基因工程原理測序技術(shù)

基因工程原理測序技術(shù)2023/5/26第一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五第三章測序技術(shù)第一節(jié)DNA測序策略第二節(jié)傳統(tǒng)的DNA序列分析法第三節(jié)第二代測序技術(shù)簡介第四節(jié)第三代測序技術(shù)2023/5/26第二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五造福人類的HGP人類基因組計劃（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式啟動，其主要目標(biāo)有：識別人類DNA中所有基因（超過10萬個）；測定組成人類DNA的30億堿基對的序列；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會問題。人類基因組計劃是當(dāng)代生命科學(xué)一項偉大的科學(xué)工程，它奠定了21世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學(xué)上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價值。2023/5/26第三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)DNA測序策略DNA的測序策略因待測DNA分子性質(zhì)、測序方法和測序目的不同而有所不同。在測序之前，必須根據(jù)待測序列區(qū)的長度，所要求的測序精確度以及現(xiàn)有設(shè)施來制定測序總策略。一、已知序列的確證性測序策略二、未知序列的從頭測序策略2023/5/26第四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五一、已知序列的確證性測序策略確證性測序（confirmatorysequencing）：對已知的核酸序列進(jìn)行鑒定和證實；例如：臨床分子診斷中，對有遺傳傾向的病例檢測相關(guān)基因有無突變；不僅有助于臨床診斷，還有助于探索有關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理及基因突變引起的表型變化。2023/5/26第五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五一、已知序列的確證性測序策略多數(shù)情況下，確證性測序的DNA片段較小，一套反應(yīng)即可獲得雙鏈DNA其中一條鏈上局部區(qū)域的核苷酸序列，通常只需對亞克隆于M13噬菌體或噬菌粒載體上的一段合適的限制酶切片段進(jìn)行測序；待測DNA片段位于通用引物的測序范圍之內(nèi)時，可按克隆位點兩側(cè)的載體序列設(shè)計和合成寡核苷酸片段作為“通用引物”；否則，最好的方法是合成一段長度為18-20核苷酸的寡核苷酸引物，與距離待測區(qū)約50-100核苷酸的序列互補。2023/5/26第六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五二、未知序列的測序策略未知序列DNA的從頭測序（denovosequencing）是指確定一個未知DNA序列的準(zhǔn)確長度及核苷酸排列順序；測序策略因待測DNA的長度而異，只有1kb左右的待測DNA可選用定向測序法，過長的DNA可選用隨機(jī)測序法。2023/5/26第七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五（一）隨機(jī)測序法隨機(jī)測序法（randomapproach）：包括鳥槍法與人工轉(zhuǎn)座子法。其共同特點是無特定方向性，隨機(jī)對靶DNA進(jìn)行測序，最后通過計算機(jī)拼裝而得到完整的序列信息。2023/5/26第八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五（一）隨機(jī)測序法鳥槍法shotgunstrategy利用超聲處理、核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）切割或限制性酶切割，將長鏈DNA隨機(jī)斷裂成適于測序的片段，把這些DNA片段裝入適當(dāng)載體，建立亞克隆文庫，含有子片段的亞克隆擴(kuò)增后分別進(jìn)行DNA序列測定，然后將序列重疊排列，確定待測DNA的完整序列；該法所獲得的序列由許多序列累積產(chǎn)生，結(jié)果準(zhǔn)確；但由于測序的亞克隆是隨機(jī)挑選出來，某些序列可能多次重復(fù)測定，而一些序列一直不出現(xiàn)，通常要測定比實際靶DNA所含核苷酸多4～7倍的序列；如果靶DNA含較多的重復(fù)序列，計算機(jī)將難以進(jìn)行分析。2023/5/26第九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五（二）定向測序法定向測序法（directedsequencing）：指從待測DNA片段的某一端開始按順序進(jìn)行測序，直至將待測DNA的序列全部測完；該類方法具有方向性，不會出現(xiàn)大量重復(fù)測定的現(xiàn)象；主要包括：嵌套缺失法和引物步入法。