七=外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)與調(diào)控

外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)與調(diào)控山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所王曉燕當(dāng)前第1頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)基因工程的基本程序

載體外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主細(xì)胞選出含有重組DNA的細(xì)胞abbAAb重組DNA的擴(kuò)增或表達(dá)當(dāng)前第2頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)基因重組的主要目的是要使目的基因在某一細(xì)胞中能得到高效表達(dá)，即產(chǎn)生人們所需要的高產(chǎn)目的基因產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、多肽類(lèi)生物藥物?；蚬こ碳夹g(shù)的核心是基因表達(dá)技術(shù)。基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在調(diào)控序列的作用下轉(zhuǎn)錄成mRNA，經(jīng)加工后在核糖體的協(xié)助下又轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的基因產(chǎn)物——蛋白質(zhì)，再在受體細(xì)胞環(huán)境中經(jīng)修飾而顯示出相應(yīng)的功能。從基因到有功能的產(chǎn)物這整個(gè)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯及所有的加工過(guò)程就是基因表達(dá)的過(guò)程，它是在一系列酶和調(diào)控序列的共同作用下完成的。當(dāng)前第3頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)一、概述（一）幾個(gè)重要的概念1、表達(dá)系統(tǒng)（geneexpressionsystem)：

基因工程中用來(lái)獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系，包括表達(dá)載體的構(gòu)建、受體細(xì)胞的建立及表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化。當(dāng)前第4頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第5頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)2、據(jù)受體細(xì)胞的不同可分為：1）原核表達(dá)系統(tǒng)：

將外源基因引入原核細(xì)胞，并使其在原核細(xì)胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達(dá)、合成基因產(chǎn)物的體系。2）真核表達(dá)系統(tǒng)：

使外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的體系。當(dāng)前第6頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（二）原核表達(dá)系統(tǒng)的局限性

1.缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)，不能進(jìn)行糖基化、甲基化的修飾，影響某些蛋白的活性。2.在原核細(xì)胞中表達(dá)的真核蛋白不穩(wěn)定，易被細(xì)菌蛋白酶降解。3.很難實(shí)現(xiàn)真正的分泌出胞，其產(chǎn)量很低，而且容易出現(xiàn)信號(hào)肽不被切割，或不在特異位置上切割。4.表達(dá)產(chǎn)物常以包涵體（防止蛋白酶的水解）的形式存在，后期需要經(jīng)過(guò)變性（鹽酸胍或尿素）復(fù)性（二硫蘇糖醇、巰基乙醇等還原劑），并且復(fù)性效率低。5.內(nèi)毒素的污染當(dāng)前第7頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)真核基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜龐大:形成復(fù)雜的染色質(zhì)或者染色體基因不連續(xù)性:內(nèi)含子、外顯子3.含有大量的重復(fù)序列：低度、中度或高度4.存在許多基因家族（有一定同源性而又不完全相同的基因簇）：如珠蛋白基因家族、ras基因家族等。5.沒(méi)有原核細(xì)胞的操縱子，不產(chǎn)生多順?lè)醋觤RNA:即一個(gè)編碼基因轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA分子，經(jīng)翻譯生成一條多肽鏈(單順?lè)醋觤RNA）。6.基因表達(dá)調(diào)控復(fù)雜（三）真核基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)當(dāng)前第8頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)(a)原核生物mRNA為多順?lè)醋?b)真核生物mRNA為單順?lè)醋赢?dāng)前第9頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第10頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（四）真核基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)——多方面、多層次1.轉(zhuǎn)錄前（基因組水平）調(diào)控：基因結(jié)構(gòu)改變，持久且不可逆2.轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控：3.轉(zhuǎn)錄后修飾：4.翻譯水平的調(diào)控：5.翻譯后修飾：當(dāng)前第11頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第12頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)轉(zhuǎn)錄前調(diào)控1.基因丟失：目前認(rèn)為這種調(diào)節(jié)方式主要是在較低等的真核生物中。2.基因擴(kuò)增：是指某些基因的拷貝數(shù)專(zhuān)一性大量增加的現(xiàn)象。3.基因重排：是指某些基因片段改變?cè)瓉?lái)存在的順序而重新排列組合。4.甲基化修飾：DNA甲基化是一種重要的基因組表觀遺傳修飾，參與調(diào)控許多細(xì)胞過(guò)程，包括胚胎發(fā)育、轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、X染色體失活、基因組印跡以及染色體穩(wěn)定性。5.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控：細(xì)胞分裂時(shí)松開(kāi)分散在核內(nèi)的染色質(zhì)稱(chēng)為常染色質(zhì)，常染色質(zhì)的基因可以轉(zhuǎn)錄。染色體中的某些區(qū)段到分裂期后，仍保持緊湊折疊的結(jié)構(gòu)，在間期核中可以看到其濃集的斑塊，稱(chēng)為異染色質(zhì)，基因不能轉(zhuǎn)錄表達(dá)。當(dāng)前第13頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控1.RNA聚合酶:I,II,III2.順式調(diào)控因子（cis-actingfactor)3.反式作用因子（trans-actingfactor)當(dāng)前第14頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)酶主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA聚合酶ⅠrRNA，大多數(shù)snRNARNA聚合酶ⅡmRNA前體，部分snRNARNA聚合酶ⅢtRNA、部分snRNA

真核細(xì)胞中RNA聚合酶的種類(lèi)當(dāng)前第15頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)順式調(diào)控因子順式調(diào)控因子（cis-actingfactor)：是與結(jié)構(gòu)基因串連的、對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的精確起始和轉(zhuǎn)錄活性具重要調(diào)控作用的特定DNA序列。包括正性調(diào)控元件（啟動(dòng)子、增強(qiáng)子）和負(fù)性調(diào)控元件（沉寂子、加尾和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)）當(dāng)前第16頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子（Promoter）:位于基因的5'端與基因轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的核苷酸序列。一般包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及其上游100-200bp序列作用特點(diǎn)：近距離作用、具有方向性、空間位置較恒定分類(lèi)：核心啟動(dòng)子元件（轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-30bp區(qū)的TATA-box）：決定基因轉(zhuǎn)錄精確起始。上游啟動(dòng)子元件(包括：-70至-80bp區(qū)域的CAAT盒及其兩側(cè)的GC盒):協(xié)同決定轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)效率。組織特異性元件:如肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子元件HP1，與白蛋白、AFP等基因在肝細(xì)胞中的特異性表達(dá)有關(guān)。誘導(dǎo)性啟動(dòng)子元件：如cAMP反應(yīng)元件（CRE），介導(dǎo)對(duì)cAMP、生長(zhǎng)因子等信號(hào)的反應(yīng)。當(dāng)前第17頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)

啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)模式圖

SP1NF1

SP1TBP當(dāng)前第18頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第19頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)表－1哺乳類(lèi)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子中

常見(jiàn)的元件元件名稱(chēng)共同序列結(jié)合的蛋白因子名稱(chēng)分子量DNA長(zhǎng)度TATATATAAATFIID30,000～10bpGCGGGCGGSP-1105,000～20bpCAATGGCCAATCTCTF/NF160,000～22bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000～10bpATFGTGACGTATF?~20bpOctaneATTTGCATOct-176,000～10bp當(dāng)前第20頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)增強(qiáng)子增強(qiáng)子(Enhancer):是一類(lèi)本身不具備啟動(dòng)子活性但能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活性的順式調(diào)控元件。構(gòu)成：由單拷貝或多拷貝組件串連構(gòu)成，長(zhǎng)100-200bp，核心組件8-12bp。作用特點(diǎn)：遠(yuǎn)距離作用無(wú)方向性有啟動(dòng)子依賴(lài)性，但對(duì)啟動(dòng)子無(wú)嚴(yán)格專(zhuān)一性，因而無(wú)基因特異性。組織特異性相位性當(dāng)前第21頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第22頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)負(fù)性調(diào)控元件沉寂子（silencer)或衰減子(dehancer)：是一類(lèi)抑制基因轉(zhuǎn)錄的順式調(diào)控元件，作用方式同增強(qiáng)子。轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)：加尾信號(hào)：AATAA,polyA上游10-20bpG/T簇：能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)序列當(dāng)前第23頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第24頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)反式作用因子反式作用因子（Trans-actingfactor）:由位于不同或相同染色體上相距較遠(yuǎn)的基因所編碼的蛋白質(zhì)因子，通過(guò)與順式調(diào)控元件和RNA聚合酶的相互作用而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)前第25頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)轉(zhuǎn)錄信號(hào)1PTrans-actingfactorTrans-actingfactor(DNA結(jié)合蛋白）Cis-actingfactorAgenemRNAofAProteinABgenemRNAofBProteinB當(dāng)前第26頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)反式作用因子可以分為3類(lèi)：（1）普通轉(zhuǎn)錄因子（通用轉(zhuǎn)錄因子）：主要識(shí)別啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)成分，如TATA盒結(jié)合因子TFIID；（2）組織特異性轉(zhuǎn)錄因子：是特殊組織與細(xì)胞中的反式作用因子，如淋巴細(xì)胞中的Oct-2；（3）誘導(dǎo)性反式作用因子：與反應(yīng)性元件（responseelements）相結(jié)合的反式作用因子。如HSRE（熱休克反應(yīng)元件，heatshockresponseelement）

GRE（糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件，glucocorticoidresponseelement）

CRE（cAMP反應(yīng)元件，cAMPresponseelement）

當(dāng)前第27頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)反式作用因子的結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄激活域TF富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域酸性α-螺旋結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域同源結(jié)構(gòu)域鋅指結(jié)構(gòu)域亮氨酸拉鏈螺旋-環(huán)-螺旋螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋當(dāng)前第28頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)螺旋轉(zhuǎn)角螺旋鋅指結(jié)構(gòu)亮氨基拉鏈螺旋環(huán)螺旋同源結(jié)構(gòu)域SP1OCT-2AP-1myc當(dāng)前第29頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第30頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)1、RNA加工成熟：無(wú)論是rRNA、tRNA、mRNA，轉(zhuǎn)錄后都必須經(jīng)過(guò)加工，才能成為有功能的分子。rRNA：前體是45S，成熟的rRNA是18S、28S、5.8S，還要經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾--核糖甲基化。tRNA：首先經(jīng)過(guò)核苷的修飾，生成4.5S前體tRNA，再剪接成為成熟的tRNA。mRNA：5’加帽子，3’加poly(A)，還要經(jīng)過(guò)剪接以及核苷酸的甲基化修飾。轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控當(dāng)前第31頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第32頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)

真核生物的基因可以分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)錄單位；另一類(lèi)是復(fù)雜轉(zhuǎn)錄單位。轉(zhuǎn)錄后加工方式是不同的。（1）簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)錄單位：編碼產(chǎn)生一個(gè)多肽，轉(zhuǎn)錄后加工有3種形式。a、基因沒(méi)有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后無(wú)需加工，也沒(méi)有poly(A),如組蛋白基因。b、沒(méi)有內(nèi)含子，無(wú)需剪切，但需要加poly(A)尾，如α-干擾素基因。c、有內(nèi)含子，需要加工，及加poly(A)尾，但它們只產(chǎn)生一個(gè)有功能的mRNA，如ɑ,β-珠蛋白基因。2、轉(zhuǎn)錄后加工的多樣性當(dāng)前第33頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第34頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過(guò)不同的方式加工成兩個(gè)或兩個(gè)以上的mRNA。a、利用多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)或剪接位點(diǎn)產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。b、利用多個(gè)加多聚（A）位點(diǎn)和不同的剪切方式產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。c、雖無(wú)剪接，但有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)或加poly(A)位點(diǎn)。

