外源基因表達(dá)和基因工程藥物課件

RNA干擾（RNAinterference,RNAi）在生物體細(xì)胞內(nèi)，雙鏈RNA誘導(dǎo)同源mRNA特異性降解，導(dǎo)致基因表達(dá)抑制，又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNA干擾作用機(jī)制：（1）siRNA形成：

dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA（2）RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)形成（3）RISC

活化：siRNA解旋成為單鏈，無活性的RISC轉(zhuǎn)變成活性形式(包含siRNA反義鏈)（4）誘導(dǎo)靶mRNA降解：在siRNA反義鏈引導(dǎo)下，RISC識(shí)別并切割與siRNA反義鏈互補(bǔ)的靶mRNA；（5）dsRNA的再生成siRNA（小干擾RNA）：21-23nt，由長(zhǎng)dsRNA裂解而成的小片段，可誘導(dǎo)mRNA降解。siRNA主要參與抵御外源性病毒核酸的侵染。

細(xì)胞中存在兩種RNA干擾現(xiàn)象：miRNA（微小RNA）：由miRNA前體剪切而成，可抑制mRNA翻譯。miRNA主要參與內(nèi)源性基因的表達(dá)調(diào)節(jié)。RNA干擾（RNAinterference,RNAi）siRNA(小干擾RNA)

miRNA(微小RNA)來源siRNA是外源性的，是RNA干擾的中間產(chǎn)物miRNA是內(nèi)源的是生物體固有結(jié)構(gòu)siRNA是雙鏈RNAmiRNA是單鏈RNADicer酶加工過程對(duì)稱地來源于雙鏈RNA不對(duì)稱加工，僅剪切miRNA的側(cè)臂作用位置siRNA可作用于mRNA的任何部位miRNA主要作用于靶標(biāo)基因3′端非翻譯區(qū)（3’-UTR）作用方式siRNA一般導(dǎo)致靶mRNA的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。miRNA可抑制靶mRNA的翻譯，也可以導(dǎo)致靶mRNA降解，即在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平起作用作用階段siRNA不參與生物生長(zhǎng)，主要作用是抑制病毒感染miRNA主要在發(fā)育過程中起作用，調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用基因治療（基因失活性治療）（1）病毒感染性疾病

通過RNAi抑制RNA病毒復(fù)制基因功能研究（功能失活策略）（2）基因過表達(dá)引起的疾病（如腫瘤）

siRNA藥物RNA干擾技術(shù)的實(shí)施策略體外合成siRNA、體內(nèi)轉(zhuǎn)錄shRNA

基因打靶(genetargeting)利用同源重組原理對(duì)細(xì)胞特定內(nèi)源基因進(jìn)行改造的技術(shù)?；蚯贸╣eneknockout）：宿主基因組中特定功能基因的部分片段被同源的外源DNA片段替代，從而使靶基因失活。基因敲入（geneknockin）：外源功能基因與宿主基因組中的同源序列進(jìn)行同源重組，插入到基因組中，從而在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)。基因打靶（genetargeting）基因敲除小鼠的產(chǎn)生1.體外構(gòu)建基因敲除載體：靶基因同源DNA序列+選擇性標(biāo)記基因2.將基因敲除載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：顯微注射法、電穿孔法等3.篩選、鑒定發(fā)生了同源重組的ES細(xì)胞：標(biāo)記篩選法、分子鑒定法4.將ES細(xì)胞導(dǎo)入胚胎，胚胎植入假孕雌鼠的子宮5.小鼠交配傳代獲得特定的純合基因型子代小鼠Lepr8基因敲除小鼠比野生型小鼠（WT）出現(xiàn)明顯體重增加現(xiàn)象REGγ基因敲除鼠（下圖）出現(xiàn)脊椎彎曲等早衰現(xiàn)象Gab1基因敲除導(dǎo)致小鼠缺血性血管新生、側(cè)枝循環(huán)建立出現(xiàn)缺陷（圖示上半部分），主要是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成的信號(hào)調(diào)控通路出現(xiàn)障礙而引起的（圖示下半部分）。酪氨酸酶基因敲除后，本來是黑色的小豬，變成了白色，表現(xiàn)出典型的白化病特征。基因編輯（geneediting）對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、加入等。