2023/5/26第十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五（二）定向測序法1．嵌套缺失法嵌套缺失法（nesteddeletion）：利用工具酶酶解待測DNA，只要控制消化時間，即可產(chǎn)生一組從同一端缺失的長度不一的互套缺失突變體，測定其序列，通過相互重疊部分將相鄰片段的序列彼此拼接，如此重疊互套，獲得待測DNA的全序列；產(chǎn)生互套缺失突變體的主要工具酶：核酸外切酶III、核酸酶Bal31、DNA酶I和T4DNA聚合酶。2023/5/26第十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五（二）定向測序法用外切酶Ⅲ構(gòu)建互套缺失突變體測序方法示意圖2023/5/26第十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五（二）定向測序法2．引物步入法引物步入法（primerwalking）：從待測DNA片段的3’端開始，利用載體上的序列設(shè)計第一次反應(yīng)的引物，測定一段DNA序列，然后依次根據(jù)前一次測序結(jié)果，設(shè)計下一次反應(yīng)引物，循序漸進(jìn)測序，直至完成，得到靶DNA的全部序列。2023/5/26第十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五（二）定向測序法引物步入法測序原理示意圖2023/5/26第十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五KeyGenomicsTechnologies1975-SouthernDNAhybridizationtechnique1977-Sanger’schain-terminationandMaxam、Gilbert’schemicalDNAsequencingmethods1980-Automatedinsituoligonucleotidesynthesisinstrument1985-Mullis’sdiscoveryofPCRatCetus1992-Affymetrix(Fodor’sgroup)firstgene-chip1995-ABI’sfirstautomatedDNAsequencer2006-2ndgenerationDNAsequenceronmarket2007andbeyond–Singlemoleculesequencingtechniques2023/5/26第十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五測序技術(shù)的發(fā)展雙脫氧末端終止法(Sanger測序法)1970s同位素標(biāo)記，手工1980s熒光標(biāo)記，自動1990s毛細(xì)管電泳合成測序法（第二代測序）焦磷酸測序（Pyrosequencing,Roche/454）合成測序（Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa）連接測序（Sequencing-By-Ligation,ABI/SOLiD）單分子測序技術(shù)（第三代測序）HelicosPacificBiosciencesOxfordNanopore2023/5/26第十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)傳統(tǒng)的DNA序列分析法Sanger雙脫氧鏈終止法Maxam-GilbertDNA化學(xué)修飾法DNA雜交測序毛細(xì)管電泳DNA序列分析的自動化2023/5/26第十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五1970年發(fā)明了第一種DNA測序方法2023/5/26第十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五Sanger雙脫氧鏈終止法Sanger于1977年在加減法測序的基礎(chǔ)上創(chuàng)建了雙脫氧鏈末端合成終止法（chainterminationmethod），簡稱Sanger法、雙脫氧法或酶法。2023/5/26第十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五一、基本原理單鏈DNA模板、DNA合成引物、DNA聚合酶以單鏈的DNA為模板，合成出準(zhǔn)確的DNA互補鏈能夠利用2’，3’-雙脫氧核苷三磷酸作底物，參入到寡核苷酸鏈的3’-末端，從而終止DNA鏈的延長2023/5/26第二十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五雙脫氧鏈終止法的測序基礎(chǔ)是以雙脫氧核苷三磷酸為測序反應(yīng)的鏈終止劑。2023/5/26第二十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26第二十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五

