)揮重要作用。本指導(dǎo)原則重點(diǎn)闡述遺傳毒性試驗(yàn)體內(nèi)外試驗(yàn)的基本原則，且介紹標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合方案，以及對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的綜合分析及評(píng)價(jià)。本指導(dǎo)原則適用于中藥、天然藥物和化學(xué)藥物的遺傳毒性試驗(yàn)研究。二、基本原則（壹）實(shí)驗(yàn)管理藥物的遺傳毒性試驗(yàn)屬于安全性評(píng)價(jià)研究，根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥品管理法》的規(guī)定，必須執(zhí)行《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（二）具體問(wèn)題具體分析遺傳毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，應(yīng)該于對(duì)受試物認(rèn)知的基礎(chǔ)上，遵循“具體問(wèn)題具體分析”的原則。應(yīng)根據(jù)受試物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、理化性質(zhì)、已有的藥理毒理研究信息、適應(yīng)癥和適用人群特點(diǎn)、臨床用藥方案選擇合理的試驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)適宜的試驗(yàn)方案，且綜合上述信息對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行全面的分析評(píng)價(jià)。（三）隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)遺傳毒性試驗(yàn)應(yīng)符合毒理學(xué)試驗(yàn)的基本原則，即隨機(jī)、對(duì)照和重復(fù)的原則。三、基本內(nèi)容（壹）受試物1、中藥、天然藥物受試物應(yīng)能充分代表臨床研究受試物或上市藥品，因此受試物應(yīng)采用制備工藝穩(wěn)定、符合臨床研究質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的樣品，壹般用中試樣品，且注明受試物的名稱、來(lái)源、批號(hào)、含量（或規(guī)格、保存條件及配制方法等。如不采用中試樣品，應(yīng)有充分的理由。如果由于給藥容量或給藥方法限制，可采用原料藥進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明批號(hào)、規(guī)格及生產(chǎn)廠家。2、化學(xué)藥物、保存條件明批號(hào)、規(guī)格和生產(chǎn)廠家，且符合試驗(yàn)要求。（二）試驗(yàn)設(shè)計(jì)的總體考慮可用作鑒定體細(xì)胞誘變劑、生殖細(xì)胞誘變劑和潛于的致癌物。目前，遺傳毒性試驗(yàn)方法較多，所使用的生物材料多種多樣，能夠利用原核細(xì)胞到真核細(xì)胞直至高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞于體外進(jìn)行添加或不添加代謝活化物質(zhì)的試驗(yàn)，也可于整體動(dòng)物上進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)；根據(jù)試驗(yàn)檢測(cè)DNA損傷和修復(fù)；從試驗(yàn)系統(tǒng)來(lái)分，遺傳毒性試驗(yàn)可分為體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)。因體內(nèi)和體外試驗(yàn)差異較大，以下分別討論體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)的基本要求。由于體內(nèi)外的試驗(yàn)方法均較多，本指導(dǎo)原則僅討論常用方法及需要重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題，具體試驗(yàn)時(shí)需根據(jù)具體情況具體分析。1、體外試驗(yàn)基本要求細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中采用的基本菌株54種組a注釋1，以及用于檢測(cè)組氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤TA102或埃希氏大腸桿菌WP2uvrA或埃希氏大腸桿菌WP2uvrA（注釋2C位點(diǎn)突變的4種菌株無(wú)法檢測(cè)TA102型大腸桿菌（。體外試驗(yàn)中最高濃度的確定（3）體外試驗(yàn)中受試物的最高濃度主要取決于受試物對(duì)細(xì)菌/細(xì)胞的毒性和溶解度。無(wú)毒化合物的高濃度5mg/5mg/ml10mM（選用較低者。要求達(dá)到的細(xì)胞毒性水平些遺傳毒性以外的作用機(jī)制如細(xì)胞毒性（核酸內(nèi)切酶等有關(guān)的結(jié)果）常發(fā)生于受試物濃度達(dá)到毒性閾濃度時(shí)。受以下的細(xì)胞毒性水平（濃度不應(yīng)超過(guò)1中的規(guī)定：如回復(fù)突變數(shù)減少、背景菌斑減少或消失。哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外遺傳毒性試驗(yàn)中，毒性水平應(yīng)高于50%50%。哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外基因突變?cè)囼?yàn)中，理想的最高濃度應(yīng)能產(chǎn)生至少毒性（即存活率不大于10%時(shí)獲得的陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待。難溶受試物的檢測(cè)（注釋若未觀察到細(xì)胞毒性，應(yīng)以產(chǎn)生沉淀的最低濃度作為最高濃度，但細(xì)菌試驗(yàn)不超過(guò)5mg/皿，哺乳動(dòng)物細(xì)胞不超過(guò)5mg/ml或10mM。若觀察到劑量關(guān)聯(lián)性的細(xì)胞毒性或誘變性，則不管溶解度如何，應(yīng)按上述1.2.2多個(gè)產(chǎn)生沉淀的濃度。但當(dāng)沉淀量影響到結(jié)果觀察時(shí)，則無(wú)法達(dá)到所要求的細(xì)胞毒性的劑量水平。于給藥處理開(kāi)始前和結(jié)束時(shí)，均應(yīng)用肉眼評(píng)價(jià)沉淀量。體外試驗(yàn)的重現(xiàn)性體外試驗(yàn)應(yīng)關(guān)注重現(xiàn)性。體外試驗(yàn)通常應(yīng)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。些試驗(yàn)經(jīng)過(guò)了充分驗(yàn)證且進(jìn)行了有效的內(nèi)部質(zhì)量控制，可不必進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，例如：對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)，進(jìn)行了規(guī)范的范圍確定試驗(yàn)，其可提供足夠的數(shù)據(jù)以保證試驗(yàn)方法的正確性；對(duì)體外染色tk2、體內(nèi)試驗(yàn)基本要求體內(nèi)試驗(yàn)的給藥途徑壹般情況下，給藥途徑應(yīng)和臨床擬用途徑壹致。若不壹致，應(yīng)說(shuō)明理由。體內(nèi)檢測(cè)染色體斷裂劑的骨髓試驗(yàn)嚙齒類動(dòng)物骨髓有核細(xì)胞的染色體畸變?cè)囼?yàn)?zāi)軌驒z測(cè)多種染色體完整性方面的改變，該類變化幾乎均來(lái)源于原發(fā)性的單個(gè)或多個(gè)染色單體斷裂。如果產(chǎn)生了壹個(gè)無(wú)著絲點(diǎn)片段，染色單體或染色體斷裂就導(dǎo)致微核形成，因而檢測(cè)染色體畸變或微核的方法可用于檢測(cè)斷裂（注釋注釋6驗(yàn)均可用于檢測(cè)斷裂劑。此外也能夠通過(guò)測(cè)定小鼠外周血中未成熟（嗜多染）脾臟無(wú)法清除帶微核的紅細(xì)胞或?qū)嗔褎┗蚍钦扼w誘導(dǎo)劑有足夠靈敏度的動(dòng)物。骨髓微核試驗(yàn)中嚙齒類動(dòng)物性別的選用（注釋7壹般單用雄性動(dòng)物即可。如果受試物專用于壹種性別，則通常選用相應(yīng)性別的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。（三）標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合果的判斷應(yīng)綜合考慮。1、標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合應(yīng)具備的特征標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合應(yīng)反映不同遺傳終點(diǎn)，包括體內(nèi)和體外試驗(yàn)，從原核到真核細(xì)胞，因此應(yīng)包含以下內(nèi)容：聯(lián)的遺傳學(xué)改變和大部分嚙齒類動(dòng)物遺傳毒性致癌劑。DNA細(xì)胞系（注釋（小鼠淋巴瘤k試驗(yàn)（注釋?，F(xiàn)有研究表明，對(duì)于檢測(cè)具有遺傳毒性但于菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中結(jié)果為陰性的化合物，于采用合適的試驗(yàn)方案條件tk應(yīng)包含壹項(xiàng)遺傳損傷體內(nèi)試驗(yàn)，以提供壹個(gè)包括影響受試物遺傳毒性作用的其他關(guān)聯(lián)因素（吸收、分布、代謝、排泄）模型。體內(nèi)試驗(yàn)可另外檢出某些遺傳毒性物質(zhì)（注釋?？刹捎脟ь悇?dòng)物染色體損傷體內(nèi)試驗(yàn)包括骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和骨髓細(xì)胞或外周血紅細(xì)胞微核試驗(yàn)。2、推薦的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合壹項(xiàng)體外細(xì)菌基因突變?cè)囼?yàn)；壹項(xiàng)采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行的體外染色體損傷評(píng)估試驗(yàn)，或體外小鼠淋巴瘤tk試驗(yàn)；壹項(xiàng)采用嚙齒類動(dòng)物造血細(xì)胞進(jìn)行的體內(nèi)染色體損傷試驗(yàn)無(wú)遺傳毒性。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合得到陽(yáng)性結(jié)果的受試物，根據(jù)其治療用途，可能需要進(jìn)行進(jìn)壹步的試驗(yàn)。建議采用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合且不意味著其他遺傳毒性試驗(yàn)（如DNADNA）不合適，這些試驗(yàn)組合中的壹項(xiàng)或多項(xiàng)試驗(yàn)對(duì)受試物不適合時(shí)，可采用其他替代試驗(yàn)，但應(yīng)提供充分的科學(xué)依據(jù)。