熒光染料選擇和數據分析

優(yōu)選熒光染料選擇和數據分析當前第1頁\共有73頁\編于星期四\10點熒光染料的選擇當前第2頁\共有73頁\編于星期四\10點什么是流式細胞儀在流動的狀態(tài)中檢測顆粒性物質各種物理及生物特征的一種儀器；InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid當前第3頁\共有73頁\編于星期四\10點流式細胞儀原理檢測信號散射光信號前向散射光信號(FSC)側向散射光信號(SSC)熒光信號當前第4頁\共有73頁\編于星期四\10點流式細胞儀原理散射光信號當顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC）。與激光束垂直的稱為側向角散色光信號（SSC）。當前第5頁\共有73頁\編于星期四\10點流式細胞儀原理前向角散射光信號（FSC）FSC反映細胞大小，一般來說，細胞越大，前向角散射光信號越強；FSC信號與細胞的折射率有關；可用于表示細胞的凋亡；區(qū)分死/活細胞時，可用于設門；當前第6頁\共有73頁\編于星期四\10點流式細胞儀原理側向角散射光信號（SSC）SSC信號主要反映了細胞的內部結構，內部結構越復雜，SSC信號越強；當前第7頁\共有73頁\編于星期四\10點流式細胞儀原理FSC和SSC信號用于檢測并顯示細胞的物理學特征中性粒細胞單核細胞淋巴細胞SideScatterForwardScatter0200400600800100002004006008001000當前第8頁\共有73頁\編于星期四\10點流式細胞儀原理熒光信號當熒光抗體或其他染料染色的顆粒通過激光束時，染料吸收光子躍遷到激發(fā)態(tài)，返回基態(tài)時，染料釋放出能量，大部分以光的形式釋放。這種發(fā)射出的光稱為熒光。當前第9頁\共有73頁\編于星期四\10點流式細胞儀原理當前第10頁\共有73頁\編于星期四\10點流式細胞儀原理當前第11頁\共有73頁\編于星期四\10點流式細胞儀特點及檢測標本特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現多參數分析；可檢測的樣本種類多樣(1)外周血，骨髓，細針穿刺，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細胞(2)New!血清、血漿、培養(yǎng)上清、細胞裂解液

當前第12頁\共有73頁\編于星期四\10點熒光染料選擇的必要性多色流式細胞儀的開發(fā)促進了新的熒光染料的發(fā)現及抗體標記物的發(fā)展但抗體組合選擇非常復雜，如果隨意選擇熒光素搭配的抗體，不可能得到合適的結果。在熒光染料的選擇上多一點考慮，就可避免重復實驗和錯誤的結果。當前第13頁\共有73頁\編于星期四\10點流式細胞儀原理熒光信號激發(fā)波長熒光素發(fā)射波長當前第14頁\共有73頁\編于星期四\10點了解你的儀器當前第15頁\共有73頁\編于星期四\10點基本要求-了解你的儀器試劑的選擇從了解你的儀器的配置開始激光（激發(fā)光源）：是否可以激發(fā)待選的熒光素檢測器：是否有足夠的檢測器來檢測所要用的熒光抗體組合光路設計：影響特別染料的檢測效率濾片：寬濾片提高檢測能力，但也會檢測到更多干擾光當前第16頁\共有73頁\編于星期四\10點熒光染料488nm激光激發(fā)的染料當前第17頁\共有73頁\編于星期四\10點熒光染料633nm激光激發(fā)的染料(APC)595nmand633nmEXCITEDDYES當前第18頁\共有73頁\編于星期四\10點熒光染料UV激光激發(fā)的染料當前第19頁\共有73頁\編于星期四\10點熒光染料常見熒光染料的發(fā)射波長當前第20頁\共有73頁\編于星期四\10點了解熒光素的性質當前第21頁\共有73頁\編于星期四\10點了解熒光素的相對熒光強度熒光素/單抗結合物的亮度每種熒光素的相對熒光強度不同CascadeBlueAPC-Cy7FITCPE-Cy7TexasRedPEPE-Cy5APC02468100.280.951.01.42.84.66.29.2RelativeBrightnessPositive/negativePositive/autofluorescenceCD8fluorescenceofCD3+cellsData:Dr.MarioRoederer,StanfordUniv..當前第22頁\共有73頁\編于星期四\10點了解熒光素的相對熒光強度各種熒光素在BDLSRII流式細胞儀上的染色指數當前第23頁\共有73頁\編于星期四\10點了解熒光素的相對熒光強度每種熒光素的相對熒光強度不同對一個既定的單抗來講，因為結合的熒光素不同，陽性/陰性細胞的S/N比值可相差4-6倍FITCPECy-ChromeCy7-PETexasRedAPCPharRedCascadeBlue110100110100FluorescenceIntensityRelativeNumberofCells110100110100Data:Dr.MarioRoederer;StanfordUniversityNegControlPositive(CD8-X)當前第24頁\共有73頁\編于星期四\10點了解熒光素的相對熒光強度每種熒光素的相對熒光強度不同不同儀器的激光及濾片組合不同，熒光素的相對熒光強度也不同0.11101000.11101000.11101000.11101000.11101000.11101001000FITCPECy-ChromePerCPPharRedAPCVantage8922213620562104Calibur10935920915023927當前第25頁\共有73頁\編于星期四\10點了解熒光素的相對熒光強度F/P比值抗體上熒光素分子的多少（F/P）也會影響相對的熒光強度。