細胞破碎和生化分離技術(shù)

細胞破碎和生化分離技術(shù)演示文稿當(dāng)前第1頁\共有68頁\編于星期四\7點（優(yōu)選）細胞破碎和生化分離技術(shù)當(dāng)前第2頁\共有68頁\編于星期四\7點固液分析技術(shù)當(dāng)前第3頁\共有68頁\編于星期四\7點過濾過濾就是利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮物中的固體顆粒，從而實現(xiàn)固液分離的方法。深層過濾濾餅過濾濾餅阻力主要由菌種和發(fā)酵條件決定當(dāng)前第4頁\共有68頁\編于星期四\7點改善過濾性能的方法過濾操作的兩個目標(biāo)：加快過濾速率、提高過濾質(zhì)量。絮凝助濾劑反應(yīng)劑酶解當(dāng)前第5頁\共有68頁\編于星期四\7點過濾設(shè)備及選擇依據(jù)推動力；常壓過濾機、加壓過濾機、真空過濾機依據(jù)設(shè)備構(gòu)造：板框壓濾機、鼓式真空過濾機、加壓葉濾機當(dāng)前第6頁\共有68頁\編于星期四\7點微濾微濾是一種以多孔細小薄膜為過濾介質(zhì)，以壓差為推動力，使不溶物質(zhì)濃縮過濾的操作。微濾分離過程的三階段。影響分離速率的因素主要有操作形式、流速、壓力和料液濃度。微濾技術(shù)有著廣泛應(yīng)用和眾多的優(yōu)點。當(dāng)前第7頁\共有68頁\編于星期四\7點微濾的操作模式無流動操作模式和錯流過濾操作模式當(dāng)前第8頁\共有68頁\編于星期四\7點微濾設(shè)備板框式膜過濾器管式膜過濾器中空纖維式膜分離器螺旋卷式膜分離器當(dāng)前第9頁\共有68頁\編于星期四\7點離心技術(shù)一、離心分離的基本原理二、離心機的類型三、離心方法四、離心條件的確定五、影響離心效果的主要因素與控制當(dāng)前第10頁\共有68頁\編于星期四\7點優(yōu)點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好；缺點：與過濾設(shè)備相比，設(shè)備投資高、能耗大、離心產(chǎn)生的固體濃縮物和過濾產(chǎn)生的濃縮不同。通常情況下離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體。而過濾可獲得的水分含量較低的濾餅。離心分離當(dāng)前第11頁\共有68頁\編于星期四\7點離心的原理對于濃度較小，粒徑較大，硬度較強的不溶物，可以采用過濾分離。但當(dāng)固體顆粒細小而難以過濾時，發(fā)酵液不易被過濾純化，離心操作往顯得十分有效。離心分離：是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。當(dāng)前第12頁\共有68頁\編于星期四\7點當(dāng)前第13頁\共有68頁\編于星期四\7點差速離心當(dāng)前第14頁\共有68頁\編于星期四\7點離心機的類型據(jù)分離方式分：沉降式離心機、過濾式離心機據(jù)操作方式分：間歇式(分批)離心機、連續(xù)式離心機據(jù)轉(zhuǎn)速分：常速離心機（低速離心機）、高速離心機、超速離心機據(jù)設(shè)備結(jié)構(gòu)特點分：管式、蝶式、螺旋式……

當(dāng)前第15頁\共有68頁\編于星期四\7點按速度和離心力：1、常速離心機最大轉(zhuǎn)速8000rpm(r/min)，相對離心力(RCF)104g以下，用于細胞、菌體和培養(yǎng)基殘渣等分離；2、高速（冷凍）離心機

