形蟲三磷酸核苷水解酶基因的克隆與序列分析

形蟲三磷酸核苷水解酶基因的克隆與序列分析【摘要】目的:克隆并分析我國剛地弓形蟲三磷酸核苷水解酶的編碼基因。方法:采用聚合酶鏈反應擴增弓形蟲RH株的NTPase基因，克隆入pGEM-TEasy載體，轉化后挑取陽性克隆進行酶切與測序鑒定，并對獲得的NTPase基因及推導的氨基酸序列進行生物信息學分析。結果:PCR擴增得到特異的弓形蟲NTPase基因序列，測序結果表明，獲得的弓形蟲NTPase-Ⅱ基因全長1812bp，編碼的603個氨基酸與Genebank報道的氨基酸序列同源性為100%。經DNAStar預測NTPase-Ⅱ存在6個潛在抗原表位。結論:成功克隆出序列正確的弓形蟲NTPase-Ⅱ基因，為其相關研究奠定了基礎。

【關鍵詞】弓形蟲核苷水解酶克隆序列分析

Abstract:Objective:Tocloneandanalyzethenucleosidetriphosphatehydrolase(NTPase)geneofToxoplasmagondii.Methods:TheNTPasegenewasamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)fromRHstrainofToxoplasmagondiiandclonedintopGEM-TEasyvector.PositivecloneswerescreenedandidentifiedbyBglⅡ、HindⅢdigestionandsequenced.TheDNAsequenceanditsdeducedproteinsequencewereanalyzed.Results:TheNTPasegenewasspecificallyamplified,DNAsequenceanalysisshowedthatthelengthofclonedgenewas1812basepair.Thehomologyofthisdeducedaminoacidssequencewas100%tothatintheGenebank.Conclusion:TheNTPase-Ⅱgeneissuccessfullycloned,providingbasisforthefutureresearchaboutthisgene.

Keywords:Toxoplasmagondii;NTPase;cloning;sequencing

剛地弓形蟲是專性細胞內寄生的機會致病性原蟲，呈世界性分布。三磷酸核苷水解酶為分布于弓形蟲速殖子表面一種主要特異性抗原[1，2]，其對蟲體在宿主細胞內的寄生和繁殖都具有重要的作用。目前，國內關于弓形蟲病診斷和疫苗候選抗原的研究主要集中在P30和P22抗原[4-6]，而對NTPase的研究鮮見報道。因此，我們對弓形蟲RH株的NTPase基因進行擴增與克隆，為下一步的研究奠定基礎。

1材料和方法

蟲株和試劑弓形蟲RH株由浙江省醫(yī)學科學研究院寄生蟲病研究所惠贈；DH5α為本室保存；pGEM-TEasy載體購自Promega公司。淋巴細胞分離液購自Sigma公司；限制性內切酶BglⅡ、HindⅢ和基因組DNA提取試劑盒均為大連寶生物產品；2×PCRMasterMix試劑盒購自上海晶美生物技術有限公司；小量質粒抽提試劑盒購自寧波中鼎生物技術公司；200bpMarker及DNA凝膠回收試劑盒為上海生物工程技術有限公司產品。

模板DNA制備弓形蟲RH株速殖子連續(xù)在小鼠體內傳代，感染3d后無菌操作抽取腹水，蟲體用生理鹽水洗滌3次，加入與蟲體混懸液等量的淋巴細胞分離液，800r/min離心8min后加速至2000r/min離心10min，收集中層蟲體，按DNA提取試劑盒說明書抽提弓形蟲基因組DNA，用分光光度法測定DNA的濃度和純度。

PCR擴增根據弓形蟲NTPase參考核苷酸序列和表達載體克隆位點內切酶圖譜分析結果，采用PrimerDesigner引物設計軟件自行設計引物，由上海基康生物技術公司合成，引物序列上游引物：5‘-GAAGATCTACAGACTCATCGTCACTCCG-3‘，下游引物：5‘-GCAAGCTTTCACAGATTGTGAGAATATCC-3‘。采用2×PCRMasterMix試劑盒擴增NTPase基因，PCR反應總體積為50μl：其中含有模板DNA5μl，上下游引物各1μl。同時設立空白對照。PCR反應參數：95℃5min×1；95℃45s，58℃45s，72℃60s×30；72℃10min×1。%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠回收。