從體外和體內(nèi)染色體損傷試驗(yàn)中可得到非整倍體損傷的信息，如有絲tk驗(yàn)方法。3、標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合的調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合于壹些特殊情況下不適合，需要根據(jù)情況進(jìn)行調(diào)整。于壹些情況下，細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)不能提供合適的或足夠（如某些抗生素和可能或已知可干擾哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)制的受試物（如拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、核苷酸同系物或DNA。于這種情況下，體外試驗(yàn)部分可改用二種不同類型細(xì)胞和二種不同終點(diǎn)（基因突變和染色體損傷）的體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)。三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合壹般可檢出具有遺傳毒性作用的可疑結(jié)構(gòu)的受試物（注釋?？墒?，對(duì)此類結(jié)構(gòu)的受試物，于三項(xiàng)試驗(yàn)組已知反應(yīng)性和代謝資料來(lái)選擇附加試驗(yàn)或調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案。對(duì)于某些特殊的受試物，如毒代或藥代動(dòng)力學(xué)研究表明不被全身吸收，于標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)中無(wú)法到達(dá)靶組織（注釋的受試物，如放射影像劑、抗酸鋁合劑和壹些皮膚用藥，對(duì)這些受試物，標(biāo)準(zhǔn)組合的體內(nèi)試驗(yàn)難以提供有用的附加信息。若改變給藥途徑也不能提供足夠的靶組織暴露時(shí)，可僅根據(jù)體外試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。（四）和致癌試驗(yàn)關(guān)聯(lián)的附加遺傳毒性試驗(yàn)1、腫瘤產(chǎn)生的關(guān)聯(lián)證據(jù)對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)遺傳毒性組合試驗(yàn)結(jié)果為陰性而于致癌試驗(yàn)中出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果但不能確定具有非遺傳毒性作用機(jī)制的受試物，建議采用合適模型的附加遺傳毒性試驗(yàn)。為了有助于了解作用機(jī)制，附加試驗(yàn)?zāi)軌蚋淖凅w外試驗(yàn)的代謝活化條件或者進(jìn)行腫瘤靶器官的遺傳損傷的體內(nèi)試驗(yàn)（例如：肝UDS瘤關(guān)聯(lián)基因遺傳改變的分子特征研究。2、具有特異結(jié)構(gòu)的化合物毒性進(jìn)行深入評(píng)估。四、結(jié)果分析和評(píng)價(jià)遺傳毒性研究是藥物安全性評(píng)價(jià)和藥物整體開(kāi)發(fā)進(jìn)程的壹個(gè)有機(jī)組成部分，其最終目的于于預(yù)測(cè)受試物潛于的遺傳毒性或致癌性。試驗(yàn)結(jié)果的分析和評(píng)價(jià)是試驗(yàn)的必要組成部分，應(yīng)對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行科學(xué)和全面的分析和評(píng)價(jià)。于對(duì)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)結(jié)合受試物的藥學(xué)特點(diǎn)、藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和其他毒理學(xué)研究的結(jié)果等信息進(jìn)行綜合分析。中藥、天然藥物仍應(yīng)結(jié)合處方組成特點(diǎn)、方中藥味毒性情況、臨床應(yīng)用背景情況等進(jìn)行綜合分析。試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)最終應(yīng)落實(shí)到臨床研究受試者范圍限定、風(fēng)險(xiǎn)效益評(píng)估以及必要防治措施的制定和應(yīng)用上。遺傳毒性試驗(yàn)組合檢測(cè)的是主要通過(guò)直接的遺傳損傷機(jī)制的致癌劑（如絕大多數(shù)已知的人類致癌劑可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，可是，任何壹種遺傳毒性試驗(yàn)中的陽(yáng)性結(jié)果且不壹定能說(shuō)明受試物對(duì)人體真正具有遺傳毒性或致癌性的危險(xiǎn)。于對(duì)體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，對(duì)陽(yáng)性或陰性的結(jié)果均應(yīng)予以充分考慮，尤其是于有疑義時(shí)。因此，需進(jìn)行綜合分析和評(píng)價(jià)。