1×104～2.5×104rpm，相對離心力104～105g，用于細胞碎片、較大細胞器、大分子沉淀物等分離；3、超速離心機

轉(zhuǎn)速2.5～8×104rpm，相對離心力5×105g；用于DNA、RNA蛋白質(zhì)、細胞器、病毒分離純化；檢測純度；沉降系數(shù)和相對分子量測定等。離心機的種類與用途當(dāng)前第16頁\共有68頁\編于星期四\7點離心方法◆對于常速離心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；◆如果希望從樣品液中分離出2種以上大小和密度不同的顆粒，需要采用差速離心方法。◆而對于超速離心，則可以根據(jù)需要采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。當(dāng)前第17頁\共有68頁\編于星期四\7點大容量冷凍離心機當(dāng)前第18頁\共有68頁\編于星期四\7點據(jù)設(shè)備結(jié)構(gòu)特點分1斜角式2平拋式3管式4蝶片式5螺旋式6多室式當(dāng)前第19頁\共有68頁\編于星期四\7點斜角式離心機是一類結(jié)構(gòu)最簡單的實驗室常用離心機，指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子；角度越大，沉降越結(jié)實，分離效果越好，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)會出現(xiàn)顆粒沉積。當(dāng)前第20頁\共有68頁\編于星期四\7點當(dāng)前第21頁\共有68頁\編于星期四\7點

平拋式離心機平拋式離心機一類結(jié)構(gòu)簡單的實驗室常用的低中速離心機，轉(zhuǎn)速一般在3000-6000rpm。轉(zhuǎn)子活動管套內(nèi)的離心管，靜止時垂直掛在轉(zhuǎn)頭上，旋轉(zhuǎn)時隨著轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動，從垂直懸吊上升到水平位置（約200—800rpm）。顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子軸向移動。樣品便于收集受振動和變速攪亂后對流現(xiàn)象小，但轉(zhuǎn)頭結(jié)構(gòu)復(fù)雜，最高轉(zhuǎn)速相對要低容量也小一些。

