全人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體的篩選與鑒定

全人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體的篩選與鑒定【摘要】目的:構(gòu)建人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體庫,從中篩選抗肝癌單鏈抗體,并對其特異性進行鑒定。方法:采用體外致敏法和EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)聯(lián)合噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建噬菌體抗體庫。對初級抗體庫進行親和富集及ELISA篩選,獲得的陽性克隆進行免疫組化鑒定并測序。結(jié)果:scFv基因與載體連接后得到庫容量為×108的初級噬菌體抗體庫。對抗體庫進行3輪正負淘選和富集后,隨機挑取2798個克隆進行ELISA,發(fā)現(xiàn)3個克隆對HepG2呈強陽性反應,而與QSG7701等人正常細胞系呈弱陽性或不反應。對克隆SA3進行免疫細胞化學鑒定,結(jié)果與ELISA一致。免疫組織化學鑒定表明SA3與肝癌組織和肝組織陽性率的差別有統(tǒng)計學意義。結(jié)論:構(gòu)建了庫容量達1×108的全人源抗肝癌噬菌體抗體庫。通過淘選富集、ELISA和免疫組織化學鑒定獲得特異性較強的噬菌體克隆,為肝癌的臨床診斷及導向治療奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】EB病毒轉(zhuǎn)化噬菌體抗體庫肝腫瘤單鏈抗體

[Abstract]AIM:Toconstructafullyhumanantihepatomasinglechainphageantibodylibrary,selecttheantihepatomascFvfromitandidentifyitscharacteristics.METHODS:AfullyhumanscFvdisplayingphagelibrarywasconstructedbyusingphageantibodylibrarytechniqueincombinationwithinvitroimmunizationandEBVtransformation.ThelibrarywassubjectedtothreeroundsofpositiveandnegativecellpanningandenrichmentandthenitwasselectedbyELISA.Thebindingspecificityofphageantibodieswithhepatomacarcinomacellswasconfirmedbyimmunohistochemistry.RESULTS:AfterscFvgenesbeingclonedintovectorFuse5andtransformedintoMC1061viaelectroporation,aphageantibodylibrarycontaining×108TU(transducedunit)wasobtainedthroughtetracyclineresistantscreening.Afterpanning,enrichmentandtestingbyELISA,3phageantibodyclonesreactingmorestronglytoHepG2thanQSG7701werepickedoutof2798clones.Oneclone,SA3,wasfurtheranalysedafterDNAsequencing.TheresultsofimmunohistochemistrywithculturedcellsweresimilartothoseofELISA.SA3reactedspecificallytohepatomacellsinmosthumanhepatomatissuesectionsbutinfewhumannormallivertissuesections.Thedistinctionofpositiveratesisofagreatstatisticalsignificance.CONCLUSION:AfullyhumanantihepatomascFvfusionphagelibraryhasbeenconstructed.ELISAandimmunohistochemistryresultsconformSA3specificallybindwithhepatomacarcinomacells.ThescFvfragmentagainsthepatomamaybefurtherdevelopedandappliedinclinicaldiagnosisandtherapyoflivercancer.

[Keywords]EBVimmortalization;phageantibodylibrary;hepatoma;scFv

肝癌是一種惡性程度極高的腫瘤,是我國和亞洲地區(qū)的常見病和多發(fā)病,病死率居惡性腫瘤的第3位[1]。肝癌90%以上為原發(fā)性,發(fā)病隱匿,發(fā)現(xiàn)時多數(shù)已處于中晚期,喪失了手術(shù)時機。目前的化療藥物由于缺乏肝癌細胞特異性而具有明顯的副作用。單克隆抗體以其特異靶向性在放射免疫診斷和導向治療方面有較大的應用價值,但其作為鼠源蛋白容易引起機體排斥反應,限制了它的臨床應用。噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)并發(fā)展成熟使獲得人源小分子抗體成為可能,它克服了mAb制備時效率低、雜交瘤體外培養(yǎng)不穩(wěn)定等缺點,便于篩選針對多種抗原的抗體,而且可以直接獲得抗體的基因序列,可以方便的通過基因工程手段進行改造并大量生產(chǎn)。為提高篩選到特異性抗體的幾率,我們實驗室創(chuàng)立了體外致敏和EBV(EpsteinBarrvirus,EBV)轉(zhuǎn)化技術(shù)聯(lián)合噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建全人源噬菌體抗體庫的技術(shù)[3,4],并篩選到了特異性抗體。本研究我們即從利用此方法構(gòu)建的抗肝癌人源單鏈抗體庫中篩選出抗肝癌細胞單鏈抗體(scFv),為肝癌的診斷和治療奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