POHdNTPddNTP

POHOH

P

P

P

POH2023/5/26第二十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五在4組相互獨立的測序反應(yīng)體系中，分別加入四種不同ddNTP，其余成分相同。調(diào)整每個測序反應(yīng)中dNTP與ddNTP的比例，使引物的延伸在對應(yīng)于待測模板DNA每個可能摻入的位置都有可能發(fā)生終止。產(chǎn)生4組分別終止于互補鏈3′末端的每一個A、G、C和T位置上的一系列長度的核苷酸鏈。通過高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影檢測，直接讀出新合成DNA鏈的序列。2023/5/26第二十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26第二十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五雙脫氧鏈末端終止法測序原理示意圖2023/5/26第二十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五二、測序反應(yīng)體系的組成（一）待測模板1．單鏈模板DNASanger法經(jīng)典測序反應(yīng)--將待測DNA片段克隆于M13mp載體中，得到單鏈的DNA模板，再按Sanger法進(jìn)行測序。2．雙鏈模板DNA將待測的DNA片段克隆到質(zhì)粒載體上，得到含待測DNA克隆片段的雙鏈質(zhì)粒，經(jīng)堿變性處理，與寡核苷酸引物序列退火，按Sanger法進(jìn)行測序；2023/5/26第二十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五Sanger雙脫氧-M13體系M13--噬菌體載體，可得到單鏈DNA序列Sanger雙脫氧-pUC體系