當(dāng)前第22頁\共有68頁\編于星期四\7點平拋式離心機轉(zhuǎn)子當(dāng)前第23頁\共有68頁\編于星期四\7點管式離心機具有一個細長而高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)鼓，轉(zhuǎn)鼓內(nèi)裝有縱向平板，其下部有進料口。上部兩側(cè)有重液相和輕液相出口(對液液分離而言)。分為液液分離的連續(xù)式管式離心機和液固分離的間歇式管式離心機。管式離心機當(dāng)前第24頁\共有68頁\編于星期四\7點液液分離管式離心機液固分離管式離心機當(dāng)前第25頁\共有68頁\編于星期四\7點液固分離管式離心機待處理的物料在一定壓力（3×104Pa左右）下由進料管經(jīng)底部空心軸進入鼓內(nèi)，靠擋板分布于鼓的四周，并使料液迅速達到與轉(zhuǎn)鼓相同的角速度。轉(zhuǎn)鼓帶動物料高速旋轉(zhuǎn)，在離心力下，懸浮液沿轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁向上流動的，料液在離心力場的作用下因其密度差的存在而分離。澄清后的液相流動到轉(zhuǎn)鼓上部的排液口排出。比重大的固體微粒逐漸沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁形成沉渣層，達到一定數(shù)量后，停機人工清除。當(dāng)前第26頁\共有68頁\編于星期四\7點管式離心機特點：結(jié)構(gòu)簡單，可提供較大離心力，轉(zhuǎn)速高，效果好。管狀離心機可以冷卻，有利蛋白質(zhì)分離對于間歇操作式，須定時拆卸、清洗適用于分離乳濁液及含細顆粒的稀懸浮液，適用于固體含量低于1%，顆粒度小于5微米，黏度大的懸浮液澄清或固液兩相密度差較小的分離。當(dāng)前第27頁\共有68頁\編于星期四\7點碟片式離心機是在管式離心機的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，在轉(zhuǎn)鼓中加入了許多重迭的碟片，縮短了顆粒的沉降距離，提高了分離效率。是生物工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的一種離心機有一個密封的轉(zhuǎn)鼓，內(nèi)裝十至上百個錐頂角為60-100゜錐形碟片。碟片間的距離一般為0.5-2.5mm。當(dāng)前第28頁\共有68頁\編于星期四\7點當(dāng)前第29頁\共有68頁\編于星期四\7點碟片式離心機工作原理當(dāng)懸浮液在動壓頭的作用下，經(jīng)中心管流入高速旋轉(zhuǎn)的碟片之間的間隙時，便產(chǎn)生了慣性離心力，其中密度較大的固體顆粒在離心力作用下向上層碟片的下表面運動，而后在離心力作用下被向外甩出，沿碟片下表面向轉(zhuǎn)子外圍下滑，而液體則由于密度小，在后續(xù)液體的推動下沿著碟片的隙道向轉(zhuǎn)子中心流動，然后沿中心軸上升，從套管中排出，達到分離的目的當(dāng)前第30頁\共有68頁\編于星期四\7點碟片式離心機類型人工排渣的碟片離心機碟片上不開孔，只有一個清液排出口。沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁上的沉渣，間歇排出。只適用于固體顆粒含量很少的懸浮液。噴嘴排渣的碟片離心機：當(dāng)固體顆粒含量較多時，可采用具有噴嘴排渣的碟式離心沉降機。在有特殊形狀內(nèi)壁的轉(zhuǎn)鼓壁上開設(shè)若干噴嘴活門（活塞）排渣的碟片離心機這是近年來開發(fā)的機型，它和相同直徑的活塞機相似，其速度可增加23%~30%,可用于酶制劑，疫苗和胰島素等生產(chǎn)中分離物的澄清。當(dāng)前第31頁\共有68頁\編于星期四\7點螺旋卸料沉降離心機有立式和臥式兩種臥螺機是一種全速旋轉(zhuǎn)，連續(xù)進料，分離和卸料的離心機。最大離心力強度可達6000rpm操作溫度可達300℃操作壓力一般為常壓常用于胰島素，細胞色素，胰酶等的分離。螺旋式離心機當(dāng)前第32頁\共有68頁\編于星期四\7點螺旋式離心機工作原理轉(zhuǎn)鼓與螺旋輸送器以一定差速同向高速旋轉(zhuǎn)(后者慢)，懸浮液通過螺旋輸送器的空心軸進入機內(nèi)中部，由進料管連續(xù)引入螺旋內(nèi)筒，加速后進入轉(zhuǎn)鼓。在離心力場作用下，固相物沉積在轉(zhuǎn)鼓壁上形成沉渣層。輸料螺旋將沉積的固相物連續(xù)不斷定推至轉(zhuǎn)鼓錐端，經(jīng)排渣口排出機外，較輕的液相物則形成內(nèi)層液環(huán)，由轉(zhuǎn)鼓大端溢流口連續(xù)溢出轉(zhuǎn)鼓，經(jīng)排液口排出機外。當(dāng)前第33頁\共有68頁\編于星期四\7點1、差速離心2、密度梯度離心3、等密梯度離心離心方法當(dāng)前第34頁\共有68頁\編于星期四\7點1、差速離心

差速離心是指采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。

※當(dāng)前第35頁\共有68頁\編于星期四\7點2、密度梯度離心

（1）定義：密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。

（2）梯度介質(zhì)：為了使沉降系數(shù)比較接近的顆粒得以分離，必須配制好適宜的密度梯度系統(tǒng)。密度梯度系統(tǒng)是在溶劑中加入一定的溶質(zhì)制成的。這種溶質(zhì)稱為梯度介質(zhì)。常用的梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系統(tǒng)，其適用范圍是：蔗糖濃度5～60%，密度范圍1.02～1.30g/cm3?！?dāng)前第36頁\共有68頁\編于星期四\7點（3）不同密度梯度條件下物質(zhì)的分離離心后形成不同大小不同形狀、具有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。當(dāng)前第37頁\共有68頁\編于星期四\7點密度梯度離心法當(dāng)前第38頁\共有68頁\編于星期四\7點（4）密度梯度的制備：密度梯度一般采用密度梯度混合器進行制備?！裘芏忍荻然旌掀饔少A液室、混合室、電磁攪拌器和閥門等組成，如圖。當(dāng)前第39頁\共有68頁\編于星期四\7點※密度梯度混合器當(dāng)前第40頁\共有68頁\編于星期四\7點（4）所形成密度梯度的類型：制備得到的密度梯度可以分為線性梯度、凹形梯度和凸形梯度等。