T-A克隆及測序回收的PCR產物與pGEM-TEasy載體16℃過夜連接。連接體系為10μl：純化的PCR產物3μl，2×buffer5μl，pGEM-TEasyVector1μl，T4DNA連接酶1μl。連接產物轉化感受態(tài)DH5α，吸取200μl轉化后的感受態(tài)細菌涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，篩選陽性克隆。陽性重組子經培養(yǎng)和提取質粒后，分別進行BglⅡ和HindⅢ雙酶切及PCR鑒定，并送上?；瞪锛夹g公司測序。測序結果采用DNAMAN軟件與Genebank公布的弓形蟲NTPase基因序列進行比較，并推導其編碼的氨基酸序列。對獲得的基因及其氨基酸序列的同源性、保守功能域、二級結構等進行生物信息學分析。

2結果

PCR擴增結果從弓形蟲RH株DNA模板中擴增獲得預期大小的目的條帶。

序列測定及推導的氨基酸序列的生物信息學分析

物理化學性質預測：測定的弓形蟲NTPase編碼區(qū)基因長1812bp，A+T含量為%，G+C含量為%，預測編碼603個氨基酸，理論等電點為，Mr為66900，其中含80個堿性氨基酸，78個酸性氨基酸，275個非極性疏水性氨基酸，170個極性氨基酸。獲得的NTPase編碼基因及推導的氨基酸序列見圖2。

同源性分析：用NCBI的BLASTN程序對弓形蟲NTPase編碼基因序列進行核苷酸的同源性分析，結果顯示獲得的基因序列與GenBank上提交的NTPase-Ⅱ基因同源性達100%。

抗原表位預測：用DNAStar軟件對弓形蟲NTPase-Ⅱ可能的抗原表位進行預測，NTPase-Ⅱ氨基酸序列中存在6個潛在的抗原表位。

保守功能域分析：用Expasy的ScanProsite程序分析推導的弓形蟲NTPase-Ⅱ氨基酸序列的保守功能域，發(fā)現在206～221位氨基酸具有GDA1/CD39家族的核苷磷酸酶標志。氨基酸序列中還存在cAMP、cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(aa82～85)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(aa207～210、317～320、341～344、354～357、409～412、422～425、444～447、465～468、475～478、593～596)、N末端十四酰化位點(aa47～52、208～213、239～244、254～259、303～308、324～329)、蛋白激酶C磷酸化位點(aa5～7、13～15、26～28、50～52、74～76、223～225、273～275、379～381、465～467、475～477)、酰胺化位點、N末端糖基化位點、酪氨酸激酶磷酸化位點。

二級結構預測：用Expasy的predictprotein預測，弓形蟲NTPase-Ⅱ的氨基酸二級結構α螺旋與β片層和卷曲環(huán)之比為∶∶，屬于混合型，核心氨基酸與暴露殘基之比為∶，卷曲環(huán)區(qū)與平均柔曲性高峰區(qū)基本一致。

3討論

弓形蟲NTPase是弓形蟲在宿主細胞內環(huán)境下獲得嘌呤的寄生機制而產生的，對弓形蟲的寄生和繁殖都具有重要的作用。體外研究發(fā)現，弓形蟲產生的NTPase在二巰基化合物的激活作用下，能連續(xù)水解所有的三磷酸核苷和三磷酸脫氧核苷至單磷酸形式。感染宿主細胞的弓形蟲速殖子即是利用NTPase分解宿主細胞來源的ATP，以合成維持自身生存所必需的嘌呤核苷酸。

NTPase蛋白有NTPase-Ⅰ和NTPase-Ⅱ兩種亞型，組成兩亞型的628個氨基酸中只有16個殘基不一樣，兩亞型的編碼基因有31個堿基不同且均不含有內含子。NakajimaK等曾報道，使用NTPase-ELISA試驗血清學診斷急性弓形蟲病與Sabin-Feldman標準染色試驗具有很好的相關性，且NTPase兩亞型間的抗原性并無明顯區(qū)別。Kikuchi等制備的特異性抗NTPase單克隆抗體6C6可與弓形蟲強毒力株和非毒力株的4種不同的NTPase異構酶分子均發(fā)生反應，即6C6可識別4種NTPase異構酶的共同表位[10]。NTPase-Ⅱ亞型存在于弓形蟲的所有蟲株中，且具有強抗原性和較好的免疫反應性。本實驗成功克隆出NTPase-Ⅱ基因，其測序結果與Genbank登陸序列L39079比較，核苷酸序列同源性高達100%，說明NTPase-Ⅱ為高度保守基因。本實驗預測得NTPase-Ⅱ蛋白具有6個潛在的抗原表位，為我們今后表達重組NTPase蛋白用于弓形蟲感染的免疫診斷和疫苗候選抗原的篩選奠定了基礎。

【參考文獻】

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