材料絲狀噬菌體Fuse5,大腸桿菌菌株K91Kan,肝癌細胞系HepG2,肝細胞系QSG7701,臍靜脈內(nèi)皮細胞系HUVEC均由本室保存。小牛血清(NBS)為杭州四季青公司產(chǎn)品。高糖DMEM、瓊脂糖和細菌培養(yǎng)基購自Gibco/BRL公司。cDNA合成試劑盒,SfiI限制性內(nèi)切酶,PfuDNA聚合酶和T4DNA連接酶購自Fermentas公司。質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自安比奧生物技術(shù)公司。HRP標記的鼠抗M13mAb購自PharmaciaBiotech公司。20份肝癌患者外周血標本采自湖南省腫瘤醫(yī)院和湘雅二醫(yī)院,術(shù)前1d采血。43例肝癌組織石蠟切片由中南大學湘雅醫(yī)院、湘雅二醫(yī)院病理科提供,12例肝組織石蠟切片由湖南省人民醫(yī)院病理科提供。

方法

細胞常規(guī)培養(yǎng)各種細胞系均用含100mL/LNBS的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建從肝癌患者外周血分離單個核細胞(PBMC)后用肝癌細胞HepG2抗原進行體外致敏和EBV轉(zhuǎn)化。抽提轉(zhuǎn)化后B細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈,以此為模板擴增抗體可變區(qū)基因并連接成scFv,繼而克隆入載體Fuse5構(gòu)建噬菌體單鏈抗體庫。具體實驗操作參考文獻[3,4]進行。

噬菌體抗體庫的富集淘選取抗體庫1mL(含1011TU(轉(zhuǎn)化單位))用10g/LBSA溶液稀釋至2mL,在37℃依次與2瓶QSG7701細胞各孵育1h,得到遞減的噬菌體上清;將遞減上清與肝癌細胞HepG2在37℃孵育1h;棄上清,用含mL/LTween20的PBS(磷酸鹽緩沖液)沖洗細胞10次后加入2mLEbuffer,室溫下作用10min洗脫噬菌體,之后用mLNbuffer中和;洗脫的噬菌體抗體感染大腸桿菌K91Kan并鋪到含四環(huán)素(40mg/L)的LB瓊脂糖平板上,37℃培養(yǎng)16h以擴增噬菌體;擴增的噬菌體用200g/LPEG8000/NaCl沉淀后溶于mol/LPBS即為經(jīng)第1輪淘選富集后的抗體庫,并測滴度。如此進行3輪淘選富集,從第3輪淘選后涂布的LB平板上隨機挑取單克隆至含四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中,37℃220r/min振搖培養(yǎng)過夜,菌液離心后收集上清用于下一步實驗。

ELISA鑒定將培養(yǎng)的細胞接種于96孔培養(yǎng)板,以此為抗原板,克隆上清為一抗,HRP/antiM13為二抗,進行間接法ELISA,用ABTS顯色后測定A405。實驗以空白載體Fuse5為陰性對照,陽性閾值為陰性對照A405的均值與其3倍標準差之和。選擇與肝癌細胞反應強而與正常細胞弱反應或不反應的克隆進行進一步鑒定。

硫氰酸銨洗脫法陽性克隆相對親和力測定按文獻報道的方法測定陽性噬菌體克隆的相對親和力。經(jīng)NH4SCN洗脫后A405值下降至原來的50%時NH4SCN的濃度即為該抗體的相對親和力指數(shù),以mol/L表示,通過比較相對親和力指數(shù)來衡量親和力的高低。

免疫細胞化學鑒定培養(yǎng)細胞接種于無菌載玻片,待貼壁后冷丙酮固定15min。用SA3噬菌體濃縮上清為一抗,HRP/antiM13為二抗進行免疫細胞化學反應。最后用新鮮配置的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5～10min,顯微鏡下控制染色程度;蘇木素復染,10mL/L鹽酸乙醇分色,飽和碳酸鋰返藍后玻片經(jīng)梯度乙醇逐級脫水,二甲苯透明,封片,鏡檢。

免疫組織化學鑒定石蠟切片脫蠟下行至水后進入的檸檬酸鹽抗原修復緩沖液中進行微波抗原修復;30mL/LH2O2甲醇室溫孵育30min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶;其余步驟同免疫細胞化學。

DNA序列測定用質(zhì)粒小抽提試劑盒抽提噬菌體克隆SA3的DNA進行測序。

2結(jié)果

噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建抗體可變區(qū)基因連接成scFv后長度為800bp左右,scFv克隆入Fuse5后計算所構(gòu)建噬菌體抗體庫的庫容量為×108。scFv基因插入率為80%。

圖1VH和VL基因連接組裝的ScFv基因

Fig1scFvgenescombinedwithVHandVLgenes

M:DNAmarker;1-6:scFvgenes.

抗體庫的淘選和富集對初級抗體庫進行了3輪正負淘選,洗脫的噬菌體滴度測定顯示第2輪和第3輪的回收率逐級增加,說明經(jīng)過淘選后陽性克隆已得到富集。

表1各輪淘選過程中噬菌體的回收率

Tab1Therecallrateofphageineveryroundofbiopanning

Recallrate=Elutedphagetiter/Inputphagetiter.

