結核病的實驗室診斷技術及應用演示

（優(yōu)選）結核病的實驗室診斷技術及應用課件當前第1頁\共有54頁\編于星期三\13點全球范圍內結核病疫情急劇惡化

全球1/3人口（約20億）已感染了結核菌，人口的大規(guī)模流動

結核病與艾滋病同時流行結核菌耐多藥菌株的出現(xiàn)我國是世界上僅低于印度和印尼的第三結核病大國

患病率高，新發(fā)患者93萬/年，結核菌感染率為約40％

死亡率高，每年死亡人數(shù)達13萬

耐藥率高早期快速診斷與治療成為制約結核病防控的關鍵因素

常規(guī)結核病實驗室檢測方法診斷陽性率不到60％。

《摘自2014年中國結核病監(jiān)測報告》當前第2頁\共有54頁\編于星期三\13點結核病檢測技術發(fā)展歷程分子診斷時代DNA診斷：PCRLAMPGeneXpert基因芯片RNA診斷：TMANASBA免疫學檢測：AbAgPPDT-SPOT細菌法：直接鏡檢體外培養(yǎng)SAT19世紀中葉20世紀60年代20世紀80年代20世紀90年代靈敏度低檢測周期長成本低交叉污染儀器要求復雜反應抑制高靈敏度高特異性交叉污染少血清學檢測WHO不推薦r-干擾素釋放實驗結核病檢測技術發(fā)展歷程當前第3頁\共有54頁\編于星期三\13點一、細菌法直接涂片

（陽性率低—5000以上細菌/ml；

不能區(qū)分真假、死活）當前第4頁\共有54頁\編于星期三\13點一、細菌法結核菌的培養(yǎng)

結核病病原學診斷的金標準(培養(yǎng)時間長是其軟肋)當前第5頁\共有54頁\編于星期三\13點一、細菌學檢測的新方法

—提高陽性率發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED）液體培養(yǎng)（可同時縮短培養(yǎng)時間）自動化涂片/染色技術（夾層杯法）不能區(qū)分真假、死活；培養(yǎng)仍是金標準但耗時長、當前第6頁\共有54頁\編于星期三\13點分枝桿菌固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)比較液體培養(yǎng)（BDMGIT960）固體培養(yǎng)（羅氏L-J）疑似新發(fā)患者報陽時間（d）13.63±7.1428.67±10.04復診患者報陽時間(d)22.94±9.5528.53±10.40疑似新發(fā)患者陽性率32.00%17.90%復診患者陽性率9.30%2.60%污染率6.57%4.0%液體培養(yǎng)在提高陽性率、縮短報陽時間上均優(yōu)于固體培養(yǎng)。吳學兵，陸彬，桂曉虹等。液體MGIT培養(yǎng)法在結核分枝桿菌檢測中的應用評估。檢驗醫(yī)學，2013,3（28）：211-214仍然不能滿足臨床快速診斷的需要當前第7頁\共有54頁\編于星期三\13點二、免疫學檢測

血清學檢測（抗體、抗原）結核菌素試驗（靈敏度、特異性？）結核感染T細胞檢測（γ-干擾素檢測）當前第8頁\共有54頁\編于星期三\13點WHO關于血清學檢測聲明2011年7月20日，世界衛(wèi)生組織（WHO）正式聲明，要求禁止將血清學檢測方法（抗原，抗體，蛋白芯片等）用于肺結核和肺外結核的診斷。WHOwarnsagainsttheuseofinaccuratecommercialserologicaltestsforpulmonaryandextra-pulmonaryTB.蛋白質組學的發(fā)展

3、4、7種結核桿菌優(yōu)勢表位抗原（16KD、38KD、MPT64、ESAT-6、CFP10、Mtb8、Mtb8.4、Mtb16.3）制備多靶點蛋白微陣列大量的文獻報道其敏感性特異性均顯著高于涂片與培養(yǎng)法可用于結核病的臨床輔助診斷，提高痰涂片和痰培養(yǎng)假陰性的檢測率參考文獻略當前第9頁\共有54頁\編于星期三\13點γ-干擾素釋放實驗（IGRAs)10Interferon-GammaReleaseAssays當前第10頁\共有54頁\編于星期三\13點結核桿菌特異抗原：ESAT-6與CFP10由結核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失RD1和RD2絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌(NTM)也不存在RD1和RD2區(qū)11ESAT-6