※當(dāng)前第41頁\共有68頁\編于星期四\7點（5）密度梯度的形成

兩種不同濃度的溶液（蔗糖溶液）以不同比例混合形成。※當(dāng)前第42頁\共有68頁\編于星期四\7點3、等密度梯度離心

當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍內(nèi)時，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆?；蛳蛳鲁两?，或向上飄浮，只要時間足夠長，就可以一直移動到與它們各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度點），形成區(qū)帶。這種方法稱為等密梯度離心，或稱為平衡等密度離心。

※當(dāng)前第43頁\共有68頁\編于星期四\7點五、影響離心效果的主要因素與控制1、樣品的理化性質(zhì)2、離心分離設(shè)備3、離心條件的選擇（1）離心力和相對離心力（2）離心時間和K因子（3）離心操作溫度當(dāng)前第44頁\共有68頁\編于星期四\7點細胞破碎技術(shù)細胞破碎的目的：使細胞壁和細胞膜受到不同程度的破壞（增大通透性）或破碎，釋放其中的目標(biāo)產(chǎn)物。機械法非機械法珠磨法、壓榨法高壓勻漿、超聲破碎、撞擊法固體剪切作用液體剪切作用1）酶溶法2）化學(xué)法3）物理法干燥處理溶胞作用超臨界細胞破碎當(dāng)前第45頁\共有68頁\編于星期四\7點機械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）：細胞懸浮液與極小的研磨劑如玻璃小珠、石英砂等一起高速攪拌，細胞與研磨劑之間相互碰撞、剪切，使細胞達到某種程度破碎，釋放內(nèi)含物可采用間歇式或連續(xù)操作珠磨機增加裝珠量、延長破碎時間、提高轉(zhuǎn)速等手段可提高破碎率→總能耗增加且須注意換熱適用于多數(shù)微生物細胞，esp.有大量菌絲體的微生物（藻類和真菌菌絲）和質(zhì)地堅硬（亞細胞器）的微生物細胞當(dāng)前第46頁\共有68頁\編于星期四\7點高壓勻漿法