pUC-質(zhì)粒載體，利用雙鏈質(zhì)粒DNA模板的雙脫氧DNA序列分析法2023/5/26第二十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26第二十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26第三十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26第三十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26第三十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五二、測序反應(yīng)體系的組成（二）引物“通用”引物：在DNA聚合酶催化的測序反應(yīng)中需要測序引物。不論是單鏈DNA模板，還是雙鏈DNA模板，都可通過使用克隆位點兩側(cè)的載體序列互補的“通用”引物；通用引物長度：一般為15～30個核苷酸。2023/5/26第三十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五二、測序反應(yīng)體系的組成（三）DNA聚合酶1．大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）：Sanger法最早使用的酶，具有5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶活性，催化鏈延伸反應(yīng)的能力較差，用它進(jìn)行測序常產(chǎn)生較高的本底和假帶；2．測序酶（sequenase）：經(jīng)過修飾的T7噬菌體DNA聚合酶，消除了3’→5’外切酶活性。酶活非常穩(wěn)定，很高的鏈延伸能力和極快的聚合反應(yīng)速度，測定較長DNA的首選酶；3．TaqDNA聚合酶：PCR反應(yīng)關(guān)鍵酶，在95℃的高溫下保持穩(wěn)定，可在高溫下進(jìn)行反應(yīng)，該酶用于測序具有很好的鏈延伸性能，能克服富含GC序列的模板形成自身二級結(jié)構(gòu)對測序的影響。2023/5/26第三十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五二、測序反應(yīng)體系的組成（四）放射性核素標(biāo)記的dNTPα-32P-dNTP或α-35S-dNTP。目前通常采用α-35S-dNTP。2023/5/26第三十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五二、測序反應(yīng)體系的組成（五）測序產(chǎn)物的凝膠電泳及識讀能否將測序反應(yīng)中產(chǎn)生的各種不同長度的DNA片段進(jìn)行有效分離是序列分析成敗的關(guān)鍵。2023/5/26第三十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五三、Sanger雙脫氧鏈終止法的特點1.快速簡便，一次反應(yīng)可測500個以上的堿基序列；2.熒光染料代替放射性核素標(biāo)記，使該法便于實現(xiàn)自動化分析，能夠滿足絕大多數(shù)DNA樣品序列分析的需要。2023/5/26第三十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五Maxam-GilbertDNA化學(xué)修飾法1977年哈佛大學(xué)A.M.Maxam和W.Gilbertf發(fā)明原理：化學(xué)試劑處理末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割產(chǎn)生一組具有不同長度的DNA鏈混合物經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影，讀出待測DNA片段的核苷酸序列2023/5/26第三十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五由于這種化學(xué)切割反應(yīng)的特異性是由堿基的修飾作用決定的，所以切割反應(yīng)必定是定量的化學(xué)切割反應(yīng)的試劑：肼hydrazine聯(lián)氨NH2-NH2硫酸二甲酯dimethylsulphate六氫吡啶2023/5/26第三十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五堿性條件下，肼與胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）作用通過六氫吡啶作用，使兩個磷酸分子從糖片段上釋放出來，導(dǎo)致在核苷酸位置上發(fā)生DNA的斷裂鹽存在的條件下，肼同T的反應(yīng)被抑制，只發(fā)生胞嘧啶堿基特異的切割反應(yīng)由此區(qū)別C和C+T兩種反應(yīng)2023/5/26第四十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五硫酸二甲酯（(CH3O)2SO4）一種堿性的化學(xué)試劑作用于DNA堿基環(huán)中的氮原子，使之甲基化在中性的pH值環(huán)境中，可導(dǎo)致配糖鍵發(fā)生水解，使去堿基的糖-磷酸鍵十分微弱堿性條件下磷酸分子從DNA鏈上脫落，造成鏈的斷裂鳥嘌呤（G）的N7>腺嘌呤(A)的N3六氫吡啶作用，從脫氧核糖上移去2個磷酸分子，使DNA鏈在甲基化的鳥嘌呤G位點斷裂2023/5/26第四十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26第四十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五CS載體系統(tǒng)：末端標(biāo)記載體核酸內(nèi)切酶Th111Ⅰ特點：產(chǎn)生5’單堿基的突出末端，便于標(biāo)記；Th111Ⅰ位點十分稀少；5’突出末端可以是G或A，也可以是T或C，選擇性強(qiáng)；在載體中具有兩個Th111Ⅰ位點，可對克隆在載體上的片段任何一段作選擇性標(biāo)記2023/5/26第四十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五化學(xué)修飾法的優(yōu)點：不需要體外酶切；只要有末端標(biāo)記，無論單雙鏈都可用來測序。