CRISPR/Cas系統(tǒng)：由CRISPR基因座與其串聯(lián)的Cas基因組成，通過序列特異的RNA介導(dǎo)，切割降解DNA。Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/Cas9CRISPR：成簇規(guī)律間隔性短回文重復(fù)序列Cas：CRISPR相關(guān)基因RNA干擾（RNAi)siRNA、miRNARNA干擾技術(shù)策略、應(yīng)用基因敲除基因編輯常用分子生物學(xué)技術(shù)：RNA干擾、基因敲除小結(jié)作業(yè)比較RNA干擾與基因敲除的異同點(diǎn)，簡(jiǎn)述它們?cè)谒帉W(xué)中的應(yīng)用。第十一章外源基因表達(dá)與基因工程藥物基因工程藥物重組人胰島素重組人白細(xì)胞介素-2重組人干擾素外源基因表達(dá)：利用分子生物學(xué)技術(shù)，在體外將外源基因重組至合適表達(dá)載體上，通過有關(guān)技術(shù)將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞，借助宿主細(xì)胞內(nèi)系統(tǒng)，合成具有生物活性的蛋白質(zhì)?；蚬こ碳夹g(shù)：基因克隆（上游技術(shù)）+外源基因表達(dá)（下游技術(shù)）基因克隆上世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種分子生物學(xué)技術(shù)，也稱分子克隆。通過相應(yīng)技術(shù)手段，將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并在宿主細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制。按步驟可概括為∶分、切、連、轉(zhuǎn)、篩。切連轉(zhuǎn)篩獲取目的基因和載體目的基因和載體連接重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞重組體的篩選與鑒定分限制酶切割基因克隆

一、目的DNA的分離獲?。ǚ郑┒?、載體的選擇與限制酶切（切）三、目的DNA與載體連接（連）四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)）五、重組體的篩選與鑒定（篩）基因克隆五個(gè)基本部分（一）目的基因的獲得1、化學(xué)合成適用于合成分子量較小的目的基因2、PCR及RT-PCR合成序列已知的基因3、基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)包含全面的基因和mRNA信息適用于合成分子量較小的目的基因（100bp以內(nèi)），如：人生長(zhǎng)激素釋放因子、血管加壓素、干擾素、胸腺素及胰島素原的基因等。根據(jù)已知某種基因的核苷酸序列或某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列，可推導(dǎo)出為該多肽編碼的核苷酸短序列，再用DNA合成儀人工合成目的基因。1、化學(xué)合成DNA片段2、PCR與RT-PCR擴(kuò)增DNA模板上游引物下游引物PCR擴(kuò)增目的片段mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA上游引物下游引物PCR擴(kuò)增目的片段基因組文庫(kù)3、基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)3、基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)（genomiclibrary，G-文庫(kù)）是指含有某種生物全部基因隨機(jī)片段的重組DNA克隆群。

cDNA文庫(kù)（cDNAlibrary，C-文庫(kù)）

以細(xì)胞全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄，制備出全套的cDNA克隆集合。如何從文庫(kù)中獲取目的基因？文庫(kù)查詢（screening）：采用探針與文庫(kù)中的重組DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)文庫(kù)重組DNA探針雜交信號(hào)電泳后雜交反應(yīng)檢測(cè)基因組文庫(kù)特點(diǎn)：含有基因組內(nèi)全部基因片段（99％），是一個(gè)貯存基因組全部序列的信息庫(kù)（含內(nèi)含子等）；真核細(xì)胞G-文庫(kù)中含有較多的重復(fù)序列與內(nèi)含子，一個(gè)單拷貝基因只占基因組的10-7～10-5；具有種屬特異性，但無組織特異性；

