雙螢光素酶報告基因技術

ReportSmartly

－螢光素酶報告基因技術當前第1頁\共有70頁\編于星期三\21點

自然界的螢光

發(fā)光海星 發(fā)光甲殼蟲發(fā)光真菌發(fā)光節(jié)蟲當前第2頁\共有70頁\編于星期三\21點

自然界的螢光發(fā)光魚 發(fā)光甲蟲當前第3頁\共有70頁\編于星期三\21點

自然界的螢光螢火蟲當前第4頁\共有70頁\編于星期三\21點報告基因的作用細胞信號轉導途徑啟動子/增強子受體結合病毒/細胞相互作用轉錄因子藥物誘導作用或”效果”當前第5頁\共有70頁\編于星期三\21點熒光

-Fluorescence螢光

-LuminescenceFireWormLuminescencevs.Fluorescence當前第6頁\共有70頁\編于星期三\21點螢光（Bioluminescence）熒光（Fluorescence）是化學發(fā)光（Chemilumi-nescence）的一種，激發(fā)能量來自化學反應吸收來自光源的光，再發(fā)射另一光子螢光發(fā)光計（Luminometer）熒光計（Fluorometer）液閃儀（ScintilationCounter）

電荷耦合裝置光學成像系統(tǒng)（CCDopiticalimagingsystem）熒光顯微鏡當前第7頁\共有70頁\編于星期三\21點各種報告基因的優(yōu)點和缺點報告基因優(yōu)點缺點螢光素酶優(yōu)越的靈敏度高信號值無內(nèi)源活性需要底物?-gal靈敏度好細菌，血清等內(nèi)源活性高需要底物GUS（葡糖醛酸糖苷酶）靈敏度好植物中內(nèi)源活性低90%的E.coli,人／動物細胞中有內(nèi)源活性酶的擴散可引起“過度報告”需要底物SEAP（分泌性堿性磷酸酶）分泌性報告基因(不需裂解)在HeLa,癌和其它細胞類型中有高的內(nèi)源活性需要底物CAT（氯霉素轉乙?；福?真核細胞沒有背景表達-易于使用-設備現(xiàn)成(液閃儀,層析)放射性的靈敏度底50ｈ半衰期GFP（綠色熒光蛋白）顯微鏡:亞細胞定位不需底物背景可能高折疊“情形”可導致信號差別當前第8頁\共有70頁\編于星期三\21點螢光素酶報告基因的主要優(yōu)點非放射性檢測快（比CAT等）靈敏度高（可比CAT檢測靈敏度高100倍）半衰期短（在理想條件下，可檢測到10-20摩爾的螢光素酶分子。在哺乳動物細胞中半衰期3小時，在植物細胞中半衰期3.5小時。而CAT在哺乳動物細胞中的半衰期約50小時）線形范圍廣

（在10-16

M(10pg/L)至10-8

M(1mg/L)范圍內(nèi),光強度與螢光素酶濃度成正比）一般比顯微鏡檢測的熒光更靈敏

(對多孔板而言)生物螢光比熒光更穩(wěn)定,因為自然界進化的酶能保護光子發(fā)射器通過基因工程可以延伸生物螢光的性能和能力當前第9頁\共有70頁\編于星期三\21點螢光素酶報告基因的使用原理:制備含有l(wèi)uc/Rluc的DNA轉染提供刺激測量螢光調(diào)節(jié)序列Luc２當前第10頁\共有70頁\編于星期三\21點在活細胞中做報告基因檢測外界刺激(導引物)螢光素酶基因蛋白質折疊調(diào)節(jié)序列加工轉錄轉錄因子信號轉導翻譯反義RNA受體蛋白-蛋白相互作用RNA酶病毒感染和增殖RNAi抑制當前第11頁\共有70頁\編于星期三\21點啟動子/增強子分析“碰撞啟動子”:全序列:2)逐步缺失:Promoterluc+LightPromoterluc+LightPromoterluc+當前第12頁\共有70頁\編于星期三\21點FireflyandRenilla當前第13頁\共有70頁\編于星期三\21點

螢火蟲生物螢光的化學螢光素

+ATP+O2螢光素酶Oxyluciferin+AMP+PPi+CO2+

Light螢光素酶:

單體,61,000Daltons輔-底物:

ATP.Mg2+

螢光素:Mg2+當前第14頁\共有70頁\編于星期三\21點海腎螢光素酶反應Coelenterazine+O2螢光素酶Coelenteramide+CO2+Light螢光素酶: 單體,36,000Daltons螢光素:(Coelenterazine)當前第15頁\共有70頁\編于星期三\21點EnzymestructuresFireflyRenilla當前第16頁\共有70頁\編于星期三\21點為什么要使用雙報告基因報告基因A(首要信號)報告基因B

(第二信號)特異生物學反饋+非特異生物學反饋非特異生物學反饋檢測結果比較首要與第二信號確定特異生物學反饋當前第17頁\共有70頁\編于星期三\21點細胞可能有內(nèi)源脫乙?；?Gal或GUS活性.

