DB4117T 320-2021動物病原微生物實驗室菌種保存和活化技術指南

ICS65.020.99CCSB40UH4117駐馬馬市地方標準DB4117/T320—2021動物病原微生物實驗室菌種保存和活化

技術指南2021-10-29實施20212021-10-29實施駐馬店市市場監(jiān)督管理局 發(fā)布DB4117/T320DB4117/T320—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由駐馬店市畜牧局提岀。本文件歸口于駐馬店市畜牧獸醫(yī)標準化技術委員會。本文件起草單位：駐馬店市獸藥飼料（動物產品）質量檢驗監(jiān)測中心、許昌市建安區(qū)動物疫病預防控制中心、許昌市動物疫病預防控制中心、新蔡縣農業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊、三門峽市陜州區(qū)農業(yè)農村局、上蔡縣農業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊、許昌市建安區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所、上蔡縣臥龍街道辦事處社區(qū)服務中心、確山縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所、上蔡縣農業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊、泌陽縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所、泌陽縣動物疫病預防控制中心、平頂山市畜產品質量安全監(jiān)測中心、遂平縣農業(yè)農村局動物衛(wèi)生監(jiān)督所、上蔡縣農業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊、駐馬店市農業(yè)農村局、西平縣農業(yè)農村局農業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊、平輿縣農業(yè)農村局、遂平縣農業(yè)農村局、駐馬店市動物疫病預防控制中心、駐馬店市質量技術監(jiān)督檢驗測試中心、正陽縣獸藥飼料質量檢驗監(jiān)測中心、西華縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所。本文件主要起草人：馬寧、曹世杰、葛會杰、陶相宇、李佳佳、劉建華、王建軍、侯明陽、李永峰、蘇高莉、李超、吳大會、邱孜博、時海燕、張友超、陳玉霞、張琛、張峰、王旺、鄭豐、常清華、汪景慧、孫政豪、羅少偉。本文件為首次發(fā)布。動物病原微生物實驗室菌種保存和活化