（壹）體外試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)1、體外試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果于評(píng)價(jià)體外試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的生物學(xué)意義時(shí)，應(yīng)考慮以下幾個(gè)問(wèn)1）陽(yáng)性結(jié)果是否由于體外獨(dú)特的代謝活化途徑或體外特殊的活性代謝物所致（13）？（5）養(yǎng)條件，如極端的pH值、滲透壓、細(xì)胞懸液中的沉淀物？哺乳類動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)中，陽(yáng)性結(jié)果是否僅出當(dāng)下存活率極低的濃度？陽(yáng)性結(jié)果是否歸因于某種污染物（當(dāng)某些化合物不存于可疑結(jié)形）？（8）某種特定遺傳終點(diǎn)的試驗(yàn)結(jié)果是否和同類化合物中其他有無(wú)其他可能的情況。通過(guò)之上考慮，綜合分析該陽(yáng)性結(jié)果是否有生物學(xué)意義。2、體外試驗(yàn)陰性結(jié)果于評(píng)價(jià)體外試驗(yàn)陰性結(jié)果時(shí)，應(yīng)慎重考慮以下問(wèn)題）受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)或已知代謝是否提示采用的標(biāo)準(zhǔn)體外代謝活化技術(shù)（如嚙S9）化合物的結(jié)構(gòu)或已知反應(yīng)性是（二）體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)壹些已經(jīng)確證的體內(nèi)方法可用于評(píng)價(jià)遺傳毒性，其中包括骨髓或外周血細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)。若某受試物體外試驗(yàn)結(jié)果為陰性，壹般僅需進(jìn)行壹種體內(nèi)細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)。對(duì)于于壹種或多種體外試驗(yàn)中顯示有生物學(xué)意義的陽(yáng)性結(jié)果的受試物，于進(jìn)行壹種體內(nèi)細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用骨髓或外周血以外的組織進(jìn)行進(jìn)壹步的體內(nèi)試驗(yàn)可提供更有用的信（注釋受試物體內(nèi)作用的靶細(xì)胞以及體外試驗(yàn)的檢測(cè)終點(diǎn)有助于選擇附加的體內(nèi)試驗(yàn)。性。1、體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果陰性時(shí)，確定靶組織暴露水平的原則體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果的意義和確定受試物于靶組織（注釋12）中有足夠的暴露直接關(guān)聯(lián)，尤其是當(dāng)體外試驗(yàn)顯示出確定的陽(yáng)性結(jié)果而體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為陰性時(shí)更為重要。由于靶組織以外的組織中出現(xiàn)了劑量限制性的毒性，因此靶組織中通常很難達(dá)到足以誘發(fā)生物學(xué)反應(yīng)（如毒性）的濃度。于這種情況下，毒代動(dòng)力學(xué)資料能提示于靶組織中的暴露情況。如果由于受試物于靶組織中利用度很低或蛋白結(jié)合率高等原因以致無(wú)法達(dá)到足夠的暴露量，此時(shí)常規(guī)的體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)的意義較小。以下建議適用于骨髓細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)，如果用其他靶組織，類似的原則也可采用。對(duì)于任何壹種體外試驗(yàn)方法結(jié)果呈陽(yáng)性、而體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為陰性的受試物，應(yīng)采用以下任何壹種方法反映受試物于體內(nèi)的暴露水平：通過(guò)測(cè)定微核試驗(yàn)中于各劑量組和各采樣時(shí)間點(diǎn)骨髓中未體畸變?cè)囼?yàn)中有絲分裂指數(shù)顯著的降低，間接反映受試物的暴露水平。利用度（注釋。直接測(cè)定骨髓中的受試物關(guān)聯(lián)物質(zhì)。通過(guò)放射自顯影檢測(cè)組織暴露水平。對(duì)于方法（2）～（4，應(yīng)先于最高劑量或其他關(guān)聯(lián)劑量采用和骨髓試驗(yàn)相同的動(dòng)物種屬品系及給藥途徑進(jìn)行檢測(cè)。若體外試驗(yàn)未顯示受試物有潛于遺傳毒性，可采用上述任何壹種方法，也可用嚙齒類（系統(tǒng)2、生殖細(xì)胞誘變劑的檢測(cè)遺傳毒性對(duì)生殖細(xì)胞的影響也極其重要。有關(guān)生殖細(xì)胞誘變劑檢測(cè)的比較研究結(jié)果顯示，大多數(shù)生殖細(xì)胞誘變劑能于體細(xì)胞試驗(yàn)中檢出，而體內(nèi)體細(xì)胞遺傳毒性試驗(yàn)的陰性結(jié)果通?？商崾臼茉囄飳?duì)生殖細(xì)胞也無(wú)影響。體內(nèi)體細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，于綜合評(píng)價(jià)及指導(dǎo)用藥時(shí)應(yīng)關(guān)注受試物對(duì)生殖細(xì)胞的影響。