CAT,-Gal和GUS檢測是終點檢測.

不能同時對在一個管中組合了螢光素酶和CAT,或-Gal,的兩個報告基因的檢測都靈敏而快速．傳統(tǒng)的雙報告基因的缺點當前第18頁\共有70頁\編于星期三\21點雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)比用CAT和?-Gal做內(nèi)對照的優(yōu)點速度樣品不需預處理，不需孵育。兩次檢測在幾秒種內(nèi)完成靈敏兩個螢光素酶的線性范圍超過7個酶濃度數(shù)量級。內(nèi)源螢光素酶背景極低方便一管完成檢測，樣品不必分份當前第19頁\共有70頁\編于星期三\21點實驗質粒對照質粒用海腎螢光素酶作對照歸一實驗變化歸一反應=對照的（海腎螢光素酶)實驗的(螢火蟲螢光素酶)螢火蟲螢光素酶海腎螢光素酶用兩個螢光素酶做報告基因（螢火蟲+海腎）當前第20頁\共有70頁\編于星期三\21點數(shù)據(jù)處理舉例第一天 螢光素酶活性(RLU) 比率 歸一的活性樣品處理重復 Ｆ Ｒ （F:R)變化倍數(shù)對照１ 5,1282,511２ 7,5533,815３ 10,5555,413

7,7453,913 1.98 1.00處理Ａ１ 5,13764,467２ 40,7123,57488,7877,654

6,02925,232 11.52 5.82處理B1 587,6355,144988,3478,8323 409,8813,564

661,9545,847 113.21 57.18第二天對照１ 15,52920,433 0.76２ 21,89730,841 0.7110,76013,620 0.79

16,06221,631 0.74 1.00處理Ｃ１ 850,23920,843

２ 578,95114,830３ 943,87321,788

791,02119,15441,30 55,81處理D1 14,86519,3-058,96712,28413,76720,246

12,53317,278 0.73 0.99

Δ活性倍數(shù) (F/R)樣品=

F/R)對照

第二天處理Ｃ計算如下：

Δ活性倍數(shù) (791,021/19,154)=

（16,062/21,631)

=55.81當前第21頁\共有70頁\編于星期三\21點GloMax?20/20

Singletubeluminometer當前第22頁\共有70頁\編于星期三\21點GloMax?96luminometer當前第23頁\共有70頁\編于星期三\21點Whitemicroplatesforluminescence當前第24頁\共有70頁\編于星期三\21點Promega公司出品的雙報告基因實驗產(chǎn)品質粒螢火蟲螢光素酶質粒海腎螢光素酶質粒叩頭蟲螢光素酶質粒檢測系統(tǒng)非均質雙報告基因檢測系統(tǒng)（通量較低）均質的雙報告基因檢測系統(tǒng)（適合高通量，自動化）當前第25頁\共有70頁\編于星期三\21點載體-螢火蟲螢光素酶載體pGL3家族pGL3-BasicpGL3-ControlpGL3-EnhancerpGL3-Promoter當前第26頁\共有70頁\編于星期三\21點pGL3-BasicMap當前第27頁\共有70頁\編于星期三\21點pGL3-ControlMap當前第28頁\共有70頁\編于星期三\21點pGL3-EnhancerMap當前第29頁\共有70頁\編于星期三\21點pGL3-PromoterMap當前第30頁\共有70頁\編于星期三\21點輔助報告基因的相對螢光單位(RLU)啟動子交叉交談或互相干擾

實驗刺激給輔助報告基因的不必要的調(diào)節(jié)

內(nèi)對照載體可能存在的問題當前第31頁\共有70頁\編于星期三\21點載體

-海腎螢光素酶報告基因載體第二代第一代phRL-nullpRL-nullphRL-TKpRL-TKphRL-TK(int-)phRL-SV40pRL-SV40phRL-CMVpRL-CMVphRG-BphRG-TK當前第32頁\共有70頁\編于星期三\21點Renilla

螢光素酶載體系列內(nèi)含子T7啟動子CMV即時早期增強子/啟動子phRL-CMV

HSVTK

啟動子phRL-TKSV40晚poly(A)