（2）復(fù)雜轉(zhuǎn)錄單位當(dāng)前第35頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)利用多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)或剪接位點(diǎn)產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)當(dāng)前第36頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第37頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)利用多個(gè)加多聚（A）位點(diǎn)和不同的剪切方式產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)當(dāng)前第38頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)雖無(wú)剪接，但有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)或加poly(A)位點(diǎn)當(dāng)前第39頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)翻譯水平的調(diào)控對(duì)可溶性蛋白質(zhì)因子的修飾：如eIF-2磷酸化后可抑制蛋白質(zhì)的合成。對(duì)mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)反義RNA對(duì)翻譯的調(diào)控作用反義RNA(anti-sense)：一段含有與被調(diào)控基因所產(chǎn)生mRNA互補(bǔ)的堿基序列的小分子RNA。①與mRNA結(jié)合，形成雙鏈RNA。影響mRNA的模板效率；②可能參與mRNA的拼接。當(dāng)前第40頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第41頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)1.多肽的切割：切去前端的信號(hào)肽2.多肽的有限水解：蛋白質(zhì)（酶原）必須經(jīng)過(guò)有限的酶和化學(xué)水解才能變成有活性的物質(zhì)。3.多肽的化學(xué)修飾：蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化（糖蛋白）、乙?；?.多肽的剪接：多肽被剪接成數(shù)個(gè)片段，再以一定的順序結(jié)合起來(lái)，形成有活性的蛋白質(zhì)。翻譯后的調(diào)控當(dāng)前第42頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)二、真核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)（Eukaryoticexpressionsystem)：指在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的體系。

組成：真核表達(dá)載體受體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移方式當(dāng)前第43頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（一）真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性和優(yōu)勢(shì)1.具有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)：剪除內(nèi)含子2.具有完善的翻譯后加工系統(tǒng)：對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行修飾，具有天然構(gòu)型。3.可實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá):將表達(dá)產(chǎn)物分泌至細(xì)胞外培養(yǎng)液，簡(jiǎn)化了純化工藝。4.有助于深入了解真核基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制,實(shí)現(xiàn)基因治療。當(dāng)前第44頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（二）真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體：適用于在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。真核載體根據(jù)受體不同，可分為：酵母表達(dá)載體、哺乳動(dòng)物表達(dá)載體、昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體。當(dāng)前第45頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)

真核表達(dá)載體包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始位點(diǎn)、抗生素抗性基因、多克隆位點(diǎn)等。真核表達(dá)載體中還具有：①真核表達(dá)調(diào)控元件：包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、polyA加尾信號(hào)等②真核細(xì)胞復(fù)制起始序列③真核細(xì)胞藥物抗性基因當(dāng)前第46頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)真核表達(dá)載體帶有的polyA加尾信號(hào)可保證新轉(zhuǎn)錄的mRNA能有效地加上polyA。真核表達(dá)載體的基本組成

OriPro：原核復(fù)制起始序列；P：?jiǎn)?dòng)子；MCS：多克隆位點(diǎn)；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。注：不是所有真核表達(dá)載體都有整合序列PolyA當(dāng)前第47頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（三）真核表達(dá)系統(tǒng)1.酵母表達(dá)系統(tǒng)：利用酵母表達(dá)載體，在酵母細(xì)胞中表達(dá)外源基因2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：利用重組質(zhì)?；虿《据d體，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因3.昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體，在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因當(dāng)前第48頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)

酵母表達(dá)系統(tǒng)

當(dāng)前第49頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)

酵母菌是單細(xì)胞真核生物，其遺傳背景清楚培養(yǎng)簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)周期短，經(jīng)濟(jì)生物安全性高可分泌表達(dá)，簡(jiǎn)化純化工藝當(dāng)前第50頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（一）酵母載體在酵母細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增和表達(dá)的載體，包括克隆載體和表達(dá)載體。主要組成元件：篩選標(biāo)記：如抗生素抗性基因Zeocin(博來(lái)霉素,屬于爭(zhēng)光霉素家族的成員）營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記基因Leu(β異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶,參與丙酮酸向亮氨酸的轉(zhuǎn)化)

當(dāng)前第51頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)

Leu-作為酵母載體的選擇標(biāo)記基因當(dāng)前第52頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)用于酵母載體中的調(diào)控序列ARS（AutoReplicationSequence)：自主復(fù)制序列，為酵母復(fù)制起始區(qū)(點(diǎn))。2μM質(zhì)粒：酵母核質(zhì)中的小的環(huán)狀DNA，可以獨(dú)立復(fù)制并轉(zhuǎn)錄。酵母啟動(dòng)子：常用的有GAP（3-磷酸甘油醛脫氫酶）、AOX1（醇氧化酶-1）、ADH(乙醇脫氫酶)、SUC(蔗糖酶)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、Apase(堿性磷酸酶)啟動(dòng)子。酵母著絲粒區(qū)段(CEN)：增加轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性。當(dāng)前第53頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)酵母載體的種類(lèi)酵母克隆載體：不含酵母啟動(dòng)子，不能在酵母中表達(dá)外源基因，如YIP、YRP、YEP酵母表達(dá)載體：酵母克隆載體+酵母啟動(dòng)子,若引入信號(hào)肽序列，則成為分泌型載體YAC：酵母人工染色體（yeastartificialchromosome)可插入200～800kb的外源基因片段，因而特別適合高等真核生物基因組的克隆與表達(dá)研究。當(dāng)前第54頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)1.YIp(酵母整合型質(zhì)粒)：細(xì)菌質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標(biāo)記，通過(guò)同源重組整合入酵母染色體，轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)化率極低。2.YRp(酵母復(fù)制型質(zhì)粒)：細(xì)菌質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標(biāo)記(YIp)+酵母復(fù)制序列(ARS),可自主復(fù)制，但穩(wěn)定性差。3.YEp(酵母附加子型質(zhì)粒)：細(xì)菌質(zhì)粒DNA+酵母標(biāo)記基因(YIp)+酵母2μM質(zhì)粒，游離于核外存在并自主復(fù)制。I.酵母克隆載體當(dāng)前第55頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)

