臨床血液學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)-第三章-第七節(jié)-血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)-課件

第一章造血及造血調(diào)控第一節(jié)造血器官與造血微環(huán)境臨床血液學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第三章造血檢驗(yàn)技術(shù)第七節(jié)血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)夸浺?、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)（一）核酸分子雜交技術(shù)（二）聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（三）基因表達(dá)譜分析技術(shù)（四）miRNA表達(dá)譜分析技術(shù)二、臨床應(yīng)用（一）惡性血液病的診斷、分型及預(yù)后（二）免疫球蛋白重鏈基因和T細(xì)胞受體基因重排的檢測(cè)（三）遺傳性血液病的診斷（四）

HLA基因多態(tài)性檢測(cè)（五）腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因的檢測(cè)（六）基因治療一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

（一）核酸分子雜交技術(shù)

單鏈核酸分子在合適的條件下，與具有堿基互補(bǔ)序列的不同來(lái)源的單鏈核酸分子結(jié)合，形成雙鏈雜交體的過(guò)程。探針(已知核酸片斷，單鏈)待測(cè)核苷酸序列(單鏈)基本方法Southern印跡雜交Northern印跡雜交Western印跡雜交核酸原位雜交一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)Southern印跡雜交分析DNA結(jié)構(gòu)，由Southern印跡和分子雜交兩部分組成。待測(cè)DNA酶消化瓊脂糖凝膠電泳DNA片段分開(kāi)DNA片段被標(biāo)記的硝酸纖維素濾膜印跡放射自顯影檢測(cè)分析DNA一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)（a）基因組DNA（b）（c）（d）（e）DNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)Northern印跡雜交

用于分析RNA待測(cè)RNA變性瓊脂糖凝膠電泳RNA片段分開(kāi)RNA片段硝酸纖維素濾膜轉(zhuǎn)移用標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交分析RNA一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)

用于檢測(cè)蛋白質(zhì)。“探針”是特異性第一抗體，“顯色”是用針對(duì)第一抗體的標(biāo)記二抗。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移待測(cè)蛋白質(zhì)再與標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)分析蛋白成分固相載體與相應(yīng)的抗體反應(yīng)底物顯色或放射自顯影一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)核酸原位雜交用于研究涂片上單個(gè)細(xì)胞的基因及其表達(dá)產(chǎn)物。標(biāo)記的DNA或RNA探針堿基配對(duì)形成雜交體待檢核酸細(xì)胞內(nèi)定位檢測(cè)+組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)顯示核酸原位的雜交信號(hào)顯微鏡一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)標(biāo)記生物素的DNA探針間接免疫熒光法染色體顯帶染色體定位染色體異常部位+碘化丙啶(PI)染色染色體呈紅色，染色體上的特異雜交帶呈黃綠色熒光顯微鏡熒光原位雜交技術(shù)(FISH)

在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的非放射性原位雜交技術(shù)。對(duì)檢測(cè)染色體異常、腫瘤致病基因和腫瘤微小殘留病灶有廣闊的發(fā)展前景。一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)多色FISH技術(shù)

多重?zé)晒庠浑s交(M-FISH)：觀(guān)察多條染色體間的復(fù)雜易位情況和確定標(biāo)識(shí)染色體的來(lái)源。多色熒光染色體顯帶(Rx-FISH)：顯示同一條染色體中的易位、倒位或附加染色體來(lái)源，彌補(bǔ)了M-FISH的缺點(diǎn)。比較基因組雜交(CGH)：一次雜交中檢測(cè)整個(gè)基因遺傳物質(zhì)的增加或減少，適用于整個(gè)基因組的篩查，在探測(cè)染色體缺失和重復(fù)方面特別方便。一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

（二）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，又稱(chēng)為基因的體外擴(kuò)增法。PCR技術(shù)能在體外快速而高效地?cái)U(kuò)增特異性目標(biāo)DNA序列，使體外擴(kuò)增核酸片段成為可能。臨床血液學(xué)診斷不可缺少的重要工具。一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)PCR原理