FITC和PerCP的結合物通常一個抗體分子上結合幾個（2-9個，依抗體而定）熒光素分子。APC和PE與抗體結合一般是1：1。復合染料PE-CY7和APC-CY7一般一個PE/APC分子結合多個CY7分子，一個PE/APC分子與抗體1：1結合與之相反的是，復合染料PerCP-CY5.5，PerCP與CY5.5的比例是1：1因為熒光素結合的化學因素的關系，IgM抗體一般與小分子的熒光素聯結，如FITC、Texas-Red、CY3、CY5。當前第26頁\共有73頁\編于星期四\10點復合熒光染料-TandemdyeIsolateddonorDonordistancetoogreatDonordistancecorrect當前第27頁\共有73頁\編于星期四\10點復合熒光染料被激發(fā)的Donor熒光素將能量轉移給受者acceptor,需要滿足條件:Donor的發(fā)射波長與acceptor的激發(fā)波長有重疊Donor和Acceptor分子之間的距離不能太遠(＜100A)當前第28頁\共有73頁\編于星期四\10點復合熒光染料FluorescenceResonanceEnergyTransferIntensityWavelengthAbsorbanceDONORAbsorbanceFluorescenceFluorescenceACCEPTORMolecule1Molecule2當前第29頁\共有73頁\編于星期四\10點熒光染料多色分析當前第30頁\共有73頁\編于星期四\10點熒光素的選擇原則當前第31頁\共有73頁\編于星期四\10點選擇熒光素需要考慮抗原的密度高表達的抗原可選擇幾乎所有的熒光素低密度表達的抗原需要可提供較高S/N比值的熒光素如PE/APC當前第32頁\共有73頁\編于星期四\10點選擇熒光素需要考慮自發(fā)熒光每種細胞群都有不同水平的自發(fā)熒光所有的熒光通道均可觀察到自發(fā)熒光，但自發(fā)熒光強度在波長較長時迅速降低。對自發(fā)熒光較強的細胞，選擇發(fā)射波長長的熒光素（如APC）可得到較好的S/N比值。對自發(fā)熒光比較弱的細胞，發(fā)射波長長的熒光素對S/N提高沒有明顯的改善?？蛇x用FITC。當前第33頁\共有73頁\編于星期四\10點選擇熒光素需考慮非特異結合許多熒光抗體可產生低水平的非特異結合，使陰性細胞群的熒光超出自發(fā)熒光。非特異結合由下列因素引起單克隆抗體的同型抗體：一些IgG同型抗體可能與一些細胞上的Fc受體結合所用的熒光素羰花青染料（如CY3、CY5、CY5.5、CY7）和Tex-Red直標的抗體及一些復合染料標記的抗體在標記某些亞群的細胞時有時會提高結合率。對CY5來說，是因為該染料與低親和力FC受體的極低親和力相互作用。這也是復合染料PE-CY5的特性。當前第34頁\共有73頁\編于星期四\10點選擇熒光素需考慮復合染料：小心信號衰退復合染料因為光、固定劑或溫度升高會致信號衰退，使復合染料在上一級染料處發(fā)光。該種現象從一小部分亞群開始，導致APC或PE染色細胞群假陽性。減少樣本暴露于光、高溫或固定劑，可很大程度上避免這一問題。選擇染料時要考慮：復合染料的信號衰退會不會降低APC或PE的靈敏度。如果是，就要選擇另外的試劑搭配。如果樣本需要固定，要選擇穩(wěn)定的固定劑，可有效阻止復合染料的信號衰退。BD：338036當前第35頁\共有73頁\編于星期四\10點選擇熒光素需考慮儀器配置的差異，多色分析不可能全選“最亮”的熒光素，但對于特定的一款儀器，可以根據熒光的強弱列出可選的染料亮度的判斷：就是熒光染料的靈敏度，區(qū)分背景和弱陽性信號的能力影響背景的因素有檢測器的電子噪音、細胞自發(fā)熒光、來自其他檢測器的信號干擾，這些因素也增加了陰性熒光峰的寬度（標準差）當前第36頁\共有73頁\編于星期四\10點靈敏度好的標準是染色指數：D／W，D指的是陽性峰與陰性峰的平均熒光強度的差；W是陰性峰的2SD。當前第37頁\共有73頁\編于星期四\10點選擇熒光素需考慮熒光信號之間的干擾，會增加信號檢測背景熒光信號強細胞群體的SD比熒光信號弱的細胞群體大。多色分析時，一種熒光素（如FITC）的光會漏入相鄰的熒光素（如PE）的檢測器。漏入的光越多，需要補償的越多，對分辨率的影響越大。尤其是弱表達的信號。當前第38頁\共有73頁\編于星期四\10點選擇熒光素需考慮多色熒光信號之間的干擾當前第39頁\共有73頁\編于星期四\10點選擇熒光素需考慮多色熒光信號之間的干擾IFNAPC+CD8APC-CY7+CD4PE+IL-2PE-CY7當前第40頁\共有73頁\編于星期四\10點選擇熒光素需考慮多色熒光信號之間的干擾IFNAPC+CD4PE+IL-2PE-CY7當前第41頁\共有73頁\編于星期四\10點選擇熒光素需考慮多色熒光信號之間的干擾當前第42頁\共有73頁\編于星期四\10點選擇熒光素需考慮多色熒光信號之間的干擾當前第43頁\共有73頁\編于星期四\10點選擇熒光素需考慮多色熒光信號之間的干擾當前第44頁\共有73頁\編于星期四\10點選擇熒光素需考慮盡量減少熒光信號之間的干擾檢測的顏色越多，面臨的熒光信號之間的干擾越多選擇試劑組合時盡可能降低熒光發(fā)射波長之間的重疊當前第45頁\共有73頁\編于星期四\10點組合熒光素選擇常見的6、8、10色熒光染料組合當前第46頁\共有73頁\編于星期四\10點設立對照，以證實試劑組合有效真實性對照（fidelitycontrol）：單一的熒光抗體染色與試劑組合染色結果比較，以確保試劑組合中的其它試劑不影響結果。