cDNA文庫(kù)特點(diǎn)：

cDNA文庫(kù)中，平均一個(gè)目的基因所對(duì)應(yīng)的mRNA占總mRNA的10-4～10-3，相比之下后者比前者在含量上提高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，便于提取目的基因。體現(xiàn)實(shí)時(shí)表達(dá)的信息，不包含全部遺傳信息。既有種屬特異性，又有組織特異性；載體（vector）：攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。2.按功能克隆載體表達(dá)載體1.按來源質(zhì)粒噬菌體病毒人工染色體（二）目的基因與表達(dá)載體的重組病毒(virus)質(zhì)粒(plasmid)噬菌體(phage)載體按功能分類:克隆載體（cloningvector）表達(dá)載體（expressionvector）

克隆載體基本組成：①?gòu)?fù)制原點(diǎn)；②限制酶切位點(diǎn)；③帶有篩選標(biāo)記；表達(dá)載體還具有：④表達(dá)調(diào)控元件多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsites,MCS）：一段人工合成的DNA序列，含有密集排列的多種限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，以便不同來源的外源DNA片段插入載體。1.限制性核酸內(nèi)切酶

(restrictionendonuclease)

識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的一類核酸內(nèi)切酶，為原核生物所特有。

分類：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類基因工程技術(shù)中常用的是Ⅱ類（分子剪刀），識(shí)別與切割位點(diǎn)序列特異，在識(shí)別序列內(nèi)切割DNA重組工具酶限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1970年，第一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶定點(diǎn)剪切DNA操作DNA1978年，獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)限制性核酸內(nèi)切酶——用于切割DNAⅡ類酶識(shí)別序列（4～6個(gè)堿基對(duì)）：

——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)斷裂磷酸二酯鍵，形成平端或粘端切口平末端端或粘性末端（Cohesive/Stickyend）2.DNA連接酶一種封閉DNA鏈上缺口的酶，催化DNA鏈相鄰的3’羥基與5’磷酸基團(tuán)形成磷酸二酯鍵。基因工程“縫紉針”基因重組(generecombination)目的基因與載體分別經(jīng)DNA限制性核酸內(nèi)切酶切割，再通過DNA連接酶，將目的基因與載體以3’,5’-磷酸二酯鍵連接形成重組子（重組基因），也稱DNA重組。DNA重組1972年，世界上第一個(gè)重組DNA分子誕生PaulBerg猿猴病毒DNA噬菌體DNA限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶DNA連接酶重組DNA分子1980年，獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)DNA重組策略同一種限制酶酶切(一)粘性末端連接缺點(diǎn)：載體自身環(huán)化；連接方向錯(cuò)誤；堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）

催化去除DNA、RNA或dNTP上的

5-磷酸基團(tuán)。主要用途有：

防止載體DNA自身環(huán)化，提高重組效率。5-pCpGpC┅┅-OH3

堿性磷酸酶5-CpGpC┅┅-OH35-p3-HO5-HO3-HO堿性磷酸酶:防止載體的自身環(huán)化3

HO-G━━━━━CTTAA-p5

5p-AATTC━━━━━G-OH

3

3HO-G━━━━━CTTAA-p5

5p-AATTC━━━━━

G-OH3

質(zhì)粒目的基因

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目的基因和載體連接EcoRⅠEcoRⅠ

堿性磷酸酶3HO-G━━━━━CTTAA-OH5

5HO-AATTC━━━━━G-OH

3

退火DNA連接酶

3HO-G━━━━CTTAAG━━━━━CTTAA-p55OH–AATTC━━━━GAATTC━━━━━G-OH3

EcoRⅠ:識(shí)別GAATTC序列

（二）定向克隆使目的基因按正確方向插入載體中的方法。

定向克隆的兩種連接方式：粘－粘連接粘－平連接本法適用于在載體和目的基因上沒有相同的限制酶切位點(diǎn)（三）人工接頭(linker)化學(xué)合成的含一種或多種限制酶切位點(diǎn)的平端雙鏈寡核苷酸片段。