SV40早期增強子/啟動子phRL-SV40MCSphRL-nullhRL基因當前第33頁\共有70頁\編于星期三\21點

TK

啟動子phRL-TK(Int-)MCSphRG-B合成poly(A)信號轉錄停止位點三個讀碼框的終止密碼子phRG-TK合成poly(A)信號轉錄停止位點三個讀碼框的終止密碼子TK

啟動子hRL基因SV40晚poly(A)Renilla

螢光素酶載體系列當前第34頁\共有70頁\編于星期三\21點用螢火蟲和海腎兩個螢光素酶做報告基因Dual-Luciferase?雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)（非均質檢測）E1910，100次E1960，E1980，1000次Dual-GloTM螢光素酶檢測系統(tǒng)（均質檢測）E2920，10mlE2940，100mlEE2980，10X100ml當前第35頁\共有70頁\編于星期三\21點均質檢測與非均質檢測發(fā)光細胞+培養(yǎng)基添加試劑細胞+培養(yǎng)基除去培養(yǎng)基發(fā)光清洗細胞裂解細胞添加試劑均質檢測非均質檢測當前第36頁\共有70頁\編于星期三\21點Dual-Luciferase?報告基因檢測系統(tǒng)組分檢測緩沖液II底物（凍干粉）Stop&Glo?緩沖液Stop&Glo?底物,50X被動裂解液,5X當前第37頁\共有70頁\編于星期三\21點Dual-Luciferase?報告基因檢測步驟裂解細胞被動裂解除去培養(yǎng)基..PBS洗..加1XPLB,振蕩15分鐘..檢測主動裂解除去培養(yǎng)基..PBS洗..在1XPLB中刮下細胞..細胞轉移到試管或小瓶中..1-2次凍融..檢測檢測當前第38頁\共有70頁\編于星期三\21點雙螢光素酶檢測方案 1支試管2步檢測30秒鐘LuciferaseAssayReagentIIPassivelysisbufferStop&GloReagent當前第39頁\共有70頁\編于星期三\21點DLRTMForHTS當前第40頁\共有70頁\編于星期三\21點

DLR?雙報告基因檢測系統(tǒng)應用舉例

α－黑色素刺激激素(α-MSH)對由人酪氨酸酶啟動子／增強子控制的螢光素酶的表達的誘導(PromegaeNotes)目的：監(jiān)測細胞對α-MSH誘導的應答材料： 實驗載體：pGL3-Try14A:人酪氨酸酶啟動子／增強子＋Luc(+)

陽性對照：pGL3-Control

陰性對照：pGL3-Basic

內(nèi)對照：pRL-SV40

B16-F1細胞（鼠黑素瘤細胞系CRL-6323) DLR?雙螢光素酶檢測試劑盒 當前第41頁\共有70頁\編于星期三\21點步驟 前一天：接種細胞，六孔板X3 第二天：共轉染：pGL3-Try14A和pRL-SV40（分成兩組）

pGL3-Control和pRL-SV40

pGL3-Basic和pRL-SV40 裂解細胞，測量螢光

當前第42頁\共有70頁\編于星期三\21點Dual-Glo?螢光素酶檢測系統(tǒng)檢測特點均質檢測，為高通量檢測而設計螢光信號穩(wěn)定，2hrs內(nèi)檢測自發(fā)螢光低于檢測水平當前第43頁\共有70頁\編于星期三\21點Dual-GloAssay:同一樣品中檢測兩種螢光信號Stableluminescencesignalsforbothreporters

(t1/2~3.5hrs.)>10,000-foldsignalseparationbetweenthe

fireflyandRenillabioluminescencePrimaryreporter:FireflybioluminescenceSecondaryreporter:RenillabioluminescenceCellsinculturemediumAddfirefly

assayreagentAddcombinationfireflyquenchreagent

&Renillaassayreagent當前第44頁\共有70頁\編于星期三\21點Dual-Gloassay-選擇性淬滅螢火蟲螢光Selectivequenchoffireflyluminescence當前第45頁\共有70頁\編于星期三\21點Dual-Glo?螢光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒組成Dual-Glo?螢光素酶緩沖液Dual-Glo?螢光素酶底物（凍干粉）Dual-Glo?Stop-Glo?緩沖液Dual-Glo?Stop-Glo?底物當前第46頁\共有70頁\編于星期三\21點操作步驟試劑制備簡單將Dual-Glo?螢光素酶緩沖液倒入Dual-Glo?螢光素酶底物中用Dual-Glo?Stop&Glo?緩沖液按1:100稀釋Dual-Glo?Stop&Glo?底物