酵母克隆載體的構(gòu)建當(dāng)前第56頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)II.酵母表達(dá)載體含酵母啟動(dòng)子穿梭載體(shuttlevector)：既可以攜帶外源基因在原核細(xì)胞中復(fù)制增殖，又可以在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。種類(lèi)：釀酒酵母表達(dá)載體畢赤酵母表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體：引入酵母的信號(hào)肽基因，如因子信號(hào)肽當(dāng)前第57頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)釀酒酵母表達(dá)載體Leu2編碼β異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶，作為篩選標(biāo)記。帶有此質(zhì)粒的酵母菌在不含有亮氨酸的培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)。當(dāng)前第58頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)畢赤酵母表達(dá)載體整合型HIS4編碼組氨醇脫氫酶基因，作為篩選標(biāo)記。HIS4區(qū)的整合方式為位點(diǎn)特異性單交換引起的基因插入，整合后使?fàn)I養(yǎng)缺陷型宿主恢復(fù)野生型，在不含組氨酸的培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)。當(dāng)前第59頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)5‘AOX1啟動(dòng)子片段含有AOX1啟動(dòng)子，在甲醇的誘導(dǎo)下可啟動(dòng)外源蛋白的表達(dá)；α-因子信號(hào)肽序列為約89個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白的純化；多克隆位點(diǎn)含多個(gè)酶切位點(diǎn)，為外源基因的插入提供位點(diǎn)；TT序列提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和polyA修飾信號(hào)；HIS4為營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)志；3‘AOX1基因片段能夠與基因組AOX1基因?qū)偻粗亟M；抗Amp基因和pBR322能使空載體和構(gòu)建的表達(dá)載體在E.coli中篩選和復(fù)制。以應(yīng)用于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的pPIC9載體為例解釋載體的構(gòu)件當(dāng)前第60頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)畢赤酵母分泌型表達(dá)載體啟動(dòng)外源基因的啟動(dòng)子：PGAPPTEF1PEMT，MCS：多克隆位點(diǎn)鑒定的標(biāo)記：6╳His，myc.終止子：AOX1TT，CYC1TT抗生素篩選標(biāo)記：zeocin.復(fù)制起始位點(diǎn)：pUCori當(dāng)前第61頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)III.酵母人工染色體（YAC）YAC:利用酵母的著絲粒序列（CEN）、酵母復(fù)制起始區(qū)（ARS）及端粒重復(fù)序列（TEL）構(gòu)建的人工染色體結(jié)構(gòu)：左臂：TEL、選擇標(biāo)記、ARS、CEN右臂：TEL、選擇標(biāo)記特點(diǎn)：容量大（200-800kb），穩(wěn)定性差作用：構(gòu)建基因組文庫(kù)當(dāng)前第62頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)

YAC載體中最常用的是pYAC4篩選標(biāo)記:His3:組氨酸合成缺陷性標(biāo)記URA3:尿嘧啶合成缺陷性標(biāo)記SUP4:赭石突變(ade2-1)抑制基因sup4當(dāng)前第63頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第64頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（二）受體細(xì)胞1、釀酒酵母：它具有作為宿主菌必須具備的許多條件，是最早應(yīng)用于外源基因克隆和表達(dá)的酵母菌。目前已表達(dá)了諸如乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細(xì)胞集落刺激因子等多種外源基因產(chǎn)物。其缺點(diǎn)是在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乙醇，影響酵母的生長(zhǎng)代謝和基因產(chǎn)物的表達(dá)。此外，釀酒酵母在蛋白質(zhì)的加工過(guò)程中會(huì)發(fā)生過(guò)度糖基化作用，其分泌表達(dá)能力也有待提高。當(dāng)前第65頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)表1-3在釀酒酵母中表達(dá)的重組蛋白種類(lèi)名稱(chēng)疫苗乙肝病毒表面抗原，瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白，HIV－1外殼蛋白診斷試劑丙肝病毒蛋白，HIV－1抗原人類(lèi)治療用蛋白藥物上皮生長(zhǎng)因子，胰島素，類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子，血小板源生長(zhǎng)因子，胰島素前體，成纖細(xì)胞生長(zhǎng)因子，集落刺激因子，α1抗胰蛋白酶，凝血因子X(jué)Ⅲa當(dāng)前第66頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)2、畢赤酵母：新發(fā)展的酵母受體細(xì)胞高表達(dá)（12mg/L）：AOX1啟動(dòng)子或GAP啟動(dòng)子高穩(wěn)定性：載體為整合型高分泌（10mg/L）：因子信號(hào)肽基因

在畢赤酵母中得到表達(dá)的重組異源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人腫瘤壞死因子、人表皮生長(zhǎng)因子、鏈激酶等幾十種。畢赤酵母的分泌表達(dá)能力比釀酒酵母強(qiáng)，但對(duì)其遺傳背景了解還比較少，且發(fā)酵周期也比較長(zhǎng)。當(dāng)前第67頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（三）轉(zhuǎn)化①鋰鹽法；②PEG法；③原生質(zhì)球法；④電穿孔法。

電穿孔法：效率較高,應(yīng)用最廣整合型載體轉(zhuǎn)化前要酶切線性化當(dāng)前第68頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（四）外源基因在酵母菌中的表達(dá)1、胞內(nèi)表達(dá)：直接表達(dá)外源基因

2、分泌表達(dá)：在MCS前加入信號(hào)肽序列pGAPZ,利用因子分泌表達(dá)當(dāng)前第69頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第70頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第71頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)人Endostatin基因的克隆、表達(dá)中國(guó)人胎肝總RNAEndostatincDNApGEM-T載體T-A克隆RT-PCR重組endostatin克隆載體pGAPZaA載體重組endostatin表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母菌ZeocinSDS陽(yáng)性重組子當(dāng)前第72頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第73頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)重組Endostatin的初步純化與抑制作用研究陽(yáng)性重組子大量擴(kuò)增、表達(dá)endostatin蛋白培養(yǎng)上清超濾濃縮SepharoseG25去鹽Heparin親和層析初步純化的重組endostatin蛋白濃縮液透析抑制作用研究體外作用ECV304細(xì)胞HepG2.2.15細(xì)胞體內(nèi)作用裸鼠人肝癌模型兔角膜新生血管當(dāng)前第74頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（五）高表達(dá)的策略1.利用誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子2.提高整合拷貝數(shù)3.控制蛋白酶降解活性4.分泌表達(dá)當(dāng)前第75頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（六）缺點(diǎn)不能實(shí)現(xiàn)全部的翻譯后修飾功能當(dāng)前第76頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)當(dāng)前第77頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行完全的翻譯后修飾可表達(dá)產(chǎn)生有功能的膜蛋白用途：表達(dá)大量的外源蛋白研究基因的功能基因治療