:早期抗原靶6（EarlySecretedAntigenicRarget6）CFP10

:培養(yǎng)濾液蛋白10（CultureFiltrateProtein10）當前第11頁\共有54頁\編于星期三\13點12結核桿菌特異抗原：ESAT-6與CFP10結核菌群抗原ESAT6CFP-10Mtuberculosis++Mafricanum++Mbovis++BCGsubstrain

gothenburg--moreau--tice--tokyo--danish--glaxo--montreal--pasteur--抗原

ESAT6CFP-10Mabcessus--Mavium--Mbranderi--Mcelatum--Mchelonae--Mfortuitum--Mgordonii++Mintracellulare--++Mmalmoense--Mmarinum++Moenavense--Mcrofulaceum----Mszulgai++Mterrae--Mvaccae--Mxenopi--環(huán)境分枝桿菌MsmegmatisMkansasii--當前第12頁\共有54頁\編于星期三\13點準確—T-SPOT臨床診斷性能

特異性只針對結核分枝桿菌復合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)國內臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508)

靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結核患者中有很高的檢出率美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)國內臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)13陰性預測值：93.9%（478/509）陽性預測值：95.4%（624/654）當前第13頁\共有54頁\編于星期三\13點

T-SPOT相關指南T-SPOT?.TB是采用γ-干擾素釋放試驗（IGRA）原理，獲得美國FDA認證、歐盟CE認證和首個中國CFDA認證的商業(yè)化產(chǎn)品列入歐美25個國家結核診療指南2011年英國NICE指南、2010年美國最新結核診療指南、2010年加拿大結核指南美國CDC推薦—卡介苗（BCG）接種人群結核感染檢測首選國內風濕科和消化科已列入專家共識14當前第14頁\共有54頁\編于星期三\13點快速—T-SPOT的實驗步驟用BDCPT管或Ficoll提取液收集外周血單個核細胞結核特異抗原（ESAT-6/CFP10）刺激結核特異的效應T淋巴細胞使其分泌γ-干擾素效應T淋巴細胞分泌的γ-干擾素與膜板預包被的抗γ-干擾素抗體結合并固定在細胞周圍1個斑點=1個效應T細胞加入顯色液，觀察結果過夜孵育，洗板，加入酶標二抗15當前第15頁\共有54頁\編于星期三\13點實驗效果圖陰性結果陽性結果空白對照抗原AESAT-6抗原BCFP10陽性對照（PHA）一個斑點=一個結核效應淋巴細胞當前第16頁\共有54頁\編于星期三\13點T-SPOT結果的解讀-陽性結果活動性結核病

—典型結核中毒癥狀

—影像學支持

—排除其他診斷MTB感染狀態(tài)

—典型結核中毒癥狀

—未發(fā)現(xiàn)結核患病證據(jù)潛伏性結核感染

—無結核中毒癥狀

—無其它結核患病證據(jù)陳舊性結核

—無結核中毒癥狀

—既往TB史或明確TB證據(jù)NTM（四種）感染高孟秋，γ-干擾素釋放試驗檢測結果的臨床意義解讀，中華結核和呼吸雜志，2014當前第17頁\共有54頁\編于星期三\13點T-SPOT結果解讀-陰性結果除外結核感染

—所用抗原為MTB特異性抗原

—機體沒有結核特異抗原致敏的T淋巴細胞

—

目前未感染結核分枝桿菌假陰性：感染階段不同（窗口期）少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/基礎疾病的情況，如HIV感染者、腫瘤患者、嬰幼兒等特殊肺外結核：結核性腦膜炎、粟粒性結核靈敏度相對較低實驗非正常操作：細胞計數(shù)不夠等高孟秋，γ-干擾素釋放試驗檢測結果的臨床意義解讀，中華結核和呼吸雜志，2014當前第18頁\共有54頁\編于星期三\13點T-SPOT的應用優(yōu)點：使用血液標本，取樣簡單；可用于肺內和肺外結核檢測；陰性預測值很高，可用于排除結核感染。缺點：

