補(bǔ)體的檢測(cè)及應(yīng)用

（優(yōu)選）補(bǔ)體的檢測(cè)及應(yīng)用當(dāng)前第1頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)第四節(jié)補(bǔ)體受體的測(cè)定第五節(jié)補(bǔ)體測(cè)定的應(yīng)用

思考題小結(jié)當(dāng)前第2頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)補(bǔ)體：具酶樣活性、不耐熱的糖蛋白其存在與抗原性異物的刺激無(wú)關(guān)在正常人血清中含量相對(duì)穩(wěn)定某些疾病時(shí)，含量及其活性可發(fā)生改變可輔助抗體發(fā)揮溶細(xì)胞作用。補(bǔ)體系統(tǒng)廣泛參與機(jī)體的抗感染防御反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)，也可介導(dǎo)免疫病理的損傷性反應(yīng)，是體內(nèi)具有重要生物學(xué)作用的效應(yīng)放大系統(tǒng)。當(dāng)前第3頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)補(bǔ)體不是單一成分，其在功能效應(yīng)上是以連續(xù)反應(yīng)的程序進(jìn)行的，故又稱為補(bǔ)體系統(tǒng)。當(dāng)前第4頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)1.補(bǔ)體系統(tǒng)的組成（1）補(bǔ)體固有成分：存在于體液中，參與補(bǔ)體激活過(guò)程的補(bǔ)體成分。（2）補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白：指參與調(diào)控補(bǔ)體活化的抑制因子或滅活因子。（3）補(bǔ)體受體：是清除免疫復(fù)合物，凈化機(jī)體內(nèi)環(huán)境的重要膜性成分。一、補(bǔ)體系統(tǒng)當(dāng)前第5頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)2.補(bǔ)體成分的含量補(bǔ)體大多為糖蛋白，屬β球蛋白，

C1q、C8等為γ球蛋白，C1S、C9為α球蛋白。正常血清中各補(bǔ)體成分成分含量相差較大。當(dāng)前第6頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)3.補(bǔ)體理化性質(zhì)由肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及腸粘膜上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生均為多糖蛋白，大多數(shù)電泳遷移率屬α、γ球蛋白含量約占血清球蛋白總量的10%，其中C3含量最高、D因子含量最低固有成份間的分子量差異較大，其中C1q最大、D因子最小。對(duì)熱不穩(wěn)定，56°C、30min即被滅活，0～10°C條件下活性只能保持3～4d。多種理化因素如射線、機(jī)械振蕩、酒精、膽汁和某些添加劑等均可破壞補(bǔ)體當(dāng)前第7頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)補(bǔ)體成分分子量電泳區(qū)帶血清含量參考值（μg/ml）補(bǔ)體成分分子量電泳區(qū)帶血清含量參考值（μg/ml）C1q390γ270C979α240C1r95β35B95β210~240C1s85α35D25α2C2117β120~30P220γ225C3190β11300C1INH150α180C4180β2430~600C4bp1100250C5190β275I因子93β50C6128β260H因子159β400~480C7120β255S因子88α500C8163γ1200當(dāng)前第8頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)經(jīng)典途徑補(bǔ)體的活化途徑當(dāng)前第9頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)當(dāng)前第10頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)經(jīng)典激活途徑替代激活途徑MBL途徑激活物質(zhì)抗原抗體復(fù)合物肽聚糖、酵母多糖、脂多糖MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶起始分子C1qC3C2、C4參與補(bǔ)體成分C1、C4、C2、C3、C5-C9C3、C5-C9、B因子、D因子C2-C9、MASP所需離子Ca2+、Mg2+Mg2+Ca2+C3轉(zhuǎn)化酶C4b2bC3bBbC4b2bC5轉(zhuǎn)化酶C4b2b3bC3bnBbC4b2b3b生物學(xué)作用參與特異性免疫的效應(yīng)階段,感染后期發(fā)揮作用參與非特異性免疫的效應(yīng)階段,感染早期發(fā)揮作用參與非特異性免疫的效應(yīng)階段,感染早期發(fā)揮作用三種途徑比較當(dāng)前第11頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)二、補(bǔ)體的生物學(xué)作用1.補(bǔ)體的細(xì)胞溶解作用；2.調(diào)理和免疫粘附作用；3.炎癥介質(zhì)作用；4.清除免疫復(fù)合物的作用；5.免疫調(diào)節(jié)作用。當(dāng)前第12頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)第一節(jié)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complementfixationtest，CFT)