一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)PCR產(chǎn)物分析1.電泳方法

瓊脂糖凝膠電泳：簡(jiǎn)便、快速地分離純化和鑒定核酸，是最經(jīng)典的PCR產(chǎn)物分析方法。聚丙烯酰胺凝膠電泳：分離效果和靈敏度均比瓊脂糖好，條帶集中，裝載的DNA量大，回收純度高。一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

2.斑點(diǎn)雜交法

分析PCR產(chǎn)物的固相雜交技術(shù)，判斷產(chǎn)物序列的突變類(lèi)型和產(chǎn)物的特異性鑒定，有助于血液系統(tǒng)遺傳病的基因診斷及基因的多態(tài)性分析。

3.PCR-ELISA法

PCR和酶聯(lián)免疫吸附法相結(jié)合的診斷技術(shù)，靈敏度高。一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

4.原位雜交法

融合了原位雜交和PCR技術(shù)。既能鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)示細(xì)胞內(nèi)的靶序列位置。

5.實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)

是定量PCR技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、線(xiàn)性關(guān)系好、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)（三）基因表達(dá)譜分析技術(shù)(GEP)主要有微陣列技術(shù)、基因表達(dá)系列分析技術(shù)、差異展示PCR技術(shù)和抑制消減雜交等技術(shù)。微陣列技術(shù)是目前發(fā)展迅速的高通量基因表達(dá)譜研究技術(shù)，又稱(chēng)為生物芯片技術(shù)。依據(jù)芯片的功能分為DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片和縮微芯片。DNA芯片技術(shù)具備高通量、高特異性、高靈敏度和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究血液疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷和分型、預(yù)后分析、藥物代謝、藥物靶點(diǎn)和微小殘留病(MDR)的重要手段。

一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

（四）miRNA表達(dá)譜分析技術(shù)

微小RNA（miRNA）存在于真核細(xì)胞中，長(zhǎng)度為19～24個(gè)核苷酸的非編碼小分子調(diào)控RNA。miRNA直接參與造血系統(tǒng)的生理和病理過(guò)程。miRNA表達(dá)譜分析可對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤進(jìn)行分類(lèi)和基因診斷。miRNA表達(dá)譜有助于血液腫瘤的預(yù)后判斷、分子靶向藥物療效的預(yù)測(cè)和治療策略的制定。一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)miRNA檢測(cè)方法探針雜交：Northern印跡技術(shù)、微陣列芯片技術(shù)、原位雜交技術(shù)和納米金標(biāo)記技術(shù)。擴(kuò)增技術(shù)：實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、恒溫滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、克隆測(cè)序和新一代測(cè)序技術(shù)。全基因組miRNA表達(dá)譜。一、血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)二、臨床應(yīng)用血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)在血液學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用用于血液疾病的基因分析、基因診斷、疾病分型、指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后和微量殘留灶檢測(cè)。

（一）惡性血液病的診斷、分型及預(yù)后判斷

惡性血液病是多基因腫瘤，常出現(xiàn)特異性的融合基因。PML-RARa融合基因急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）的特異性融合基因。有t（15；17）和PML-RARa融合基因的APL患者對(duì)反式維甲酸（ATRA）敏感。完全緩解（CR）的APL患者，PML-RARa融合基因仍陽(yáng)性者極易復(fù)發(fā)，而融合基因陰性者，復(fù)發(fā)率低。出現(xiàn)PLZF-RARa和NPM-RARa融合基因的APL患者，對(duì)ATRA不敏感，預(yù)后較差。二、臨床應(yīng)用BCR/ABL融合基因

主要見(jiàn)于慢性粒細(xì)胞白血病（CML）。表達(dá)BCR/ABL融合蛋白，是CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)。急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）、急性髓細(xì)胞白血病（AML）和骨髓增殖性腫瘤（MPN）也表達(dá)該融合基因，表達(dá)水平與臨床療效具有良好的相關(guān)性，有助于判斷臨床病情變化，監(jiān)測(cè)腫瘤微小殘留病。二、臨床應(yīng)用AML1/ETO融合基因