所有的緩沖液存于室溫,所有的底物存于–20°C兩步加入試劑:加,讀,加,讀>10,000倍信號分離(淬滅)當前第47頁\共有70頁\編于星期三\21點

用兩個螢光素酶做報告基因

Chroma-LucTM載體

Chroma-Glo?檢測試劑

當前第48頁\共有70頁\編于星期三\21點E.Coli

表達的Chroma-LucTM

基因當前第49頁\共有70頁\編于星期三\21點Chroma-LucTM

基因和載體三個基因: 1.CBRluc

–發(fā)紅光的螢光素酶 2.CBG99luc–發(fā)綠光的螢光素酶 99.0%DNA相同于CBRluc

3.CBG68luc

-發(fā)綠光的螢光素酶 68.9%DNA相同于

CBRluc兩種載體骨架: 1.對照

–置換了pGL3-Control的luc+

(pCBR-Control,pCBG68-Control,andpCBG99-Control) 2.Basic–置換了pGL3-Basic的luc+

(pCBR-Basic,pCBG68-Basic,andpCBG99-Basic)當前第50頁\共有70頁\編于星期三\21點合成的Chroma-LucTM

螢光素酶載體骨架ControlBasicEnhancerChroma-LucTM

基因SV40啟動子SV40增強子SV40增強子(合成的或天然的基因)Chroma-LucTM

基因Chroma-LucTM

基因當前第51頁\共有70頁\編于星期三\21點Chroma-Glo?檢測的化學Luciferin+ATP+O2LuciferaseOxyluciferin+AMP+PPi+CO2+LightLuciferase:

Monomeric,61,000DaltonsCo-substrates:

ATP.Mg2+

Luciferin:當前第52頁\共有70頁\編于星期三\21點不同顏色，同樣試劑？C2′C2旋轉，較少能量，紅光不旋轉，較多能量,黃綠光

當前第53頁\共有70頁\編于星期三\21點Chroma-LucTM

螢光素酶濾光片選擇510/60nm610nmLongpass當前第54頁\共有70頁\編于星期三\21點Chroma-Glo?檢測的特點為高通量檢測設計，檢測96-、384-孔板均質檢測需要帶濾光片的螢光發(fā)光計當前第55頁\共有70頁\編于星期三\21點pGL4:ANewFamilyofReporterVectors當前第56頁\共有70頁\編于星期三\21點Nextgenerationreportervectors(pGL4)ImprovedReporterPerformance當前第57頁\共有70頁\編于星期三\21點ImprovedExpressionofluc2Provides5-10xhigherexpressionthanluc+

inmammaliancellsLargereductionofconsensussiteswhereinappropriateinteractionswithhostmayoccur當前第58頁\共有70頁\編于星期三\21點Sitesremovedfromvector,reportergenes,andselectablemarkers:RestrictionsitesVertebrateTFbindingsitesPromotermodulesEukaryoticspliceacceptorand

donorsitesEukaryoticpolyAsitesKozaksequencesReductioninConsensusBindingSites當前第59頁\共有70頁\編于星期三\21點IncreasedResponseUsing

RapidResponseLuciferasesComparedtoregularluciferase,RapidResponse?luciferasesgavehigherinductioninshortertime.Inductionat3h19279150當前第60頁\共有70頁\編于星期三\21點為什么需要快速反應螢光素酶基因？

（現(xiàn)存報告基因的缺點）研究者想要報告基因應答與細胞事件在時間上更快地耦聯(lián)需要更強的應答較長的敷育時間可能導致檢測到次級效應(假陽性)RapidResponseTM

報告基因技術(不穩(wěn)定的螢光素酶基因)當前第61頁\共有70頁\編于星期三\21點細胞內(nèi)報告基因池信號新表達的報告基因為什么快速應答的報告基因應答性更強?快速應答非-快速應答新表達的報告基因信號當前第62頁\共有70頁\編于星期三\21點基于報告基因穩(wěn)定性的動力學模型當前第63頁\共有70頁\編于星期三\21點pGL4RapidResponseReportersGeneDesignVector

Gene

DesignpGL4.10[luc2] luc2pGL4.11[luc2P] luc2PpGL4.12[luc2CP] luc2CPpGL4.70[hRluc] hRlucpGL4.71[hRlucP] hRlucPpGL4.72[hRlucCP] hRlucCP

luc2hRlucluc2hPESTluc2hCL1hPESThRluchPESThRluchCL1hPEST當前第64頁\共有70頁\編于星期三\21點

快速應答報告基因的設計蛋白降解序列來自PEST鼠鳥氨酸脫羧酶的序列

(40aa)來自酵母C