有效選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞，要求載體具備明顯的標(biāo)記基因當(dāng)前第78頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（一）幾種常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因1、胸苷激酶(tk)基因2、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因3、新霉素抗性基因(neo)、4、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因檢測(cè)系統(tǒng)5、黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因當(dāng)前第79頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)1、胸苷激酶（tk）基因胸腺嘧啶核苷激酶簡(jiǎn)稱(chēng)胸苷激酶（thymidineKinase,TK）在所有真核細(xì)胞中都有表達(dá),是嘧啶生物合成補(bǔ)救代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶,它可催化胸苷磷酸化轉(zhuǎn)變成為dTMP,繼續(xù)磷酸化生成dTTP,參與DNA的生物合成。當(dāng)前第80頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)tk+細(xì)胞中：胸苷(T)→胸苷-磷酸→TTP二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

TTPdCTPdATP

氨基喋呤(Aminopterin)

tk阻斷補(bǔ)加次黃嘌呤（H）死亡存活補(bǔ)救合成當(dāng)前第81頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)胸苷激酶(tk)基因HAT選擇法原理攜帶外源基因的載體連接有tk基因，可以表達(dá)胸苷激酶以tk－細(xì)胞為受體細(xì)胞在HAT（次黃嘌呤－氨基喋呤－胸苷）選擇培養(yǎng)基中，只有外源基因轉(zhuǎn)化成功的tk+細(xì)胞存活，tk-細(xì)胞死亡則陽(yáng)性重組子在HAT中篩選出來(lái)當(dāng)前第82頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)2、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

TTPdCTPdATP

氨基蝶呤氨甲喋呤阻斷當(dāng)前第83頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)二氫葉酸還原酶基因篩選法原理

攜帶外源基因的載體連接有dhfr基因，可以表達(dá)二氫葉酸還原酶以dhfr-細(xì)胞為受體：CHO細(xì)胞dhfr-細(xì)胞無(wú)法在普通培養(yǎng)基中存活，而轉(zhuǎn)化入dhfr基因后可以存活，并表達(dá)外源基因。若在培養(yǎng)基內(nèi)加入氨甲蝶呤，進(jìn)行加壓篩選，可以提高外源基因表達(dá)量。當(dāng)前第84頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)3、新霉素抗性基因(neo)新霉素的類(lèi)似物G418（gentamycin）對(duì)原核、真核細(xì)胞均有毒性。攜帶外源基因的載體連接有neo基因，neo編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶可滅活G418，因而，只有轉(zhuǎn)化入neo基因的細(xì)胞才能夠在含有G418的培養(yǎng)基中存活。此種篩選方法要求載體攜帶neo基因，而對(duì)受體細(xì)胞無(wú)要求，應(yīng)用更為簡(jiǎn)便。當(dāng)前第85頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)4、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因檢測(cè)系統(tǒng)

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（Cat）是由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9編碼的。Cat可催化氯霉素發(fā)生乙?；饔?，使其實(shí)去活性。雖然真核細(xì)胞不含有內(nèi)源性的Cat酶活性，但真核細(xì)胞的啟動(dòng)子可引發(fā)外源性Cat基因的表達(dá)。當(dāng)前第86頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)以Cat基因作為選擇標(biāo)記的原理將帶有Cat基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，就會(huì)合成Cat。哺乳動(dòng)物細(xì)胞本身不能合成Cat，所以只要在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中檢測(cè)到Cat的活性，即可肯定它是來(lái)自外源的Cat質(zhì)粒。特別適用于瞬時(shí)表達(dá)的研究。當(dāng)前第87頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)5、黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因XGPRT是由大腸桿菌Ecogpt基因編碼的一種核苷酸代謝酶，哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)XGPRT酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤核苷酸（XMP），但有鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤核苷酸（IMP）。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可通過(guò)IMP生成GMP。當(dāng)用IMP脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了GMP的合成，使細(xì)胞失去合成DNA能力而死亡。當(dāng)前第88頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）

基因篩選法原理將含XGPRT基因的重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中就能表達(dá)XGPRT酶，可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中通過(guò)XMP中間體補(bǔ)救合成GMP，使DNA合成正常進(jìn)行。加入霉酚酸后，陽(yáng)性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而未轉(zhuǎn)化的陰性細(xì)胞則受霉酚酸的抑制而死亡，以此可用來(lái)篩選陽(yáng)性細(xì)胞。當(dāng)前第89頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第90頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（二）外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物

細(xì)胞的載體質(zhì)粒型(非病毒型)載體病毒型載體當(dāng)前第91頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)啟動(dòng)子：病毒來(lái)源的：SV40、CMV、RSV細(xì)胞來(lái)源的：HSP、MCK（肌酸激酶）增強(qiáng)子:來(lái)源于SV40、RSV、CMV（在不同種屬細(xì)胞中都有極強(qiáng)的促進(jìn)轉(zhuǎn)錄能力）篩選標(biāo)記原核序列：復(fù)制子及篩選標(biāo)記真核復(fù)制起始點(diǎn)：提高外源基因表達(dá)水平轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和多聚腺苷酸化信號(hào)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的主要元件當(dāng)前第92頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)1.質(zhì)粒型載體由真核復(fù)制信號(hào)、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄單位及質(zhì)粒片段組成,不需要包裝細(xì)胞。如：pcDNA3、pVAX1、pEGFP-N1等。當(dāng)前第93頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第94頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)BGH：BovineGrowthHormone當(dāng)前第95頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)pVAX1的特點(diǎn)不僅具有在大腸桿菌中高拷貝復(fù)制和在多數(shù)哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)蛋白的特點(diǎn),而且pVAX1具有卡那霉素抗性,在人體內(nèi)產(chǎn)生變應(yīng)反應(yīng)者較少。pVAX1是由美國(guó)食品和藥品管理委員會(huì)（FDA）推薦的唯一可以應(yīng)用于人體實(shí)驗(yàn)的載體質(zhì)粒。迄今為止，關(guān)于pVAX1的研究已涉及動(dòng)物和臨床試驗(yàn)。當(dāng)前第96頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第97頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)pEGFP-N1載體具有以下幾方面特點(diǎn)：