限制因素：測序膠的分辨率2023/5/26第四十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五DNA雜交測序原理：如果一段短的DNA探針能夠與較長的靶DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈分子，可據(jù)此推斷靶DNA序列相對應(yīng)的互補序列步驟：將待測的靶DNA分子與一組已知核苷酸序列的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交比較分析與待測DNA雜交的探針之間的堿基重疊關(guān)系，據(jù)此推算靶DNA的核苷酸序列2023/5/26第四十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26第四十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五兩種操作方式：1.將不同的寡核苷酸與固定在濾膜上的靶DNA序列樣品進(jìn)行雜交2.應(yīng)用寡核苷酸矩陣芯片的DNA雜交測序法2023/5/26第四十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五雜交測序的應(yīng)用1.檢測靶DNA的單堿基突變2.用于不同片段之間的序列比較分析（同源性序列檢測）3.用表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）的矩陣芯片，檢測不同類型細(xì)胞中或不同生長發(fā)育狀態(tài)下的細(xì)胞中特定基因的表達(dá)狀況4.檢測傳統(tǒng)的測序技術(shù)所得DNA片段的核苷酸序列數(shù)據(jù)2023/5/26第四十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五毛細(xì)管電泳以高壓直流電場為驅(qū)動力，在毛細(xì)管內(nèi)使帶電粒子按淌度或分配系數(shù)進(jìn)行分離的一種電泳技術(shù)。具有分辨率高、重現(xiàn)性好、靈敏度高、快速和易于實現(xiàn)自動化等優(yōu)點。常用于DNA測序的毛細(xì)管電泳形式有以下幾種：（一）毛細(xì)管凝膠電泳（二）非凝膠基質(zhì)毛細(xì)管電泳（三）陣列毛細(xì)管電泳2023/5/26第四十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五（一）毛細(xì)管凝膠電泳CGE，Capillarygelelectrophoresis將平板電泳的凝膠移到毛細(xì)管中做支持物進(jìn)行電泳，由于電場強(qiáng)度比板凝膠電泳大大提高，使分離時間縮短約25倍；主要以聚丙烯酰胺凝膠作篩分介質(zhì)，它黏度大、抗對流，能減少溶質(zhì)的擴(kuò)散，有極好的分離效果，除用于DNA序列分析外，還可用于DNA片段的分離和PCR產(chǎn)物的分析。問題：制備凝膠柱費力；凝膠形成和電泳期間產(chǎn)生的氣泡影響分離；使用過程中焦耳熱對分離介質(zhì)的降解使毛細(xì)管的壽命縮短等。2023/5/26第五十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五（二）非凝膠基質(zhì)毛細(xì)管電泳為了避免CGE存在的問題，非凝膠基質(zhì)毛細(xì)管電泳用于DNA分析的研究越來越多；非凝膠基質(zhì)：線性聚丙烯酰胺和纖維素衍生物非凝膠基質(zhì)在DNA測序中可以更換，使毛細(xì)管的壽命延遲，在優(yōu)化條件下可獲得高效及高速的分離效果。2023/5/26第五十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五（三）陣列毛細(xì)管電泳CAE，Capillaryarrayelectrophoresis將毛細(xì)管電泳與板凝膠電泳的優(yōu)勢相結(jié)合，采用毛細(xì)管凝膠電泳的裝置，將多支毛細(xì)管并列進(jìn)行分離與檢測，以板凝膠電泳的優(yōu)勢彌補了毛細(xì)管凝膠電泳的不足，可一次檢測多個樣品；陣列毛細(xì)管電泳散熱效率高，適于高電場強(qiáng)度電泳，是一種高速、高通量的測序法；使用非凝膠基質(zhì)，毛細(xì)管壁可以抑制橫向擴(kuò)散，具有易于實現(xiàn)自動化的優(yōu)點。2023/5/26第五十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五DNA序列分析的自動化激光測序法終止標(biāo)記系統(tǒng)用4種不同的熒光染料標(biāo)記不同的ddNTP；測序反應(yīng)在同一反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，不必分成4管；反應(yīng)產(chǎn)物按終止位置的堿基不同其3’末端帶有不同的熒光基團(tuán)，被激發(fā)后產(chǎn)生不同的熒光；將反應(yīng)產(chǎn)物加樣于凝膠的同一加樣孔，電泳分離后，經(jīng)過DNA測序儀分析系統(tǒng)識別，將檢測將信號不斷傳送到計算機(jī)，通過軟件分析，自動讀出待測DNA的全部核苷酸序列。2023/5/26第五十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五激光測序法終止標(biāo)記系統(tǒng)測序原理示意圖2023/5/26第五十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五測序儀原理1.熒光標(biāo)記BigDyeTerminators--美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司專利，四色熒光分別標(biāo)記的起鏈終止劑作用的四種ddNTPs；一個反應(yīng)管中完成循環(huán)測序反應(yīng)，通過一個電泳道電泳即可完成測序任務(wù)；傳統(tǒng)雙脫氧鏈終止法：四個反應(yīng)管循環(huán)測序反應(yīng)，四個泳道電泳檢測2023/5/26第五十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五2.循環(huán)測序2023/5/26第五十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五377型遺傳分析儀310型遺傳分析儀3100遺傳分析儀