技術指南1范圍本文件規(guī)定了動物病原微生物實驗室常用的菌種保藏和活化的術語和定義、要求、標準菌株菌種獲取、菌種保存、菌種活化和記錄。本文件適用于動物病原微生物實驗室菌種的保存和活化。本文件所述動物病原微生物實驗室以下均簡稱為實驗室。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27025檢測和校準實驗室能力的通用要求GB/T27476.1檢測實驗室安全第1部分：總則SN/T2660食品微生物實驗室菌種保藏方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。1菌種可以培養(yǎng)的有一定科學意義或實用價值的細菌、真菌、病毒、細胞等代表株。3.2樣本人工采集的、經(jīng)鑒定具有保藏價值的含有動物病原微生物的體液、組織、排泄物、分泌物、污染物等物質。3.3病原微生物能夠使人或者動物致病的微生物。3.4菌種保存將微生物菌種用各種適宜方法妥善保存，避免死亡、污染，保持其原有性狀基本穩(wěn)定。3.5菌種活化菌種活化就是將保藏狀態(tài)的菌種放入適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，逐級擴大培養(yǎng)得到純而壯的培養(yǎng)物。1DB4117/T320DB4117/T320—2021223.6標準菌株直接從有資質的菌種保藏機構獲得并至少定義到屬或種的水平的菌株，按菌株特性進行分類和描述。3.7代將微生物接種至新鮮培養(yǎng)基上或其中，每萌發(fā)一次即稱一代，未開啟原包裝的標準菌株通常視為第0代。4基本要求4.1動物病原微生物的保存和活化應符合《實驗室生物安全通用要求》等國家強制標準及相關政策法規(guī)要求。4.2針對動物病原微生物菌種特性選擇適宜的保存方法，宜采用兩種或兩種以上的方法保存，以保持菌種的原有性狀穩(wěn)定和避免損失。4.3動物病原微生物菌種保存所使用的器皿要求清潔、透明、無破損、無裂痕。4.4根據(jù)動物病原微生物菌種保存需要選擇適合培養(yǎng)基。4.5動物病原微生物菌種保存過程中應注意無菌操作，避免污染。4.6動物病原微生物菌種培養(yǎng)至穩(wěn)定期或成熟期后進行保存。4.7動物病原微生物菌種保存期間，要定期檢查菌種存放設施的溫度和濕度、菌株有無污染、綿塞有無霉變，如有異常應重新移植培養(yǎng)后更換。8動物病原微生物菌種保存工作不能對周圍環(huán)境造成污染和危害。5標準菌種獲取1獲取途徑5.1.1標準菌種的獲取可通過國家級菌種保藏中心或省級保藏中心獲取。5.1.2從上級機構下發(fā)的質控盲樣中分離岀的菌株，被證明結果是正確的、且從考核機構獲得該菌種的保藏機構名稱縮寫及菌種編號的/也可作為標準菌株使用。5.1.3從其他有效的，經(jīng)過資質認證的商業(yè)機構獲得原包裝的標準菌種。5.2驗收實驗室應制定標準菌株驗收控制程序，確認供貨商資質及來源，確保所獲取的標準菌株滿足要求。3標準菌種保存通常情況下，應按照制造商提供的使用說明進行保存。6工作菌種保存方法6.1定期移植法1.1適用范圍適用于大多數(shù)細菌和真菌。DB4117/T320DB4117/T320—2021#6.1.2操作步驟定期移植方法操作步驟如下：a） 接種：以無菌操作將菌株純培養(yǎng)物接種到固體培養(yǎng)基（斜面）或液體培養(yǎng)基中，接種固體培養(yǎng)基可采用點接、劃線或穿刺等方法。b） 培養(yǎng)：在所保存菌種的最適培養(yǎng)條件下將細胞培養(yǎng)至穩(wěn)定期或成熟期，并進行純度檢查。c） 保存：培養(yǎng)好的菌種于4°C?6°C保存，需室溫保存的菌種在室溫（25°C）下保存。保存培養(yǎng)基一般含較多的有機氮，糖分總量不超過2%?6.1.3保存周期每3-6個月移植一次。有特殊要求的按其規(guī)定移植。易保存于相對濕度為50%?70%的環(huán)境中。6.2液體石蠟法6.2.1適用范圍適用于部分在有氧狀態(tài)下生產良好的細菌、酵母、霉菌及放線菌。6.2.2操作步驟液體石蠟法操作步驟如下：a） 灌入石蠟：將無菌的液體石蠟在無菌條件下注入剛培養(yǎng)好的新鮮培養(yǎng)斜面培養(yǎng)物上，液面高于斜面頂部1cm左右，使菌體與空氣隔絕。b） 保存：注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態(tài)置低溫（4。?6°C）干燥處保存，需室溫保存的菌種在室溫（25°C）下保存。6.2.3保存周期保存時間為2T0年。保存期間應定期檢查，當液體石蠟減少露岀培養(yǎng)基斜面時，應及時補充滅菌的液體石蠟。如發(fā)現(xiàn)異ME重新培養(yǎng)后補上空缺。6.3冷凍干燥保存法6.3.1 適用范圍本方法適用于大多數(shù)細菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次氏體、部分絲狀真菌和酵母菌等的保存。6.3.2操作步驟冷凍干燥保存法操作步驟如下：a） 菌種準備：在所保存菌種的最適培養(yǎng)條件下將細胞采用斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等方式培養(yǎng)至穩(wěn)定期或成熟期，進行純度檢查后與保護劑混合均勻，分裝。b） 分裝：分裝菌液應在無菌條件下操作。采用較長的滴管，直接將菌液滴本安甑管或凍存管底部，每管分裝量約0.1mL?0.2mL?若是球形安甑管，裝量為半個球部。分裝后用脫脂棉堵住安甑管管口，注意不要過緊或過松。分裝時間盡量要短，最好在1h?2h內分裝完畢并預凍。c） 預凍：一般預凍2h以上，溫度達到-40°C左右。d） 冷凍干燥：將預凍后的樣品安甑瓶迅速置于已充分預冷的冷凍干燥機樣品艙內按照程序冷凍干燥。完畢后取岀樣品管置于干燥器內，備用。冷凍干燥時間一般為8h?20h。e） 安甑管封口及真空檢驗：從干燥器中取岀冷凍干燥完全的安甑管，在距管口5cm左右用噴射火焰將管拉細后將管口連接到與真空安甑管泵相連的橡皮管上，打開真空泵，在真空下用噴射火焰對準管細頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀檢驗真空度。f） 保存：封口完全的冷凍干燥管保存于4°C?10°C。6.3.3保存周期一般在10年左右。6.4瓷珠保存法6.4.1適用范圍適用于大多數(shù)微生物，如噬菌體、放線菌、絲狀真菌、霉菌等的保存。6.4.2操作步驟瓷珠保存法操作步驟如下：a） 將直徑為2mm?3mm的瓷珠分裝到小螺帽瓶中制成冷凍管，高壓滅菌。b） 在無菌狀態(tài)下打開冷凍管，在所保存菌種的最適培養(yǎng)條件下降細胞培養(yǎng)至穩(wěn)定期或成熟期，進行純度檢查后，將菌種新鮮培養(yǎng)物加入到培養(yǎng)基中制成混懸液，無菌操作將混懸液轉入到冷凍管中。c） 封好冷凍管顛倒四至五次乳化菌種培養(yǎng)基混懸液。切勿渦旋振蕩。d） 菌種吸附于瓷珠上后，將多余的混懸液吸岀；如使用商業(yè)化的細胞凍存管，此時應按照產品說明書進行操作。e） 保存：將冷凍管存于-70°C。4.3保存周期可保存10年。7菌種活化1標準菌種活化將標準菌種按說明書要求轉種于適當?shù)呐囵B(yǎng)基內，于適當溫度下培養(yǎng)適當時間，進行復蘇。宜將標準菌種懸浮于營養(yǎng)肉湯中進行復蘇。7.2保存菌種活化7.2.1定期移植法保存菌種取樣后直接接種于固體培養(yǎng)基或適量的液體培養(yǎng)基中進行活化。7.2.2液體石蠟法保存菌種恢復培養(yǎng)時，挑取少量菌體轉接在適宜培養(yǎng)基上，生長繁殖獲得第1代菌種后，挑取單菌落再重新轉接一次。7.2.3冷凍干燥法保存的菌種復蘇先用70%酒精棉擦拭管的上部，用玻璃刀劃開管頂端，用滅菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基，進行培養(yǎng)。DB4117/T320DB4117/T320—20217.2.4瓷珠保存法保存菌株在無菌條件下打開冷凍管，用無菌針或接種環(huán)取岀一粒瓷珠。封好冷凍管并盡快將其送回低溫條件下保存。將瓷珠直接接種于固體培