減去一個熒光對照（Fluorescence-minus-onecontrol,FMO）：除去一個熒光抗體，將其他所有試劑組合在一起。當前第47頁\共有73頁\編于星期四\10點熒光素選擇原則上述原則可能相互沖突，但要取得平衡以得到最佳結果。原則1：選擇適合儀器配置的最“亮”的熒光染料原則2：選擇光譜重疊最少的熒光素原則3：為最“暗”的抗體選擇最“亮”的熒光素，反之亦然原則4：盡量避免“亮”細胞群的光漏入對靈敏度要求高的細胞群的檢測器中原則5：采取步驟，避免復合染料信號衰退，考慮到可能對結果造成的影響。當前第48頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析當前第49頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析檢測指標陽性百分率（%）絕對計數（個/L）平均熒光強度（MFI）當前第50頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析直方圖和點圖當前第51頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析設門用來限定感興趣的細胞群；FSCvsSSC點圖是傳統(tǒng)上用于設門的圖；分析淋巴細胞群時，CD45vsSSC點圖設門更優(yōu)于FSCvsSSC點圖設門；當前第52頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析設門-確定要分析的目的細胞群當前第53頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析設門SideScatterForwardScatter0200400600800100002004006008001000R1當前第54頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析設門100101102103104SSC-HeightR1CD3-PE100101102103104100101102103104Anti-HLA-DRFITCGatedonR1100101102103104CD25-PE當前第55頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析對照樣本檢測樣本當前第56頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析直方圖統(tǒng)計表當前第57頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析檢測樣本當前第58頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析對照樣本檢測樣本當前第59頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析點圖統(tǒng)計表當前第60頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析對照樣本當前第61頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析當前第62頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析當前第63頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析時遇到的問題陽性峰與陰性峰分界明顯根據陰性對照設陽性和陰性界限允許假陽性率一般少于2%可記錄陽性百分比和平均熒光強度圖1當前第64頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析時遇到的問題對照管直方圖左側與檢測管重疊，但檢測管直方圖右側有肩峰在兩曲線分離處設一界限；從陽性曲線減去陰性曲線所致假陽性的百分比；可記錄陽性百分比（近似值）和平均熒光強度，或弱陽性圖2當前第65頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析時遇到的問題對照管與檢測管直方圖形狀相同，但檢測管直方圖右移此結果不可設界限可記錄平均熒光強度排除非特異染色調整抗體滴度確認圖3當前第66頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析時遇到的問題組合圖形需要設界限，設在陽性管弱陽性返回基線處；界限右側為強陽性，可報百分比；弱陽性的分析見上述原則3圖4當前第67頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析時遇到的問題陽性細胞群與陰性細胞群分群明顯，且位于所在象限內以陰性對照設界線，允許其它三象限內假陽性率小于2%；可記錄陽性百分比，強陽性或平均熒光強度圖5當前第68頁\共有73頁\編于星期四\10點數據分析時遇到的問題陽性群與陰性群區(qū)分明顯，但陽性群部分跨兩象限單陽性部分使用圖5原則雙陽性部分，根據細胞群走向，使用圖7/圖8原則圖6當前第69