3730遺傳分析儀

2023/5/26第五十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)第二代測序技術(shù)簡介第二代測序技術(shù)2023/5/26第五十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五NextGenerationSequencingSamplefragmentationLibrarypreparationSequencingreactionDataanalysisRoche454焦磷酸測序PyrophosphateSequencingIlluminaSolexa合成測序SequencebySynthesizeABISOLiD連接法測序SequencebyLigation2023/5/26第五十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五表

目前使用最廣泛的三大第二代測序平臺測序能力統(tǒng)計信息（2010年年初數(shù)據(jù)）廠商RocheIlluminaABI技術(shù)454SolexaGASOLiD測序儀GS20FLXTiIIIIIx123序列數(shù)目（百萬）0.50.51.252810025040115320單末端測序（Single-end）讀長（bp）1002004003550100253550運行時間（天）0.250.30.4335658通量（Gb）0.050.10.515251416配對末端測序（Paired-end）3個水稻基因組/天12個水稻基因組/天10個水稻基因組/天讀長（bp）

2004002×352×502×1002×252×352×50庫序列長度（kb）

3.53.50.20.20.2332運行時間（天）

0.30.461010121016通量（Gb）

0.10.529502832Solexa和SOLiD配對末端測序所需時間和產(chǎn)出是單末端的兩倍，454的配對末端和單末端差異在于建庫方法，所需時間和測序量不變。ABISOLiD包含兩張芯片，這里的數(shù)據(jù)是一張芯片的量。2023/5/26第六十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五Roche454焦磷酸測序原理：循環(huán)芯片測序法cyclic-arraysequencing對布滿DNA樣品的芯片重復(fù)進(jìn)行基于DNA的聚合酶反應(yīng)（模板變性、引物退火雜交及延伸）以及熒光序列讀取反應(yīng)。優(yōu)勢：操作更簡易、費用更低廉、廣泛應(yīng)用。2023/5/26第六十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五原理熒光素酶硫酸化酶焦磷酸熒光素氧化熒光素可見光2023/5/26第六十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26第六十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五測序原理體外構(gòu)建好的兩端帶接頭的單鏈DNA文庫；單鏈DNA文庫在一個油包水的乳液環(huán)境中進(jìn)行PCR擴(kuò)增由于起始階段模板濃度非常低，因此大部分包含磁珠的乳液滴都只含有一種模板；經(jīng)PCR擴(kuò)增，每個磁珠只連有一種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物打破為乳液滴，收集磁珠，加入芯片中；2023/5/26第六十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五測序原理經(jīng)乳液PCR法擴(kuò)增后攜帶有大量模板的磁珠被置于芯片上的微孔中；焦磷酸法測序每一輪反應(yīng)都會摻入一個核苷酸，同時釋放一個焦磷酸；焦磷酸和腺苷酰硫酸在硫酸化酶的催化下生成ATP；熒光素酶在ATP參與下將熒光素轉(zhuǎn)化為氧化熒光素，同時發(fā)出熒光被檢測器檢測到。2023/5/26第六十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五工作流程文庫制備乳液PCR焦磷酸測序加入含酶小微珠芯片制備2023/5/26第六十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五工作流程一、樣品輸入并片段化基因組DNA、BAC等被打斷成300－800bp的片段；對于小分子非編碼RNA或者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，直接使用二、文庫制備將A和B接頭（3’和5’端具有特異性）連接到DNA片段上；接頭將用于后續(xù)的純化、擴(kuò)增和測序步驟；具有A、B接頭的單鏈DNA片段組成了樣品文庫。2023/5/26第六十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五工作流程三、一個DNA片段連接一個磁珠單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計的DNA捕獲磁珠上，每一個磁珠攜帶了一個獨特的單鏈DNA片段；磁珠結(jié)合的文庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，成為只包含一個磁珠和一個獨特片段的微反應(yīng)器。四、乳液PCR擴(kuò)增每個獨特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨立的擴(kuò)增，沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響；整個片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行；每一個片段擴(kuò)增后產(chǎn)生幾百萬個相同的拷貝；乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段結(jié)合在磁珠上。2023/5/26第六十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五工作流程五、測序攜帶DNA的捕獲磁珠（20m）隨后放入PTP板（Pico

