引物設(shè)計初學者

引物設(shè)計初學者第一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六主要內(nèi)容背景PCR引物設(shè)計原則常用PCR引物設(shè)計軟件PrimerPremier5.0介紹Oligo6.22介紹在線Primer3介紹第二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六PCR聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。第三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六PCR引物設(shè)計引物設(shè)計是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的PCR引物容易導致實驗失敗：表現(xiàn)為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。現(xiàn)在PCR引物設(shè)計大都通過計算機軟件進行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟ňW(wǎng)頁，得到設(shè)計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設(shè)計專業(yè)軟件。第四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六引物設(shè)計的原則引物與模板的序列要緊密互補引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(即錯配)。第五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六如引物長度（primerlength），產(chǎn)物長度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformationandhairpin）的能值，在錯配位點（falseprimingsite）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點，引進突變等。具體因素第六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六一般原則引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-24bp，但不應大于38。引物過短又同時會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于16bp是必要的（不容易引起錯配）。例如：一個長度為12bp的引物在人類基因組上存在200個潛在的退火位點(3x109/412=200).而一個長度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點只有1/400個.較長的引物（28-35bp)一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點第七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六Tm值的計算一般的公式Tm=4(G+C)+2(A+T)

對于長一些的引物可用更為準確的nearest-neighbor（Frieretal.(1986)）第八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六一般原則2.引物序列在模板內(nèi)應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。

第九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六一般原則3，引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。第十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六一般原則4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推薦45-55%或50-60%第十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六一般原則5.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應當選用3’端?G值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間?G值相對較高的引物。引物的3’端的?G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應。（能值越高越容易結(jié)合）第十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六一般原則6.對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應序列而確定。

第十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六一般原則7.引物二級結(jié)構(gòu)對PCR反應的影響。盡可能少的引物二聚體。

第十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六常用的引物設(shè)計軟件Oligo6（引物評價）*PrimerPremier（自動搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在線服務(wù)）*第十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六PrimerPremier5.0的使用技巧簡介主要功能:1、即引物設(shè)計2、限制性內(nèi)切酶位點分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析第十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六簡并引物設(shè)計根據(jù)氨基酸序列來設(shè)計引物DNA引物PremierPrimer5提供了8種生物遺傳密碼使用的偏好選擇1、纖毛蟲大核（CiliateMacronuclear）2、無脊椎動物線粒體（InvertebrateMitochondrion）3、支原體（Mycoplasma）4、植物線粒體（PlantMitochondrion）5、原生動物線粒體（ProtozoanMitochondrion）6、一般標準（Standard）7、脊椎動物線粒體（VertebrateMitochondrion）8、酵母線粒體（YeastMitochondrion）第十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六PrimerPremier5.0使用介紹(1)PreimerPremier啟動界面Loadsequence第十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction第十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六引物設(shè)計界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer第二十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六引物搜索選項設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長度第二十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六搜索結(jié)果28對引物引物分值100分為滿分每對引物的信息雙擊選中一對引物第二十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer第二十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六一對理想的引物應當不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有But…第二十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六引物編輯第二十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow第二十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六SomeotherusefulfunctionofPP5第二十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六Enzyme第二十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六MeltingtemperaturegraphPer25-mer第二十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六GC%graphPer25-mer第三十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六StabilityPer5-mer第三十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六Oligo6.44使用說明主要功能：專門的引物設(shè)計軟件第三十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六Oligo6.44啟動界面Opensequencefile第三十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六3個彈出窗口Meltingtemperature第三十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六?GInternalStability第三十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六Frq為鄰近6至7個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯誤引發(fā)的可能性。第三十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六用Oligo設(shè)計引物時的3個標準Tm值曲線以選取5’到3’的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應。Frq曲線宜選用3’端Frq值相對較低的片段。ΔG值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對低第三十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六第三十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六選中引物上游引物下游引物只是示意圖第三十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六引物分析首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。第四十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六引物分析二項檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。第四十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期六引物分析第三項檢查為GC含量，以45-55％為宜。第四Falsepriming檢查第四十二頁，共四十五頁，編輯于202