陽性預測值約80%，不能用于結核的確診

不能確定是否是肺結核（肺外）

不能區(qū)分是活動性和潛伏性結核不能區(qū)分某些非結核分枝桿菌（堪薩斯、蘇氏、戈登、海分枝桿菌）操作復雜，時間長；對于原發(fā)感染初期或免疫低下人群，可能存在假陰性。能否療效監(jiān)測？——無大量數(shù)據(jù)當前第19頁\共有54頁\編于星期三\13點

三、結核DNA檢測技術測序——金標準熒光定量PCR環(huán)介導恒溫擴增法（LAMP）基因芯片檢測鑒定技術基因XpertMTB/RIF檢測技術當前第20頁\共有54頁\編于星期三\13點1.熒光定量PCR是應用最為廣泛的TB-DNA定量PCR檢測方法具有靈敏度高（10CFU/ml）、特異性強、線性關系好、操作簡單等優(yōu)點。當前第21頁\共有54頁\編于星期三\13點

2.環(huán)介導恒溫擴增法（LAMP）

是在恒溫下進行PCR擴增，因此操作更為簡便，反應更加快速。65℃擴增40min即可用肉眼觀察結果。擴增陽性標本呈現(xiàn)綠色熒光，反之為陰性。是結核分枝桿菌DNA檢測技術的代表-靈敏、快速、特異、簡捷將會極大地推動結核病的防治工作當前第22頁\共有54頁\編于星期三\13點DNA檢測---LAMP結果判讀：顯色目測或SYBRGreenI等熒光染料當前第23頁\共有54頁\編于星期三\13點LAMP法和其他PCR法的比較當前第24頁\共有54頁\編于星期三\13點LAMP法在結核菌檢測中的應用臨床試驗——

LAMP法和對照試劑（BD快速培養(yǎng)）對比結果靈敏度＝89.54%陽性結果預期值＝98.13%特異性＝98.93%陰性結果預期值＝93.77%總符合率＝95.31%當前第25頁\共有54頁\編于星期三\13點26

JournalofClinicalMicrobiology.2010,48(10):3654–3660.結核

胞內通量：可同時檢測16-22種常見分枝桿菌速度：6小時靈敏度：103CFU/ml可自動或肉眼判讀結果

3.基因芯片檢測技術當前第26頁\共有54頁\編于星期三\13點檢測全程僅需6小時當前第27頁\共有54頁\編于星期三\13點MSM恥垢分枝桿菌MTC結核分枝桿菌復合群MTR次要分枝桿菌MIN胞內分枝桿菌MAV鳥分枝桿菌MGA胃分枝桿菌MKA堪薩斯分枝桿菌MSC瘰癘分枝桿菌MUA母牛分枝桿菌MCH龜分枝桿菌龜亞種MAB龜分枝桿菌膿腫亞種MSZ蘇爾加分枝桿菌MMA海/潰瘍分枝桿菌MXE蟾蜍分枝桿菌MDI迪氏分枝桿菌MFO偶發(fā)/豬分枝桿菌MGI淺黃分枝桿菌MSI猿猴分枝桿菌MTE土分枝桿菌MPH草分枝桿菌CC質控點MNO不產(chǎn)色分枝桿菌MGO戈登分枝桿菌同時鑒定MTC與21種NTM當前第28頁\共有54頁\編于星期三\13點4.XpertMTB/RIF檢測技術

當前第29頁\共有54頁\編于星期三\13點GeneXpert應用1、TB復合群鑒定。2、利福平耐藥檢測。3、WHO推薦4、Xpert?MTB/RIF檢測試劑的陽性檢出率低于人們對分子生物學診斷試劑高敏感度的預期值，（1000CFU/ml）當前第30頁\共有54頁\編于星期三\13點DNA用于臨床檢驗的不足“死菌檢測呈陽性”，與臨床相關性差不能區(qū)分“潛伏感染”“活動性感染”