①?gòu)慕Y(jié)構(gòu)上看，該質(zhì)粒具有很強(qiáng)的復(fù)制能力，可以滿(mǎn)足隨宿主細(xì)胞分裂時(shí)跟隨胞質(zhì)遺傳給新生的子細(xì)胞，這是保證目的基因穩(wěn)定表達(dá)的因素之一；

②含有高效的功能強(qiáng)大的啟動(dòng)子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)；

③具有多克隆位點(diǎn)，便于目的基因的插入；

④該載體具有neo基因，可以采用G418來(lái)篩選已成功轉(zhuǎn)染了該載體的靶細(xì)胞。

這些特殊的結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)目的基因在靶細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。

當(dāng)前第98頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)GFP的相關(guān)知識(shí)：

綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)基因來(lái)源于JellyfishAequoreaVictoria，是Shimomura等于1962年發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，由238個(gè)氨基酸組成，分子量約為27Kd。GFP在包括熱、極端PH和化學(xué)變性劑等苛刻條件下都很穩(wěn)定，用甲醛固定后會(huì)持續(xù)發(fā)出熒光，但在還原環(huán)境下熒光會(huì)很快熄滅。

當(dāng)前第99頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)與以往常用的報(bào)告基因相比，GFP具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①在熒光顯微鏡下，用波長(zhǎng)約490nm的紫外線激發(fā)后，即可觀察到綠色熒光，直接、簡(jiǎn)捷、便于檢測(cè)；

②無(wú)需任何的作用底物或共作用物,檢測(cè)的靈敏度不受反應(yīng)效率的影響，保證了極高的檢出率；

③蛋白本身性質(zhì)穩(wěn)定；

④可在多種異源生物中表達(dá)且無(wú)細(xì)胞毒性；

⑤其基因片段長(zhǎng)度較小(約717bp)，易于構(gòu)建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發(fā)活性，為研究其他基因表達(dá)產(chǎn)物的分布提供了方便。

當(dāng)前第100頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)EGFP是一種優(yōu)化的突變型GFP，使其產(chǎn)生的熒光較普通GFP強(qiáng)35倍，大大增強(qiáng)了其報(bào)告基因的敏感度。EGFP與其他蛋白的融合表達(dá)已有很多成功的例子，而且其N(xiāo)及C端均可融合，并不影響其發(fā)光。

當(dāng)前第101頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)2.病毒型載體外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重組DNA隨病毒顆粒而復(fù)制(多需輔助病毒或包裝細(xì)胞的存在)。如：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等當(dāng)前第102頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)病毒型載體的類(lèi)型整合型整合入宿主染色體，隨染色體復(fù)制而復(fù)制可持續(xù)表達(dá)外源基因安全性低：插入誘變SV40載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，腺相關(guān)病毒載體游離型不整合生物安全性高瞬時(shí)表達(dá)腺病毒載體，痘苗病毒載體當(dāng)前第103頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)SV40(猴空泡病毒40)載體dsDNA病毒，基因組約5.2kb基因結(jié)構(gòu)清楚,含有整套基因表達(dá)調(diào)控序列早期區(qū)：T、t抗原（腫瘤蛋白質(zhì)或抗原）T抗原是細(xì)胞轉(zhuǎn)化的啟動(dòng)所必須的。t抗原對(duì)于細(xì)胞的轉(zhuǎn)化不是必需的，但可起加強(qiáng)作用。

晚期區(qū)：產(chǎn)生病毒衣殼蛋白（VP1，VP2及VP3)，包裝病毒顆粒所必需復(fù)制起始位點(diǎn)：早、晚區(qū)基因之間當(dāng)前第104頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第105頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)特點(diǎn)載體構(gòu)建：早期取代晚期取代天然SV40載體宿主范圍窄，容量?。?.5kb）易形成野生型病毒溶源生長(zhǎng)：導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解死亡故較少使用，做瞬時(shí)轉(zhuǎn)染用（轉(zhuǎn)化COS細(xì)胞），或利用其調(diào)控元件。pSV系列由SV40派生的一系列質(zhì)粒型載體當(dāng)前第106頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第107頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第108頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(RV)

基因組結(jié)構(gòu)：ssRNA(9.2kb)LTRgagpolenvLTRφLTR（longterminalrepeat）:長(zhǎng)末端重復(fù)序列,含啟動(dòng)子和polyA信號(hào),介導(dǎo)病毒整合。φ包裝信號(hào)：是包裝病毒顆粒時(shí)所必須的非編碼序列。結(jié)構(gòu)蛋白：核心蛋白(gag)、逆轉(zhuǎn)錄酶（pol)、衣殼蛋白(env)。當(dāng)前第109頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第110頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒穿梭載體pLXSNMCS當(dāng)前第111頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)載體元件：LTR、標(biāo)記基因及質(zhì)粒部分組成逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)包括：一個(gè)含有目的基因的表達(dá)載體；一個(gè)編碼VSV-G（皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G，是一種包膜蛋白，具有廣泛的宿主范圍）的輔助質(zhì)粒；表達(dá)gag/pol的輔助質(zhì)粒；293T（人胚腎細(xì)胞）包裝細(xì)胞。