急性粒細(xì)胞白血病部分分化型（AML-M2）的特征性標(biāo)志，亦可見(jiàn)于A(yíng)ML的其他類(lèi)型。AML1/ETO融合基因的表達(dá)是白血病預(yù)后良好的標(biāo)志，也是微量殘留白血病檢測(cè)的特異性標(biāo)志。急性白血病患者具有CBFβ/MYH11、AML1/ETO、PML-RARa融合基因的預(yù)后較好，緩解率高，可長(zhǎng)期緩解或治愈；而具有BCR-ABL融合基因的ALL患者對(duì)化療反應(yīng)差，復(fù)發(fā)率高。二、臨床應(yīng)用

（二）IgH和TCR基因重排的檢測(cè)

免疫球蛋白重鏈（IgH）和T細(xì)胞抗原受體（TCR）編碼的基因具有多態(tài)性，基因重排分別發(fā)生在B、T細(xì)胞的分化早期。B、T細(xì)胞未受刺激時(shí)，IgH、TCR的基因重排是隨機(jī)的。白血病時(shí)，IgH、TCR會(huì)出現(xiàn)針對(duì)性重排，發(fā)生單克隆性增殖。檢測(cè)IgH基因和TCR基因重排，有助于急性淋巴細(xì)胞白血病的分型診斷、淋巴瘤診斷以及微量殘留病的檢測(cè)。急性髓細(xì)胞白血病（AML）也可表達(dá)IgH和TCR基因重排，重排陽(yáng)性患者的治療效果顯著低于重排陰性患者。二、臨床應(yīng)用（三）遺傳性血液病的診斷

遺傳性血液病主要為遺傳性基因異常，包括缺失、點(diǎn)突變、插入和倒位等基因缺陷。目前最常用的基因診斷技術(shù)是基因芯片技術(shù)，有高敏感性和高通量等優(yōu)點(diǎn)。各種分子生物學(xué)診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，為遺傳性疾病的基因診斷提供了檢測(cè)手段。二、臨床應(yīng)用（四）HLA基因多態(tài)性檢測(cè)

人類(lèi)白細(xì)胞抗原（HLA）位于第6號(hào)染色體短臂上，其多態(tài)性與多種疾病的遺傳易感性、發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有密切關(guān)系。HLA基因多態(tài)性檢測(cè)主要有兩種：基于核酸序列識(shí)別的方法和基于序列分子構(gòu)型的方法。最常用的方法有聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（PCR-SSP）、聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性寡核苷酸反應(yīng)（PCR-SSO）、PCR-指紋圖和直接測(cè)序分型（SBT）。SBT法是直接對(duì)HLA基因測(cè)序，是目前最可靠的方法，但SBT法所需設(shè)備昂貴，臨床普及較困難。DNA芯片技術(shù)，作為一項(xiàng)檢測(cè)SNP的成熟技術(shù)，已廣泛應(yīng)用到HLA分型中。二、臨床應(yīng)用

（五）腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因的檢測(cè)

腫瘤細(xì)胞對(duì)一種藥物耐藥的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)不同的藥物也可產(chǎn)生耐藥性稱(chēng)之為MDR。MDR是導(dǎo)致惡性血液病化療失敗的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)正常血液細(xì)胞多藥耐藥基因（MDR1）表達(dá)水平較低，而惡性血液病患者M(jìn)DR的出現(xiàn)常與MDR1過(guò)度表達(dá)有關(guān)。目前已建立Northern印跡法、斑點(diǎn)和狹縫印跡法、RT-PCR法、原位雜交法和基因表達(dá)譜芯片法，從mRNA水平進(jìn)行腫瘤細(xì)胞耐藥特性的分析，并發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因。二、臨床應(yīng)用（六）基因治療應(yīng)用DNA重組技術(shù)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將外源正常目的基因?qū)牖颊卟∽兊捏w細(xì)胞內(nèi)，合成正常的基因產(chǎn)物，糾正或補(bǔ)償其缺陷基因的功能，達(dá)到治療疾病的目的?；蛑委煹陌屑?xì)胞一般采用在體內(nèi)能保持相當(dāng)長(zhǎng)的壽命或者具有分裂能力的細(xì)胞，如造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。常用的載體