（三）綜合分析和評(píng)價(jià)當(dāng)遺傳毒性結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，對(duì)進(jìn)入臨床試驗(yàn)是否安全，應(yīng)考慮所有的安全性資料，包括對(duì)所有遺傳毒性資料的全面評(píng)價(jià)和擬進(jìn)行的臨床試驗(yàn)的性質(zhì)。性試驗(yàn)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果、但不直接和DNA發(fā)生作用的受試物，不是全露的關(guān)聯(lián)性，或者通過(guò)試驗(yàn)排除藥物為非直接和DNA作用的機(jī)制，如證明受試物不使DNA烷化或DNA鏈斷裂。若確認(rèn)受試物可直接損傷DNA，于極特殊情況下，可能會(huì)允許用于危及生命的疾?。ㄈ绨┌Y，但不能于健康受試者中使用。建議完成標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合中的第四種試驗(yàn)。若結(jié)果模棱倆可，需重復(fù)試驗(yàn)以確定結(jié)果的可重現(xiàn)性。若壹項(xiàng)或多項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，需采用證據(jù)權(quán)衡法（注釋、進(jìn)行作用機(jī)制研究或附加的支持性試驗(yàn)（注釋17）以確認(rèn)受試物是否會(huì)引起遺傳毒性。五、遺傳毒性研究進(jìn)行的時(shí)間通常情況下，對(duì)于（1）（2）中藥、天然藥物中能對(duì)生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響的新藥（藥、促精子生成藥、保胎藥或有細(xì)胞毒作用等的新藥果，應(yīng)進(jìn)壹步進(jìn)行其他關(guān)聯(lián)試驗(yàn)。對(duì)于其他需進(jìn)行遺傳毒性研究的中藥、天然藥物，如長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有異常增生、處方中含有高度懷疑的遺傳毒性的藥味或成分等，應(yīng)根據(jù)具體情況提供相應(yīng)的遺傳毒性研究資料，且根據(jù)具體情況來(lái)確定所需要進(jìn)行的遺傳毒性試驗(yàn)的內(nèi)容及進(jìn)行的時(shí)間。pH值等問(wèn)題，難以進(jìn)行體外試驗(yàn)者，可選擇進(jìn)行合適的體內(nèi)試驗(yàn)，但必須充分說(shuō)明理由。六、參考文獻(xiàn)、ICHSteeringCommittee.HarmonisedTripartiteGuidelineS2A ：Guidanceonspecificaspectsofregulatorygenotoxicitytests.1995、ICHSteeringCommittee.HarmonisedTripartiteGuidelineS2B ：Genotoxicity:Astandardbatteryforgenotoxicitytestingofpharmaceuticals.1997、ICHSteeringCommittee.HarmonisedTripartiteGuidelineM3:Non-clinicalsafetystudiesfortheconductofhumanclinicaltrialsforpharmaceuticals.2000、FDA.Guidanceforindustyandreviewstaff:Recommendedapproachestointegrationofgenetictoxicologystudyresults.20065、致突變?cè)囼?yàn)。見(jiàn)：新藥（西藥）臨床前研究指導(dǎo)原則匯編（6、特殊毒性試驗(yàn)。見(jiàn)：中藥新藥研究指南（理學(xué)7、秦伯益主編.新藥評(píng)價(jià)概論，第二版.人民衛(wèi)生出版社.，1999：207-2318、8、袁伯俊、王治喬.新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)和實(shí)踐，第壹版.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院出版社.，19979、遺傳毒性試驗(yàn)。見(jiàn)：日本臨床前研究指導(dǎo)原則解說(shuō)。藥事日?qǐng)?bào)社，2002：25-34，167-190、人民、OECDGuidelineforTestingofChemicals.471Bacterialreversemutationtest.1997、romosomeaberrationtest.1997、OECDGuidelineforTestingofChemicals.474Mammalianerythrocytemicronucleustest.1997、llgenemutationtest.1997七、著者《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組。八、關(guān)聯(lián)注釋TA97TA97a替。注釋2：有將A-T壹些遺傳毒性致癌劑的關(guān)聯(lián)文獻(xiàn)報(bào)道（如Levin等，1983；Wilcox等。日本勞務(wù)省對(duì)5種化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析（以及由各個(gè)制藥公司對(duì)較小的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析）的結(jié)果表明，約7.5%的細(xì)菌誘變劑是由大腸桿菌WP2uvrA 而非4種鼠傷寒沙門氏菌株標(biāo)準(zhǔn)組合檢出。盡管尚未獲得這些化合物對(duì)動(dòng)物致癌性的資料，但它們可能具有和誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌株標(biāo)準(zhǔn)組合變化的誘變劑同樣的潛于致癌性。