當(dāng)前第112頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：宿主范圍廣，能感染多種動(dòng)物和人類(lèi)的不同類(lèi)型的細(xì)胞而無(wú)嚴(yán)格的組織特異性；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠高效地感染分裂的宿主細(xì)胞，感染細(xì)胞后能夠?qū)⑤d體基因組穩(wěn)定整合到宿主基因組的隨機(jī)位點(diǎn)上，使目的基因長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒的免疫原性較低。缺點(diǎn)：只能感染分裂細(xì)胞，而不能感染非分裂細(xì)胞；能夠插人的外源基因較小(7～8kb)，難以滿(mǎn)足較大基因的轉(zhuǎn)移；載體DNA整合人宿主染色體是隨機(jī)的，并因隨機(jī)整合使原癌基因激活或抑癌基因失活，從而具有引發(fā)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)；

當(dāng)前第113頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)目的基因

RV穿梭載體

包裝細(xì)胞系重組RV載體E．coli大量擴(kuò)增病毒載體DNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒受體細(xì)胞

表達(dá)蛋白，研究宿主細(xì)胞性狀克隆共轉(zhuǎn)染感染轉(zhuǎn)化輔助質(zhì)粒篩選、擴(kuò)增當(dāng)前第114頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)

慢病毒載體（lentivirus）屬逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬，是一類(lèi)非鼠源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，以人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）為代表。慢病毒源性載體（lentivirus-basedvector，LV）：能將外源基因整合入非分裂細(xì)胞的基因組內(nèi)。無(wú)明顯免疫反應(yīng)，長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。具有嚴(yán)格的宿主范圍、滴度低及HIV-1獨(dú)特的致病性，限制了它作為轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用。主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)染神經(jīng)元，效果好于腺相關(guān)病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

當(dāng)前第115頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第116頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)腺相關(guān)病毒載體（AAV）腺相關(guān)病毒：Adeno-AssociatedVirus，AAV線狀單鏈DNA病毒，4.7kb，缺陷型非病原性人類(lèi)細(xì)小病毒，只有與腺病毒、單純皰疹病毒等共感染時(shí)才能進(jìn)行有效復(fù)制。感染細(xì)胞范圍廣，可感染分裂期與分裂后期細(xì)胞野生型病毒可定點(diǎn)整合人類(lèi)19號(hào)染色體長(zhǎng)臂，基因表達(dá)穩(wěn)定;

當(dāng)前第117頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)缺點(diǎn)外源基因插入容量?。?kb以下）感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒低制備滴度低存在一定的免疫反應(yīng)主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)染骨骼肌、視網(wǎng)膜、肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等當(dāng)前第118頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)腺病毒（Ad）載體基因結(jié)構(gòu)：dsDNA,線性，36kbφE1A

E1BL1E3E2AE2BE4Φ：包裝信號(hào)E1—E4:結(jié)構(gòu)蛋白當(dāng)前第119頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)載體構(gòu)建：取代結(jié)構(gòu)基因特點(diǎn)：安全性高(人為自然宿主，不整合)滴度高（1011pfu/ml）容量大（--36kb)可感染非分裂細(xì)胞可直接體內(nèi)應(yīng)用，原位感染組織是目前基因治療的最常用載體缺點(diǎn)：免疫原性高，表達(dá)時(shí)間短無(wú)組織特異性真核細(xì)胞內(nèi)篩選復(fù)雜，費(fèi)時(shí)當(dāng)前第120頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)AdEasy-1systemAdEasy-1system具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.效率高：可以感染分裂期與靜止期細(xì)胞2.篩選方便：帶有目的基因的穿梭載體與病毒骨架質(zhì)粒的同源重組發(fā)生于原核細(xì)胞（如細(xì)菌）內(nèi)。3.生物安全性高：不整合4.插入容量大當(dāng)前第121頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)AdEasy-1system包括：腺病毒穿梭載體：可連接外源基因骨架質(zhì)粒：含有腺病毒大部分結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒，pAdEasy-1受體細(xì)胞：E.coliBJ5183包裝細(xì)胞：轉(zhuǎn)入E1或E4基因區(qū)的HEK293（人胚腎細(xì)胞）或911細(xì)胞（人胚視網(wǎng)膜細(xì)胞）當(dāng)前第122頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)穿梭載體當(dāng)前第123頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第124頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)痘苗病毒載體容量大安全性好：長(zhǎng)期用作預(yù)防天花的疫苗可用來(lái)構(gòu)建多價(jià)疫苗

當(dāng)前第125頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)常用的病毒載體的特點(diǎn)：當(dāng)前第126頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（三）受體細(xì)胞1、CHO細(xì)胞（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢癌細(xì)胞）可穩(wěn)定表達(dá)外源基因，并可大規(guī)模生產(chǎn)藥物、抗體及診斷試劑，被美國(guó)FDA確認(rèn)為基因工程受體細(xì)胞。2、COS細(xì)胞（猴腎細(xì)胞系）能瞬時(shí)大量表達(dá)外源蛋白，是進(jìn)行外源基因瞬時(shí)表達(dá)時(shí)用途最廣的宿主細(xì)胞。3、其他細(xì)胞：如腫瘤細(xì)胞Hela(人宮頸癌細(xì)胞）等。當(dāng)前第127頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（四）重組載體導(dǎo)入細(xì)胞的方法當(dāng)前第128頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)1.病毒感染：借用病毒的感染方式，將外源基因事先插入到病毒的基因組中，并用適當(dāng)?shù)姆绞桨b成有感染活性的重組病毒顆粒，用于感染細(xì)胞，從而將外源病毒導(dǎo)入到相應(yīng)的細(xì)胞中。常用：逆轉(zhuǎn)錄病毒；腺病毒；皰疹病毒等。優(yōu)點(diǎn)：整和效率高,可使外源基因在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá),適用于難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞。缺點(diǎn)：重組病毒建立有一定難度；存在潛在的安全危險(xiǎn)性。當(dāng)前第129頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)目的基因

AdV穿梭載體

包裝細(xì)胞HEK293

重組AdV載體E．coli

BJ5183同源重組陽(yáng)性的腺病毒基因組載體DNA重組rAd病毒顆粒受體細(xì)胞

表達(dá)蛋白，研究宿主細(xì)胞性狀克隆轉(zhuǎn)染感染骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化E．coli