將免疫溶血作為指示系統(tǒng)，用以檢測(cè)另一反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的傳統(tǒng)方法。當(dāng)前第13頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)試驗(yàn)原理作用原理：利用補(bǔ)體的溶細(xì)胞作用進(jìn)行各種物理狀態(tài)的抗原抗體測(cè)定。5種成分，3個(gè)系統(tǒng)反應(yīng)系統(tǒng)：已知抗原（或抗體）與待測(cè)抗體（或抗原）補(bǔ)體系統(tǒng)指示系統(tǒng)：SRBC與相應(yīng)溶血素。試驗(yàn)時(shí)常將其預(yù)先結(jié)合，成為致敏綿羊紅細(xì)胞（sensitizedsheepredbloodcell,SRBCS）。當(dāng)前第14頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)反應(yīng)分兩步進(jìn)行

第一步:反應(yīng)系統(tǒng)與補(bǔ)體的作用

第二步:指示系統(tǒng)利用剩余補(bǔ)體的反應(yīng)不溶血為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽(yáng)性，而溶血為試驗(yàn)陰性當(dāng)前第15頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)試驗(yàn)雖然敏感度高，特異性強(qiáng)，但缺點(diǎn)較多：1.參與反應(yīng)的5種成分必須逐步仔細(xì)滴定,否則難以取得預(yù)期效果,操作麻煩;2.補(bǔ)體不穩(wěn)定,難以標(biāo)準(zhǔn)化;3.抗體或抗原可能有抗補(bǔ)體作用,所以,目前臨床上已很少用.當(dāng)前第16頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)第二節(jié)補(bǔ)體總活性測(cè)定補(bǔ)體總活性測(cè)定方法是以紅細(xì)胞的溶解為指示，以50%溶血為判斷終點(diǎn)，稱為CH50補(bǔ)體活化途徑不同，應(yīng)用不同的激活物可活化不同的補(bǔ)體途徑基于經(jīng)典途徑的CP-CH50（臨床常規(guī)項(xiàng)目）應(yīng)用于C3旁路檢測(cè)的AP-CH50（尚未列入檢驗(yàn)常規(guī)）MBL途徑活性測(cè)定的可靠方法暫未建立當(dāng)前第17頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)（一）CH50測(cè)定法的原理

應(yīng)用綿羊紅細(xì)胞（sheepredbloodcell,SRBC）和其相應(yīng)的抗體（溶血素），作為能誘導(dǎo)補(bǔ)體活化經(jīng)典途徑的指示物和激活劑。補(bǔ)體能使溶血素特異性結(jié)合的綿羊紅細(xì)胞溶解，當(dāng)溶血素和綿羊紅細(xì)胞濃度恒定時(shí)，溶血程度與補(bǔ)體含量和活性相關(guān)。將新鮮待檢血清作不同稀釋后，加入反應(yīng)體系，測(cè)定溶血程度，以50%溶血時(shí)的最小血清用量作為判定終點(diǎn)，可測(cè)知補(bǔ)體總?cè)苎钚浴．?dāng)前第18頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)溶血程度與補(bǔ)體含量的關(guān)系

在適當(dāng)、穩(wěn)定的反應(yīng)系統(tǒng)中，溶血反應(yīng)與補(bǔ)體的劑量依賴關(guān)系呈現(xiàn)“S”形曲線在輕微溶血和接近完全溶血時(shí)，補(bǔ)體量的變化對(duì)溶血程度的影響不大，即溶血對(duì)補(bǔ)體量的依賴不敏感。但在30％～70%溶血時(shí)，補(bǔ)體含量?jī)H出現(xiàn)較小的變動(dòng)，溶血程度也會(huì)發(fā)生較大的改變當(dāng)前第19頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)（二）CH50測(cè)定方法1.紅細(xì)胞濃度的調(diào)整綿羊紅細(xì)胞（SRBC）采自綿羊頸靜脈，制備脫纖維羊血或用阿氏（Alsever）血液保存液制成抗凝血，4℃保存?zhèn)溆?。使用前，調(diào)制成2%～5%SRBC懸液。為使紅細(xì)胞濃度標(biāo)準(zhǔn)化，可吸取少量紅細(xì)胞懸液，加入20～30倍的稀釋液，在542nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值以調(diào)整紅細(xì)胞濃度。