TiterPlate）的微孔（29m）中進(jìn)行后繼的測序反應(yīng)；反應(yīng)釋放出的光信號實時被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到，有一個堿基和測序模板進(jìn)行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應(yīng)，可以準(zhǔn)確快速地確定待測模板的堿基序列六、數(shù)據(jù)分析454測序系統(tǒng)可以在10小時的運行當(dāng)中獲得100多萬個讀長，讀取超過4-6億個堿基信息；提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，適用于不同的應(yīng)用：達(dá)400MB的從頭拼接和任何大小基因組的重測序。2023/5/26第六十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五454sequencing：EmulsionPCR(emPCR)GenerationofmillionsofclonallyamplifiedtemplatesoneachbeadNocloningandcolonypickingMixDNALibrary&capturebeads(limiteddilution)“Breakmicro-reactors”IsolateDNAcontainingbeadsCreate“Water-in-oil”emulsion+PCRReagents+EmulsionOilPerformemulsionPCRAdaptercarryinglibraryDNAABMicro-reactorsAdaptercomplementEnrichAnnealSeqprimer2023/5/26第七十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五454sequencing：DepositionofDNAbeadsinto thePicoTiter?PlateCentrifugeStepLoadEnzymeBeadsLoadbeadsintoPicoTiter?Plate2023/5/26第七十一頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五454測序系統(tǒng)圖示A為液體試劑供應(yīng)裝置B為反應(yīng)池C為光線檢測成像系統(tǒng)和計算機(jī)控制系統(tǒng)2023/5/26第七十二頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五測序質(zhì)量454測序技術(shù)的準(zhǔn)確率在99%以上；其主要限制來自同聚物，也就是相同堿基的連續(xù)摻入，如AAA或GGG；由于沒有終止元件來阻止單個循環(huán)的連續(xù)摻入，同聚物的長度需要從信號強(qiáng)度中推斷出來。這個過程就可能產(chǎn)生誤差；454測序平臺的主要錯誤類型是插入-缺失。2023/5/26第七十三頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五圖a為高通量鳥槍Sanger測序法策略圖b為鳥槍循環(huán)芯片測序法策略2023/5/26第七十四頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五454測序儀的先行者地位Leamon、Rothberg等人撰寫的一篇介紹該技術(shù)的論文被引用了570多次100多篇經(jīng)過同行審議的關(guān)于人類遺傳學(xué)、代謝組學(xué)、生態(tài)學(xué)、進(jìn)化學(xué)以及古生物學(xué)的論文（peer-reviewedpublications）都是使用454測序儀開展的研究2023/5/26第七十五頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五一個4Mb基因組和3個6Mb基因組測序傳統(tǒng)的Sanger測序法：需要好幾個月的時間，454測序儀，一位實驗人員，包括樣品制備等步驟在內(nèi)所用的時間僅需要一周使用454測序儀還避免了傳統(tǒng)測序方法中細(xì)菌克隆階段可能出現(xiàn)的錯誤，獲得了高質(zhì)量的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對R207910產(chǎn)生抗藥性的兩個點突變位點，此研究成果使得人類最近的40年內(nèi)第一次找到了特異性治療結(jié)核病的藥物2023/5/26第七十六頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五2007年6月，JamesWatson的基因組序列登錄到了GenBank數(shù)據(jù)庫當(dāng)中，這是第一次使用非Sanger測序法獲得了人類個體基因組序列，且第一次將個人基因組序列公之于眾整個測序在兩個月之內(nèi)完成，花費不到100萬美元，僅占耗時10年之久的人類基因組計劃使用經(jīng)費的千分之一，Venter基因組計劃費用的百分之一2023/5/26第七十七頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五454測序儀最初的技術(shù)參數(shù)（每次可以獲得兩千萬堿基序列，測序長度100bp，準(zhǔn)確率96%）JamesWatson測序時的技術(shù)參數(shù)（一億堿基序列，250bp，99%）個體基因組測序的費用由100,000美元降低到10,000美元，繼而降低到1,000美元甚至更低2023/5/26第七十八頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五IlluminaSolexa合成測序IlluminaSolexa合成測序基本原理2023/5/26第七十九頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五ClonalSingleMoleculeArrays

單分子克隆PrepareDNAfragmentsLigateadaptersAttachsinglemoleculestosurfaceAmplifytoformclusters20micronsSequence~1000moleculesper~1μmcluster

~1000clustersper100μmsquare~40millionclustersperexperiment2023/5/26第八十頁，共八十八頁，編輯于2023年，星期五ReversibleTerminatorChemistry

可逆終止反應(yīng)All4labellednucleotidesin1reactionOPPPHNNOOcleavagesitefluor3’blockNextcycleIncorporationDetectionDeblock;fluorremovalODNAHNNOO3’O5’free3’endXOH2