注釋3：此處所指最高濃度的確定主要針對(duì)化學(xué)藥物，因中藥、天然藥物所包含范圍過(guò)寬（等，情況過(guò)于復(fù)雜，于合適時(shí)可參考化學(xué)藥物的最高濃度的確定原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，不合適時(shí)需根據(jù)具體情況進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)。注釋4：出現(xiàn)這種情況可能是培養(yǎng)基中的血清或S9混合液成分增加了沉淀物的溶解性，也可能是細(xì)胞膜脂質(zhì)層易化了細(xì)胞對(duì)脂溶性物質(zhì)的吸收；此外，某些類型的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞具有內(nèi)吞噬作用（中國(guó)倉(cāng)鼠、O和L細(xì)胞，能攝取固態(tài)顆粒，隨后將其分且且許多不溶性藥物是以混懸液或顆粒狀給予人體的?？墒橇硪挤矫?，沉淀物可能干擾結(jié)果的觀察，且使得暴露的程度難以控制（離心方法從暴露介質(zhì)中分離細(xì)胞時(shí)）已發(fā)現(xiàn)壹些物質(zhì)僅于產(chǎn)生沉淀的濃度范圍內(nèi)才顯示出明確的遺傳毒性，這些物質(zhì)包括化合物的聚合物和混合物、某些多環(huán)苯烴、某些苯丙胺、七氯化合物等。有關(guān)其中壹些物質(zhì)的協(xié)作研究結(jié)果表明，它們的遺傳毒性于可溶范圍內(nèi)可被檢出，但于不溶性的范圍內(nèi)明顯增高。注釋5：因微核形成機(jī)制和誘導(dǎo)染色體畸變有關(guān)，微核試驗(yàn)及染色體畸變?cè)囼?yàn)均可用于篩選斷裂劑。對(duì)相同受試物的小鼠微核試驗(yàn)和（即檢測(cè)斷裂劑的能力和定量（即確定誘導(dǎo)斷裂的最低劑量）這倆方面均高度關(guān)聯(lián)。采用同種動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，可望得到更為壹致的結(jié)果。注釋6：雖然微核的形成源于受試物和紡錘體相互作用導(dǎo)致整條染色體分裂的滯后，但微核試驗(yàn)無(wú)法檢測(cè)所有非整倍體誘導(dǎo)劑。更特異的非整倍體畸變檢測(cè)方法之壹即是采用快速、靈敏的技術(shù)分析個(gè)體（嚙齒類動(dòng)物方法。注釋7：鑒于微核和染色體畸變的誘導(dǎo)具有關(guān)聯(lián)性，因而用雄性動(dòng)物進(jìn)行骨髓染色體畸變?cè)囼?yàn)時(shí)，應(yīng)用相同的實(shí)驗(yàn)條件是合理的。外周血微核試驗(yàn)和體內(nèi)前處理的UDS試驗(yàn)壹樣僅于雄性嚙齒類動(dòng)物中得到驗(yàn)證。注釋8：目前被接受的評(píng)價(jià)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變的試驗(yàn)方法包L5178YTK6tkCHO細(xì)胞、V79L5178YhprtAS52gpt9tk位點(diǎn)誘導(dǎo)的突變體分子分析顯示存于多種遺傳學(xué)tkb等位基因的缺失是染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目的改變或重組的結(jié)果。有證據(jù)表明其他位點(diǎn)，如hprt或gpt也對(duì)染色體的大范圍缺失敏感，但由于來(lái)源于X染色體的的hprt基因很可能位于生命必需基因（Essentialgenes）的側(cè)面，染色體的大范圍缺失或數(shù)目改變往往不引起突變集落，因此對(duì)于檢測(cè)多種遺傳學(xué)改變，該遺傳位點(diǎn)的靈敏度不如tk位點(diǎn)。tk丙卡巴肼、氫醌、氨基甲酸乙酯、苯等致癌劑即屬于此類。注釋11：某些具有遺傳毒性可疑結(jié)構(gòu)的分子單體和化合物的致癌和/或致突變有關(guān)?？梢山Y(jié)構(gòu)包括烷化親電子中心、不穩(wěn)定過(guò)氧化物、芳香胺、偶氮結(jié)構(gòu)、N-亞硝基基團(tuán)、芳香硝基基團(tuán)。注釋12：靶組織：此處特指體內(nèi)試驗(yàn)的檢測(cè)目標(biāo)組織，如小鼠骨髓微核試驗(yàn)中的骨髓。注釋13：已有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于體內(nèi)和體外試驗(yàn)結(jié)果之間差異的問(wèn)題，差異包括）體外形成的代謝產(chǎn)物未必于體內(nèi)形成b）代謝產(chǎn)物可能于體內(nèi)迅速被解毒而體外則不能c）受試物于體內(nèi)可迅速、有效地被排泄等。注釋髓以外的組織檢測(cè)遺傳毒性的體內(nèi)試驗(yàn)方法可進(jìn)壹步提供壹些有價(jià)DNA（UDS）UDSUDS32PDNA注釋15：對(duì)眾多藥物進(jìn)行二室間藥物水平的直接比較的研究表明，骨髓是血液灌流性良好的組織，故血液或血漿中藥物關(guān)聯(lián)物質(zhì)的水平和骨髓中水平相似。雖然藥物濃度不總是完全壹致，可是檢測(cè)血液或血漿中藥物濃度和確定骨髓中暴露水平有足夠的關(guān)聯(lián)性。注釋16衡提示無(wú)遺傳毒性危害。例如，于體外細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)的壹種暴露方案下出現(xiàn)了陽(yáng)性反應(yīng)，該陽(yáng)性結(jié)果僅于高劑量時(shí)出現(xiàn)，而發(fā)生率升高的程度于所用溶劑和細(xì)胞系的歷史對(duì)照數(shù)據(jù)范圍內(nèi)或剛剛超出該范圍。