易交叉污染

反應易受抑制當前第31頁\共有54頁\編于星期三\13點NASBA（國外）TMA（國外）SAT（國內）四、常見的RNA檢測技術當前第32頁\共有54頁\編于星期三\13點SAT技術是將核酸恒溫擴增和實時熒光檢測相結合的一種新型RNA檢測技術。TB—SAT檢測技術當前第33頁\共有54頁\編于星期三\13點TB-RNA釋放恒溫擴增實時檢測超聲波（300W）15min痰液預處理42℃40min與反應液混合60℃10min42℃5minTB-SAT操作流程50μl稀釋液全程2小時，會做PCR，就學的會SAT當前第34頁\共有54頁\編于星期三\13點TB-SAT檢測技術優(yōu)點當前第35頁\共有54頁\編于星期三\13點RNA診斷技術的優(yōu)勢靈敏度高：RNA≥DNA拷貝數(shù)與臨床相關性好：區(qū)分“死活菌”：

減少抗生素濫用可以診斷“活動性感染”：

活動性感染：RNA轉錄活躍

潛伏感染：RNA不轉錄不易污染：靶標和擴增產(chǎn)物都是RNA當前第36頁\共有54頁\編于星期三\13點TB-SAT檢測區(qū)分MTB和NTM結核分枝桿菌復合群（MTB）：人型結核分枝桿菌牛型結核分枝桿菌非洲型結核分枝桿菌非結核分枝桿菌（NTM）：研究表明，TB-SAT可以區(qū)分如下NTM：堪薩斯分枝桿菌、胞內分枝桿菌、龜分枝桿菌、戈登分枝桿菌、海分枝桿菌等18種NovelReal-TimeSimultaneousAmplificationandTestingMethodToAccuratelyandRapidlyDetectMycobacteriumtuberculosisComplexJ.Clin.Microbiol.2012,50(3):646.DOL:10.1128/JCM.05853-11.當前第37頁\共有54頁\編于星期三\13點活菌檢測技術，可用作肺結核治療效果評估據(jù)文獻報道：每個結核分枝桿菌含有約2000個拷貝rRNA研究表明：rRNA與結核分枝桿菌的生活力有著很好的相關性，rRNA可以反映結核分枝桿菌的死菌活菌狀態(tài)研究表明：在用藥治療期內，隨著結核分枝桿菌的死亡，rRNA大約在7天左右時間全部降解。而DNA含量幾乎保持不變VIVIANJONAS,etal.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,Sept.1993,p.2410-2416CLAUDIOPIERSIMONI,etal.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,Jan.1997,p.193–196.GABRIELLEM.E.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,Sept.1994,p.1959-1965

當前第38頁\共有54頁\編于星期三\13點免疫法常有既往感染問題SAT更有利于治愈判斷窗口期時間示意相對濃度示意抗體RNADNA病原體感染前后各檢測靶標的含量變化死菌的RNA快速降解，有助治愈判斷用藥治療DNA需要一段時間降解RNA快速降解當前第39頁\共有54頁\編于星期三\13點相比DNA,RNA檢測能更好的體現(xiàn)療效服用利福平和氧氟沙星后，第三天和第七天DNA和RNA的滴度變化，相比DNA,RNA與藥物濃度變化的符合率更高，RNA檢測能更好的進行療效評估。GABRIELLEM.E.Assessment

of

Mycobacterial

Viability

by

RNA

Amplification.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,Sept.1994,p.1959-1965

