細胞破碎技術(shù)論文匯總

概講細胞破碎技術(shù)細胞破碎技術(shù)的概述細胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。結(jié)合重組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進展，以前認為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。細胞破碎技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀目前已發(fā)展了多種細胞破碎方法，以便適應(yīng)不同用途和不同類型的細胞壁破碎。破碎方法可規(guī)納為機械法和非機械法兩大類。目標產(chǎn)物的分離純化在現(xiàn)代生物技術(shù)工業(yè)中占有十分重要的位置，它決定著產(chǎn)品的純度和安全性，也決定著產(chǎn)品的收率與成本。許多生物產(chǎn)物在細胞培養(yǎng)過程中不能分泌到胞外，而保留在細胞內(nèi)。破碎細胞的目的就是使細胞壁和細胞膜受到不同程度的破壞或破碎，釋放其中的目標產(chǎn)物。自20世紀80年代初重組DNA技術(shù)得到廣泛應(yīng)用以來，生物技術(shù)發(fā)生了質(zhì)的飛躍，生物產(chǎn)品的數(shù)量越來越多，許多具有重大應(yīng)用價值的產(chǎn)品應(yīng)運而生，如具有顯著醫(yī)療作用的胰島素、干擾素、生長激素、白細胞介素一2等,它們的基因分別在宿主細胞（如大腸桿菌或酵母細胞）內(nèi)克隆表達成為基因工程產(chǎn)物，從而提高了產(chǎn)量，降低了成本。很多基因工程產(chǎn)物都是胞內(nèi)物質(zhì)（如上述藥物經(jīng)克隆表達后都屬胞內(nèi)物質(zhì)），分離提取這類產(chǎn)物時，必須將細胞破壁，使產(chǎn)物得以釋放，才能進一步提取。因此細胞破碎是提取胞內(nèi)產(chǎn)物的關(guān)鍵性步驟,破碎技術(shù)的研究更加引起基因工程專家和生化工程學(xué)者的關(guān)注。常見的細胞破碎阻力不同種類的細胞結(jié)構(gòu)差別很大，破碎的難易程度也不同。由難到易的大致排列順序為：植物細胞〉真菌（如酵母菌）＞革蘭氏陽性細菌〉革蘭氏陰性細菌〉動物細胞。2?1.細菌細胞破碎阻力幾乎所有細菌的細胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）組成，它是難溶性的聚糖鏈（glycanchain），借助短肽交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細胞周圍，使細胞具有一定的形狀和強度。短肽一般由四或五個氨基酸組成，如L-丙氨酰-D-谷氨酰-L-賴氨酰-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-氨基酸與二氨基庚二酸存在。破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度，如果交聯(lián)程度大，則網(wǎng)結(jié)構(gòu)就致密。酵母菌細胞破碎阻力酵母細胞壁的最里層是由葡聚糖的細纖維組成，它構(gòu)成了細胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的形狀，覆蓋在細纖維上面的是一層糖蛋白，最外層是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯鍵共價連接，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖-酶的復(fù)合物，它可以共價連接到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，也可以不連接。與細菌細胞壁一樣，破碎酵母細胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。真菌細胞破碎阻力霉菌的細胞壁主要存在三種聚合物，葡聚糖（主要以P-1,3糖苷鍵連接，某些以p-1,6糖苷鍵連接），幾丁質(zhì)（以微纖維狀態(tài)存在）以及糖蛋白。最外層是a-和p-葡聚糖的混合物，第2層是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，葡聚糖與糖蛋白結(jié)合起來，第3層主要是蛋白質(zhì)，最內(nèi)層主要是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)的微纖維嵌入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。與酵母和細菌的細胞壁一樣，真菌細胞壁的強度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，不僅如此，它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強度有所提高。2.4?植物細胞細胞破碎阻力對于已生長結(jié)束的植物細胞壁可分為初生壁和次生壁兩部分。初生壁是細胞生長期形成的。次生壁是細胞停止生長后，在初生壁內(nèi)部形成的結(jié)構(gòu)。目前，較流行的初生細胞壁結(jié)構(gòu)是由Lampert等人提出的“經(jīng)緯”模型，依據(jù)這一模型，纖維素的微纖絲以平行于細胞壁平面的方向一層一層敷著在上面，同一層次上的微纖絲平行排列，而不同層次上則排列方向不同，互成一定角度，形成獨立的網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)成了細胞壁的“經(jīng)”，模型中的“緯”是結(jié)構(gòu)蛋白（富含羥脯氨酸的蛋白），它由細胞質(zhì)分泌，垂直于細胞壁平面排列，并由異二酪氨酸交聯(lián)成結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng)，徑向的微纖絲網(wǎng)和緯向的結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng)之間又相互交聯(lián)，構(gòu)成更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。半纖維素和果膠等膠體則填充在網(wǎng)絡(luò)之中，從而使整個細胞壁既具有剛性又具有彈性。在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，而且存在木質(zhì)素（酚類組分的聚合物）的沉積。因此次生壁的形成提高了細胞壁的堅硬性，使植物細胞具有很高的機械強度。常見的細胞破碎方法4.1機械法（1）高壓勻漿破碎法高壓勻漿器是常用的設(shè)備，它由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵用高壓原理對細胞進行擠壓和排出閥組成，排出閥具有狹窄的小孔，其大小可以調(diào)節(jié)。