證據(jù)權(quán)衡后可能提示，雖然染色體異常頻率的輕微升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但無(wú)生物學(xué)關(guān)聯(lián)性。有幫助的考慮因素包括（1）于出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的劑量時(shí)細(xì)胞毒性的水平；（2）相同試驗(yàn)或補(bǔ)充試驗(yàn)的確證性數(shù)據(jù)。例如，于無(wú)代謝活化下短期暴露時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，但于相當(dāng)細(xì)胞毒性水平的長(zhǎng)期暴露中未得到確證，這時(shí)陽(yáng)性結(jié)果可能不具有生物學(xué)意義。和之類似，于體外染色體畸變?cè)囼?yàn)得到陽(yáng)性結(jié)果，而于相當(dāng)暴露方案下小鼠淋巴瘤試驗(yàn)未得到確證，也可對(duì)該陽(yáng)性結(jié)果的意義產(chǎn)生疑問(wèn)。如果證據(jù)權(quán)衡法提示無(wú)遺傳毒性危害，可進(jìn)行重復(fù)給藥的臨床試驗(yàn)，該陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)寫(xiě)入研究者手冊(cè)和知情同意書(shū)中。為確證體外試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果，進(jìn)行附加的體內(nèi)試驗(yàn)很有價(jià)值。例如，小鼠重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中進(jìn)行外周血涂片可用來(lái)評(píng)估誘導(dǎo)微核的作用，大鼠或猴重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)可用于評(píng)估細(xì)胞分裂中期的染色體損傷。于潛于的靶組織中應(yīng)評(píng)估DNA損傷（如通過(guò)彗星或堿基洗脫試驗(yàn)來(lái)評(píng)估DNA加合物或DNA鏈斷裂），或用轉(zhuǎn)基因大鼠或小鼠來(lái)評(píng)估于可能的靶組織中的誘變性。當(dāng)體外遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，敘利亞倉(cāng)鼠胚胎細(xì)胞（SHE）轉(zhuǎn)化試驗(yàn)可用作附加試驗(yàn)。壹些轉(zhuǎn)基因小鼠也能夠于短期致癌性試驗(yàn)中應(yīng)用，如研究顯示p53單壹缺陷小鼠可用于致突變性致癌劑的鑒定。九、附錄推薦的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合中的遺傳毒性試驗(yàn)方法注：以下方法中所提供的最高濃度和最高劑量設(shè)計(jì)原則主要針對(duì)化學(xué)藥物，中藥、天然藥物由于情況復(fù)雜，應(yīng)綜合考慮多方面因素，不能簡(jiǎn)單套用該原則，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)。（壹（Bacterialreversemutationtest）1、菌株組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌和/或色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型埃希氏大腸桿菌，至少應(yīng)包含下述五種菌株組合（寒沙門氏菌：（1（）（）（47或或（）2或大腸埃希桿菌A或大腸埃希桿菌（。菌株特性鑒定需符合要求，-80℃或液氮凍存?zhèn)溆谩?、濃度至少應(yīng)包含5個(gè)可用于結(jié)果分析的濃度。最高濃度主要取決于受試物對(duì)細(xì)菌的毒性和/或溶解度：a、對(duì)于可溶性的無(wú)毒受試物，推薦的最高測(cè)試濃度壹般為5mg/皿；b定最高濃度（詳見(jiàn)正文；c、對(duì)于難溶性的受試物，壹般采用最小沉淀濃度為最高濃度；若觀察到濃度關(guān)聯(lián)性的細(xì)胞毒性或誘變性，則要求檢測(cè)多個(gè)產(chǎn)生沉淀的濃度（詳見(jiàn)正文33、代謝活化Aroclor1254或苯巴比妥和β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)處理后的哺乳動(dòng)物肝臟微粒體酶S9S9S9S95％。4、對(duì)照代謝活化或非代謝活化條件下，均應(yīng)設(shè)立平行陰性（空白對(duì)照和/或溶劑對(duì)照性致突變劑。5、方法可采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法或預(yù)培養(yǎng)法，受試物處理后48～72小時(shí)觀察結(jié)果。每壹濃度至少平行三皿。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)壹次。6、結(jié)果判定結(jié)果中應(yīng)描述各濃度組細(xì)菌毒性大小和沉淀情況，結(jié)果表示為每皿的回復(fù)突變菌落數(shù)，且計(jì)算各組的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。