破碎原理：利用高壓使懸浮液通過針形閥，從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊后，急劇釋放到低壓環(huán)境破碎作用力：突然減壓和高速沖撞閥座閥撞擊環(huán)操作參數(shù)少且易于確定，實驗室及工業(yè)生產(chǎn)中均可適用于酵母和多數(shù)細胞的破碎對易造成堵塞的團狀或絲狀真菌及一些易損傷勻漿閥、質(zhì)地堅硬的亞細胞器一般不適用當(dāng)前第47頁\共有68頁\編于星期四\7點超聲波破碎機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。缺點：A、影響因素多，細胞種類、濃度和處理時間、探頭材料和形狀；B、有效能量的利用率低；C、產(chǎn)熱大，需控溫；D、不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細胞破碎。當(dāng)前第48頁\共有68頁\編于星期四\7點機械破碎法總結(jié)以上幾種機械破碎法的作用機理不盡相同，有各自的適用范圍（包括菌體細胞、細胞發(fā)酵液的特性）和處理規(guī)模（實驗室或工業(yè)用）方法珠磨高壓勻漿超聲破碎使用規(guī)模實驗室、工業(yè)用實驗室、工業(yè)用實驗室適用對象酵母、藻類及絲狀真菌酵母菌、細菌細菌當(dāng)前第49頁\共有68頁\編于星期四\7點細胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticshock）最為溫和的一類細胞破碎方法，適用于易于破碎的細胞，eg.動物細胞和革蘭氏陰性菌。細胞于高滲介質(zhì)中，脫水達到平衡后，迅速將其轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖液中，水進入細胞使胞壁和胞膜破裂2）凍結(jié)－融化法（FreezingandThawing）細胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，反復(fù)操作多次使細胞破壞，對于存在于細胞質(zhì)周圍靠近細胞膜的胞內(nèi)產(chǎn)物釋放較為有效當(dāng)前第50頁\共有68頁\編于星期四\7點化學(xué)法破碎用某些化學(xué)試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分酸堿、某些表面活性劑及脂溶性有機溶劑都可改變細胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇性地滲透出來→化學(xué)滲透法利用酸堿調(diào)pH；有機溶劑甲苯；表面活性劑十二烷基磺酸鈉、TritonX-100；螯合劑乙二胺四乙酸EDTA等優(yōu)點：細胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清A、價格昂貴，引起新的污染；B、一般只有有限的破碎，比機械破碎速度低、效率差，常需與機械法連用。當(dāng)前第51頁\共有68頁\編于星期四\7點生物法破碎原理：利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性溶菌酶lysozyme適用于G＋的細胞壁，若配合EDTA、TritonX-100則可有效作用于G－的胞壁；真核細胞需用不同的酶：酵母細胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶；破壞植物細胞壁需用纖維素酶優(yōu)點：產(chǎn)品釋放的選擇性高、產(chǎn)品破壞少、對溫度及pH等外界條件要求低，不殘留細胞碎片等，不同的細胞壁結(jié)構(gòu)決定了需要不同的酶當(dāng)前第52頁\共有68頁\編于星期四\7點生物法破碎自溶：通過調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機溶劑等激活劑，誘使細胞產(chǎn)生溶解自身酶的方法溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法但其高成本和有限的適用性使該法不可能實現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用，esp.G-的酶溶更受到了限制當(dāng)前第53頁\共有68頁\編于星期四\7點超臨界細胞破碎技術(shù)超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上的流體，具有類似于氣體的性質(zhì)（低黏度）和類似于液體的高密度，具有較好的流動性能、傳質(zhì)性能和溶解性能利用超臨界CO2做介質(zhì)，高壓CO2易于滲透到細胞內(nèi)。突然降壓后，因細胞內(nèi)外較大的壓差使細胞急劇膨脹而發(fā)生破裂可破碎細胞壁較厚的細胞如酵母甚至對粘稠的酵母漿都有很好的破碎效果當(dāng)前第54頁\共有68頁\編于星期四\7點當(dāng)前第55頁\共有68頁\編于星期四\7點破碎方法的選擇選擇的一般原則A、提取產(chǎn)物在細胞質(zhì)內(nèi)，用機械法破碎B、提取產(chǎn)物在細胞膜附近，用化學(xué)法C、提取產(chǎn)物與細胞膜或細胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機械法結(jié)合的方法破碎過程中應(yīng)注意的問題A、多種破碎方法相結(jié)合可產(chǎn)生很大優(yōu)勢B、對下游分離技術(shù)的影響：破碎顆粒清除，產(chǎn)物分離純化C、在上游發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過程和環(huán)境對破碎難易程度影響D、菌種的培育及改造，胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物當(dāng)前第56頁\共有68頁\編于星期四\7點胞內(nèi)產(chǎn)物的選擇性釋放細胞破碎和雙水相萃取技術(shù)結(jié)合利用噬菌體裂解細胞電脈沖提取法分步、分級提取法當(dāng)前第57頁\共有68頁\編于星期四\7點雙水相分離技術(shù)雙水相萃取可以同時完成細胞碎片去除和產(chǎn)品純化任務(wù)。雙水相萃取技術(shù)設(shè)備簡單、容易放大，但需要較多的原料。當(dāng)前第58頁\共有68頁\編于星期四\7點膨脹床吸附技術(shù)通過改進吸附劑本身的物理性質(zhì)和通過對色譜柱進行精心設(shè)計，得到了穩(wěn)定、無返混的流化床，讓固體顆粒通過填料層，同時以填充床的模式吸附目標(biāo)產(chǎn)物。優(yōu)點：減少操作步驟、提高產(chǎn)品收率、降低純化費用和資本投入。當(dāng)前第59頁\共有68頁\編于星期四\7點層析柱對形成穩(wěn)定的膨脹床有很大影響，其底部和上部分別有一個液體分布器和床層調(diào)節(jié)器。選擇合適的吸附劑對產(chǎn)物吸附和維持合適膨脹度十分重要，選擇時應(yīng)注意：1、吸附劑應(yīng)具有良好的吸附性能和流態(tài)化性能。2、在粒度和密度上要有差異。當(dāng)前第60頁\共有68頁\編于星期四\7點膨脹床的操作五個步驟：當(dāng)前第61頁\共有68頁\編于