DNARNA當前第40頁\共有54頁\編于星期三\13點SAT與培養(yǎng)的監(jiān)測結果一致，可應用于療效評估監(jiān)測項目陽性患者數(shù)（%）0月0.5月1月2月4月6月集菌涂片150（100.0）53（35.3）20（13.3）9（6.0）4（2.7）6（4.0）羅氏培養(yǎng)150（100.0）83（55.3）32（21.3）16（10.7）12（8.0）12（8.0）TB-PCR148（98.7）84（56.0）47（31.3）20（13.3）12（8.0）13（8.7）SAT法150（100.0）86（57.3）35（23.3）16（10.7）12（8.0）12（8.0）胡永領，劉成永，成松.應用RNA恒溫擴增實時熒光檢測技術觀察抗結核藥物的療效.海峽藥學,2015年第27卷第1期SAT在抗結核治療藥物效果檢測方面，雖不能直接作出藥物敏感試驗，但可以最快地直接判斷所用藥物的療效，及時調整藥物使用，可大大降低醫(yī)療成本和耐藥產(chǎn)生的機會，大幅度減少醫(yī)療時間和費用。當前第41頁\共有54頁\編于星期三\13點TB-SAT檢測體液、病灶組織標本的靈敏度蔡杏珊,馬品云,張院良，譚耀駒

中國防癆雜志,2014,36(6):458-461當前第42頁\共有54頁\編于星期三\13點小結TB-SAT是國內唯一的結核分枝桿菌RNA檢測產(chǎn)品，2小時報告結果，可以快速對開放性肺結核患者進行排查。TB-SAT可以區(qū)分結核分枝桿菌復合群和非結核分枝桿菌，準確鑒別出肺結核患者。中國防癆協(xié)會與結核病權威專家推崇TB-SAT用于早期發(fā)現(xiàn)傳染性肺結核，減少肺結核導致的公共衛(wèi)生安全問題。當前第43頁\共有54頁\編于星期三\13點美國CDC關于RNA檢測技術

在TB診斷的指南1996：美國首個結核病的RNA檢測技術通過FDA認證，配合培養(yǎng)法對涂陽患者進行診斷2000：美國CDC指出RNA檢測技術用于TB疑似患者(涂陽、涂陰)痰液檢測、DNA檢測技術僅用于涂陽患者的痰液檢測2009：更新關于分子診斷技術在TB實驗室診斷的指南至少一個痰液樣本使用分子診斷技術檢測TB實驗室初步診斷同時參照分子診斷和涂片的結果當前第44頁\共有54頁\編于星期三\13點中國結核病診斷專家共識結核病診斷專家組：莊玉輝、萬利亞潘毓瑄、成詩明趙雁林、王國治吳雪瓊、萬康林周林、許衛(wèi)國居金良、胡忠義專家共識：TB-SAT顯著提高結核分枝桿菌的陽性檢出率，對早期發(fā)現(xiàn)傳染性肺結核患者，控制結核病傳染源有極其重要的意義中國防癆協(xié)會，2012年6月當前第45頁\共有54頁\編于星期三\13點結核實驗室檢測方法中推薦SAT胡忠義.實驗結核病學.軍事醫(yī)學科學出版社.2014.趙雁林.結核病實驗室檢驗規(guī)程.中國防癆協(xié)會.2015當前第46頁\共有54頁\編于星期三\13點五、耐多藥結核病診斷現(xiàn)狀47

固液體培養(yǎng)（時間、生物安全等）分子生物學技術應用使快速檢測耐藥成為可能MDR、XDR的出現(xiàn)對結核病的防控提出了嚴峻的考驗當前第47頁\共有54頁\編于星期三\13點結核耐藥分子診斷技術測序（金標準-檢測突變的理想方法）實時熒光PCR探針溶解曲線法實時PCR技術（GeneXpert）線性探針雜交（HainLPA）基因芯片（Genechip）48檢測已知的突變位點耐藥分子診斷檢測的靈敏度：103CFU/ml當前第48頁\共有54頁\編于星期三\13點結核病耐藥與基因64-68%

rpsL基因突變70%embB基因突變70%65%耐藥基因93%95%95%

rpoB基因突變利福平異煙肼50-70%

katG基因突變5-10%

inhA基因突變6-13%

ahpC基因啟動子區(qū)域突變鏈霉素乙胺丁醇

多數(shù)研究報告提示：耐藥的發(fā)生與結核桿菌的基因突變有關。總體上是基因一個或幾個核苷酸突變（表現(xiàn)增加、缺失、替代），造成核苷酸編碼錯誤致氨基酸錯位排列，影響藥物與靶位酶結合產(chǎn)生耐藥當前第49頁\共有54頁\編于