當(dāng)前第20頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)2.溶血素滴定溶血素可通過(guò)SRBC免疫家兔獲得，一般無(wú)需純化試驗(yàn)前需先行加熱56℃30min或60℃3min以滅活補(bǔ)體溶血素有商品銷售，可按標(biāo)識(shí)效價(jià)稀釋使用自行制備的溶血素需進(jìn)行滴定，確定使用濃度，在補(bǔ)體活性測(cè)定中，大多使用2個(gè)單位。溶血素效價(jià)穩(wěn)定，一般使用3個(gè)月后再作重新滴定當(dāng)前第21頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)

3.稀釋緩沖液4.50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管

5.50%溶血總補(bǔ)體值的計(jì)算當(dāng)前第22頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)（三）方法評(píng)價(jià)與臨床意義方法簡(jiǎn)便、快速，但敏感性低，補(bǔ)體的活性除與反應(yīng)體積成反比外，還與反應(yīng)所用的緩沖液、SRBC的數(shù)量以及反應(yīng)溫度有關(guān)?？傃a(bǔ)體活性的參考范圍為50～100U/mlCH50增高見(jiàn)于：急性炎癥、組織損傷、惡性腫瘤等。CH50降低見(jiàn)于：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎、急性腎小球腎炎等，細(xì)菌感染，尤其是G-感染時(shí)，嚴(yán)重肝病、肝壞死時(shí)降低。當(dāng)前第23頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)（四）APH50測(cè)定未致敏的家兔Rbc可激活血清中的B因子，引起旁路途徑活化，導(dǎo)致家兔Rbc溶解，當(dāng)Rbc量一定時(shí)，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，溶血程度與血清中參與旁路激活的補(bǔ)體量及活性呈正相關(guān)。

當(dāng)前第24頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)第三節(jié)單個(gè)補(bǔ)體成分的測(cè)定常作為單個(gè)補(bǔ)體成分的檢測(cè)指標(biāo)：C3、C4、C1q、B因子和C1酯酶抑制物等測(cè)定方法：免疫溶血法（檢測(cè)單個(gè)補(bǔ)體成分的活性）免疫化學(xué)法（檢測(cè)單個(gè)補(bǔ)體成分的含量）自動(dòng)化免疫散射比濁法當(dāng)前第25頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)一、C3含量測(cè)定單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（目前常用免疫比濁法測(cè)定C3含量）

C3含量的參考范圍為：男性0.86—2.52g/L；女性0.86—2.06g/L；C3含量降低見(jiàn)于：反復(fù)感染，急性腎小球腎炎，免疫復(fù)合病和膜增生性腎小球腎炎。當(dāng)前第26頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)二、C4活性測(cè)定免疫溶血法；C4活性的參考范圍為：7898.67±1893.40U/mlC4含量降低見(jiàn)于：遺傳性血管性水腫發(fā)作時(shí)，C4含量極低（先天性補(bǔ)體C4缺陷）；原發(fā)性混合性冷球蛋白癥患者C4降低。當(dāng)前第27頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)第五節(jié)補(bǔ)體受體的測(cè)定補(bǔ)體受體：

存在于多種細(xì)胞清除免疫復(fù)合物、凈化機(jī)體內(nèi)環(huán)境檢測(cè)補(bǔ)體受體，有助于判斷機(jī)體抗感染能力和計(jì)數(shù)相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量當(dāng)前第28頁(yè)\共有30頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)補(bǔ)體測(cè)定的應(yīng)用補(bǔ)體相關(guān)試驗(yàn)：

診斷梅毒螺旋體感染的華氏反應(yīng)（已淘汰）HLA分型的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒試驗(yàn)抗原抗體檢測(cè)的脂質(zhì)體免疫試驗(yàn)、免疫粘連血凝試驗(yàn)抗體形成細(xì)胞