ELISA篩選從第3輪淘選后的LB平板上隨機挑取2798個單克隆培養(yǎng),菌液離心后收集上清進行間接法ELISA檢測,HepG2陽性率為35%。但這些陽性克隆大部分與QSG7701也有不同程度的陽性反應,與HepG2反應強而與QSG7701反應弱且差別較大的克隆有3個,分別命名為SA1、SA3和SA10。

表2HepG2陽性克隆的ELISA結(jié)果

Tab2ELISAresultsofselectedantihepatomascFvfusionphageclones

NH4SCN洗脫法相對親和力測定用NH4SCN洗脫法測定了三個陽性克隆的相對親和力。SA1、SA3和SA10的相對親和力指數(shù)分別為、和mol/L。

圖2三個陽性克隆的相對親和力

Fig2Relativeaffinitiesof3phageantibodies

免疫化學鑒定根據(jù)親和力指數(shù)決定首先對克隆SA3進行鑒定。免疫細胞化學中細胞經(jīng)DAB顯色后鏡檢可見克隆SA3與肝癌細胞系HepG2呈較強陽性反應,細胞質(zhì)和細胞膜被染成較深的棕黃色,而其他細胞DAB染色不明顯,與ELISA結(jié)果相一致。免疫組織化學鑒定以切片在顯微鏡下觀察時所見的陽性細胞數(shù)的多少判斷陽性或陰性,具體標準如下:無陽性細胞著色或陽性細胞數(shù)25%為陰性;陽性細胞數(shù)25%～50%為弱陽性;陽性細胞數(shù)50%為強陽性。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)克隆SA3與大多數(shù)肝癌組織呈陽性反應,而僅與極少數(shù)肝組織呈陽性反應,陽性率差別有統(tǒng)計學意義,陽性部位主要見于細胞膜。

表3克隆SA3免疫組織化學陽性率比較

Tab3ComparisionofphagecloneSA3’spositiveratesindifferenttissues

vsnormalliver.

DNA序列測定和分析噬菌體克隆SA3DNA測序結(jié)果經(jīng)ImmunoglobinBLAST分析:SA3全長744bp,含linker序列42bp;重鏈可變區(qū)處于linker上游,輕鏈可變區(qū)處于linker下游;VH基因與人胚系基因IgVH323有%的同源性,VL基因與人胚系基因IgVL545有%的同源性。

圖3克隆SA3免疫細胞化學與免疫組織化學染色

Fig3ImmunohistochemicalstainingofcellsandtissueswithSA3

A:HepG2(×100).Cellmembraneandplasmicstainingispredominant;B:HUVEC(×100).Negativereaction;C:QSG7701(×100).Negativereaction;D:Negativecontrol(×100);E:Livercancertissue(×100).Tissuearestainedprominently;F:Livercancertissue(×300).Cellsarestainedprominently;G:Normallivertissue(×100).Tissuearestainedweakly;H:Negativecontroltissue(×100).

3討論

噬菌體抗體庫篩選方法有多種,目前文獻報道的特異性噬菌體抗體多數(shù)是由已知的純化抗原篩選得到的。但在有些情況下抗原純化是非常困難的,在這種情況下篩選抗體的難度非常大,而腫瘤抗原絕大多數(shù)都是如此,所以在很長的一段時間里噬菌體抗體庫技術(shù)沒有用來篩選腫瘤特異性抗體。但近幾年,已經(jīng)有用完整的細胞當作抗原成功篩選到針對腫瘤抗原的抗體的報道,如黑素瘤特異性抗體。為了提高從文庫中篩選出特異性抗肝癌細胞的scFv的效率,我們使用了細胞正負淘選法,即在用肝癌細胞孵育之前,首先用正常肝細胞對文庫進行吸附,以除去抗體庫中與肝細胞表面抗原有交叉反應的抗體。此方法已有不少成功的前例,如Hemminki等利用這種方法篩選到了特異性抗體。但在本研究中結(jié)果并不理想,原因可能是我們所用的抗原是完整的細胞,而細胞膜的成分極其復雜,膜抗原的有效濃度可能很低,因此噬菌體抗體的非特異性結(jié)合很多,加大了篩選的難度。

在實驗中我們所用的抗原為完整的細胞,因此所篩選抗體針對的抗原到底為何尚不確定,這就使得測定抗體親和力常數(shù)非常困難,所以本實驗只測定了3個陽性克隆的相對親和力大小,而其絕對的親和力指數(shù)尚無法檢測。而我們篩選的抗體所針對的抗原到底是何種分子也成為了進一步鑒定工作的重要內(nèi)容,否則可能直接影響其實際應用。

SA3的ELISA、免疫細胞化學結(jié)果顯示克隆SA3與肝癌細胞系HepG2呈強陽性反應,與其他細胞反應不明顯。石蠟切片免疫組化結(jié)果顯示與人肝癌組織和肝組織的陽性率差別有統(tǒng)計學意義。據(jù)此可初步判斷SA3克隆對肝癌具有良好的特異性,但其是否能用于肝癌的診治還需要后續(xù)實驗進一步的驗證。

【參考文獻】

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