至少于壹個(gè)菌株上，于有或無(wú)代謝活化的情況下，受試物所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)出現(xiàn)濃度依賴性的增加和/或于壹個(gè)或多個(gè)濃度組上出現(xiàn)可重復(fù)性的增加，可判定為陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)果判定時(shí)應(yīng)首先考慮試驗(yàn)結(jié)果的生物學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法有助于對(duì)結(jié)果的評(píng)價(jià)，可是統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不是陽(yáng)性反應(yīng)的唯壹標(biāo)準(zhǔn)。（二）體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)（Invitro Mammalianchromosomalaberrationtest）1、細(xì)胞CHLCHO人外周血淋巴細(xì)胞等，細(xì)胞系需定期檢查核型和有無(wú)支原體污染等。-80℃或液氮凍存?zhèn)溆谩?、濃度至少應(yīng)包含3個(gè)可用于結(jié)果分析的濃度。最高濃度主要取決于受試物的細(xì)胞毒性和/或溶解度，中、低濃度壹般采用倍比稀釋法：a、對(duì)于可溶性的無(wú)毒受試物，推薦的最高測(cè)試濃度 壹般l或（選用較低者；b壹般毒性應(yīng)大于％（詳見(jiàn)正文；c觀察到濃度關(guān)聯(lián)性的細(xì)胞毒性或誘變性，則要求檢測(cè)多個(gè)產(chǎn)生沉淀的濃度（詳見(jiàn)正文3。3、代謝活化壹般采用誘導(dǎo)劑，如Aroclor1254或苯巴比妥和β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)處理后的哺乳動(dòng)物肝臟微粒體酶于加S9和不加S9S9于試驗(yàn)介質(zhì)中的終濃度壹般為1％（。4、對(duì)照代謝活化或非代謝活化條件下，均應(yīng)設(shè)立平行陰性（空白對(duì)照和/或溶劑對(duì)照）和陽(yáng)性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照物應(yīng)為已知的陽(yáng)性致突變劑。5、方法處理及細(xì)胞收獲時(shí)間：于代謝或非代謝活化的情況下，受試物和細(xì)胞作用3～6小時(shí)，于1.51.5個(gè)細(xì)/收獲細(xì)胞時(shí)間可能1.5200應(yīng)分別記錄各組含有結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w的細(xì)胞數(shù)和畸變類型，裂隙應(yīng)單獨(dú)記錄，但不計(jì)入畸變率中。同時(shí)應(yīng)單獨(dú)記錄多倍體和內(nèi)復(fù)制等數(shù)目畸變，但不計(jì)入畸變率中。6、結(jié)果判定結(jié)果中應(yīng)描述各濃度組細(xì)胞毒性大小和沉淀情況，結(jié)果表示為染色體結(jié)構(gòu)畸變細(xì)胞的百分率。受試物所誘發(fā)的染色體畸變率出現(xiàn)濃度依賴性的增加，或出現(xiàn)可重復(fù)性的增加，可判定為陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)果判定時(shí)應(yīng)首先考慮試驗(yàn)結(jié)果的生物學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法有助于對(duì)結(jié)果的評(píng)價(jià)，可是統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不是陽(yáng)性反應(yīng)的唯壹標(biāo)準(zhǔn)。多倍體數(shù)目的增加提示受試物可能會(huì)抑制有絲分裂或誘導(dǎo)染色體數(shù)目畸變。出現(xiàn)染色體內(nèi)復(fù)制的細(xì)胞數(shù)增多提示受試物可能會(huì)影響細(xì)胞周期。（三1、細(xì)胞通常采用小鼠淋巴瘤L5178Ytk+/-3.7.2C細(xì)胞，需定期檢查核型或有無(wú)支原體污染等，必要時(shí)進(jìn)行自發(fā)突變細(xì)胞的清除。-80℃或液氮凍存?zhèn)溆谩?、濃度至少應(yīng)包含4（平行處理）～8（單處理）個(gè)可用于結(jié)果分析的濃度。最高濃度主要取決于受試物的細(xì)胞毒性和/或溶解度，中、低濃度壹般采用倍比稀釋法：a、對(duì)于可溶性的無(wú)毒受試物，推薦的最高測(cè)試濃度 壹般l或（選用較低者；b最高濃度應(yīng)能產(chǎn)生至少毒性（即存活率不大于。對(duì)于細(xì)胞存活率低于%的陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待（詳見(jiàn)正文2。c若觀察到濃度關(guān)聯(lián)性的細(xì)胞毒性或誘變性，則要求檢測(cè)多個(gè)產(chǎn)生沉淀的濃（詳見(jiàn)正文3。3、代謝活化Aroclor1254或苯巴比妥和β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)處理后的哺乳動(dòng)物肝臟微粒體酶于加S9和不加S9S9于試驗(yàn)介質(zhì)中的終濃度壹般為1％（。4、對(duì)照代謝活化或非代謝活化條件下，均應(yīng)設(shè)立平行陰性（空白對(duì)照和/或溶劑對(duì)照）和陽(yáng)性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照物應(yīng)為已知的陽(yáng)性致突變劑。5、方法壹般采用微孔法進(jìn)行試驗(yàn)。藥物處理時(shí)間：于代謝活化或非代謝活化條件下，壹般受試物和3～43～424h突變表達(dá)期：受試物和細(xì)胞作用3～4小時(shí)后，去除受試物，將L5178Y2于處理結(jié)