細胞漿液通過止逆閥進入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速沖出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速沖擊，使細胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式，也可連續(xù)操作。為了控制溫度的升高，可在進口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20r左右。在工業(yè)規(guī)模的細胞破碎中，對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。振蕩珠擊破碎法將等體積的小量組織樣品與高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋蓋微量管中，再加入緩沖液與穩(wěn)定成份到1.5ml的體積，用6500RPM振蕩機高速上下振動8秒，休息8秒，再振動8秒即可.此方法是目前最快且一次可處理最多樣品的方法.一臺機器最多可以在一天處理2400支樣品.對小量且多樣的人很方便.高速攪拌珠研磨破碎法研磨是常用的一種方法，它將細胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細胞獲得破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機。超聲波破碎法用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機械振動。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。4.2.非機械法滲透壓沖擊破碎法滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細胞放在高滲透壓的溶液中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液)，由于滲透壓的作用，細胞內(nèi)水分便向外滲出，細胞發(fā)生收縮，當達到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓毎D(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細胞快速膨脹而破裂。凍融破碎法將細胞放在低溫下冷凍(約■15°C)，然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細胞膨脹而破裂。對于細胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。酶溶破碎法酶解是利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。溶菌酶適用于革蘭氏陰性菌細胞的分解，應(yīng)用于革蘭氏陽性菌時，需輔以EDTA使之更有效地作用于細胞壁。真核細胞的細胞壁不同于原核細胞，需采用不同的酶。化學(xué)破碎法采用化學(xué)法處理可以溶解細胞或抽提胞內(nèi)組分。常用酸、堿、表面活性劑和有機溶劑等化學(xué)試劑。去垢劑破碎法蛋白質(zhì)復(fù)性利用包含體與細胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，獲得了干凈的包含體，再對包含體溶解復(fù)性。這樣首先就擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡單了。從這個角度上講，包含體的形成對分離純化亦有好處.選擇破碎細胞方法的原則破碎對象的細胞結(jié)構(gòu)，不同結(jié)構(gòu)的細胞破碎方法不同。破碎細胞過程中，對目的物的破壞程度。提取物需要的保護條件。破碎溫度。應(yīng)控制破碎溫度，以防目地物活性損傷，甚至失活。適宜的細胞破碎條件應(yīng)該從高產(chǎn)物釋放率，低能耗和便于后步分離與提取這三方面來衡量。細胞破碎技術(shù)的進展以上比較可以看出，適合大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的細胞破碎技術(shù)主要是球磨破碎、冷壓釋放破碎和高壓釋放破碎，目前已有工業(yè)規(guī)模和實驗室使用的設(shè)備，可滿足同規(guī)模的需要。而其它技術(shù)主要是在實驗室使用，但由于某些技術(shù)對特定的產(chǎn)物和生物細胞有很好的適用性，在工業(yè)上應(yīng)用也獲得了成功。因此，細胞破碎技術(shù)的選擇還需依據(jù)具體的產(chǎn)物和細胞特性與破碎技術(shù)的適應(yīng)性進行綜合考慮來決定。每種細胞破碎技術(shù)都有不足和應(yīng)用的局限性。即使工業(yè)上應(yīng)用的破碎技術(shù)，如球磨破碎、冷壓釋放破碎和高壓釋放破碎等，雖然有破碎效率高、成本低、簡便等優(yōu)點，但也有其不足，如因細胞破碎度高，胞內(nèi)含物全部釋放，大量的雜蛋白和核酸的釋放使破碎物粘度很高，給后序的固-液分離帶來困難，給產(chǎn)物分離純化增加了負擔；機械破碎的剪切力高，或因產(chǎn)生大量熱量，易造成敏感的生物活性物質(zhì)的失活?；瘜W(xué)法雖然目前主要在實驗室內(nèi)小規(guī)模應(yīng)用，大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用還存在許多問題，但也有許多獨特的優(yōu)點。因此，細胞破碎技術(shù)本身還遠未達到完善的地步，還有大量的工作可做。如納米級微生物細胞破碎機就是對細胞破碎技術(shù)的改進。近幾年有關(guān)文獻仍然不少，特別是從上游和下游以及細胞破碎技術(shù)之間的相互融合和聯(lián)系出發(fā)，發(fā)展了一些新的方法。主要從兩個方面進行改進發(fā)展：.由上游解決的技術(shù)避開細胞破碎工藝：主要是將具有融菌作用的葡聚糖酶基因?qū)胨拗?，或利用基因工程技術(shù)破壞釀酒酵母的與細胞壁形成有關(guān)的KNR4基因，使重組細胞的通透性明顯提高，可用于進行胞外蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。細胞自溶：為了省略細胞破碎工藝，采用基因修飾法，控制細胞溶解。如質(zhì)粒EclEl的自殺基因Kil的基因產(chǎn)物可使細胞完全溶解。耐高溫產(chǎn)品的基因表達：利用蛋白質(zhì)工程和基因工程使基因產(chǎn)品具有耐高溫的特性，在破碎細胞過程中，不必使用低溫冷凍系統(tǒng)，可以節(jié)省可觀的能耗，降低成本；同時其它雜蛋白因受熱變性，這可簡化后序的分離純化工藝。控制發(fā)酵和細胞培養(yǎng)條件：細胞膜壁的結(jié)構(gòu)和組成與細胞培養(yǎng)的條件，如培養(yǎng)基組成、生長期、pH、溫度、溶氧、攪拌等有著密切關(guān)系，控制適當條件即可控制細胞耐受破碎的能力。該法在理論上講比較容易，在實際使用上比較困難，需要做大量的探索工作。與下游技術(shù)相結(jié)合將細胞破碎和雙水相萃取融合，即在細胞破碎前制備細胞懸浮液時，按雙水相組成的要求加入PEG和其它成相組份，利用球磨或其它方法進行細胞破碎