擴(kuò)增轉(zhuǎn)化Ecoli擴(kuò)增當(dāng)前第130頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)圖1：復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體制備原理圖圖2輔助病毒依賴(lài)型腺病毒載體制備示意圖當(dāng)前第131頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)2.轉(zhuǎn)染：外源DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中的非病毒方法，通常稱(chēng)為轉(zhuǎn)染。分化學(xué)方法和物理方法。理想的轉(zhuǎn)染方法：操作簡(jiǎn)單、高效、低毒、對(duì)細(xì)胞正常生理狀況影響小、重復(fù)性好、成本低。磷酸鈣共沉淀法陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移電穿孔顯微注射基因槍當(dāng)前第132頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)Atypicalmammalianexpressionvectorforhigh-levelproteinexpression當(dāng)前第133頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣有利于促進(jìn)外源DNA與靶細(xì)胞表面結(jié)合,氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定的比例混和,形成極小的磷酸鈣-DNA復(fù)合物沉淀黏附在細(xì)胞膜表面,借助內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對(duì)于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。當(dāng)前第134頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)磷酸鈣共沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類(lèi)動(dòng)物,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率低：進(jìn)入細(xì)胞的DNA只有１％－５％可以進(jìn)入細(xì)胞核,其中只有不到１％的DNA可以與細(xì)胞DNA整合,在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。重復(fù)性不佳：pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應(yīng)時(shí)間、細(xì)胞孵育時(shí)間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。當(dāng)前第135頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移法中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。

當(dāng)前第136頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體,DNA并沒(méi)有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物,從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面,經(jīng)過(guò)內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。當(dāng)前第137頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)脂質(zhì)體介導(dǎo)方法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：適用于把ＤＮＡ轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞,可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染效率高,比磷酸鈣法高5-100倍；能夠把ＤＮＡ和ＲＮＡ轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞,轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性好,可重復(fù)性高,轉(zhuǎn)染時(shí)最好不加血清和抗生素。缺點(diǎn)：陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對(duì)較高,對(duì)部分細(xì)胞可能會(huì)干擾細(xì)胞的代謝。當(dāng)前第138頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移

配體寡肽E5針對(duì)細(xì)胞表面受體（IGFRI，II）HA20流感病毒血凝素功能域20肽，作為內(nèi)吞小體釋放寡肽多聚陽(yáng)離子多肽PCP多聚賴(lài)氨酸（PL）攜帶外源基因的質(zhì)粒DNA當(dāng)前第139頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)質(zhì)粒DNAE5-PCP-PLHA20-PCP-PLHA20：破壞溶酶體膜E5：特異性導(dǎo)入肝癌細(xì)胞吞噬溶酶體當(dāng)前第140頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)電穿孔介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移法

靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞.

當(dāng)前第141頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)電穿孔法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率較高缺點(diǎn)：需要昂貴的儀器（電穿孔儀）；對(duì)細(xì)胞的損傷較大,每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA；每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化.

當(dāng)前第142頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)其它方法顯微注射：借助顯微注射器直接把DNA注入核內(nèi),使之整合入受體細(xì)胞基因組中.優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率高,可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。缺點(diǎn)：導(dǎo)入DNA時(shí)需要一個(gè)細(xì)胞一個(gè)細(xì)胞注射,不適合大量轉(zhuǎn)染?；驑?zhuān)阂蕾?lài)攜帶了核酸的高速粒子將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi).

當(dāng)前第143頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)基因體內(nèi)治療方法exvivo途徑：即體外細(xì)胞介導(dǎo)法，通過(guò)移植攜帶靶基因的工程細(xì)胞完成目的基因轉(zhuǎn)移，是基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和腦內(nèi)移植技術(shù)的結(jié)合。特點(diǎn)：經(jīng)典、安全，效果較易控制，但是存在操作步驟多、技術(shù)復(fù)雜、難度大及若采用人類(lèi)胚胎細(xì)胞則涉及倫理學(xué)問(wèn)題。

invivo途徑：即體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染法，是體內(nèi)基因治療的直接途徑，操作簡(jiǎn)便、易推廣，但方法尚不成熟、未能解決療效短、免疫和安全問(wèn)題。包括非病毒介導(dǎo)途徑與病毒載體介導(dǎo)途徑。

當(dāng)前第144頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)目的基因靶細(xì)胞體外擴(kuò)增工程細(xì)胞或基因修飾的細(xì)胞篩選鑒定腦內(nèi)靶區(qū)Minipump分泌營(yíng)養(yǎng)因子，神經(jīng)遞質(zhì)，酶

移植

當(dāng)前第145頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)基因的體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移方法非病毒類(lèi)載體介導(dǎo)途徑：通過(guò)物理法、化學(xué)法或融合法直接將目的基因?qū)塍w內(nèi)。1）裸DNA2）脂質(zhì)體(Liposome)介導(dǎo)：Lipid/DNAcomplex3）基因槍?zhuān)夯驑屖且环N專(zhuān)門(mén)用于基因轉(zhuǎn)移的高壓槍,可以把平均直徑約為4μm的鎢等金屬粒子射入細(xì)胞中,若將目的DNA附著在金屬粒子表面,就可以實(shí)現(xiàn)基因的直接轉(zhuǎn)移。

4）電轉(zhuǎn)移法：體內(nèi)電轉(zhuǎn)移是適用于向各種組織和器官轉(zhuǎn)運(yùn)基因的一種物理方法,而且成本低、最易實(shí)現(xiàn)、安全性高,其效率還可通過(guò)改善靶組織的生物擾動(dòng)性、質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)和編碼蛋白的設(shè)計(jì)來(lái)提高。當(dāng)前第146頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)病毒類(lèi)載體介導(dǎo)途徑：將無(wú)復(fù)制能力含外源基因的重組病毒直接應(yīng)用于患者體內(nèi)。雖然病毒載體作為基因傳遞的工具已廣泛采用,但病毒性載體仍存在著不少的局限性:如均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生某種程度的免疫反應(yīng),具有插入突變致瘤、致毒的風(fēng)險(xiǎn),載體的容量有限,制備滴度不高等。

當(dāng)前第147頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：外源基因?qū)氲讲溉閯?dòng)物細(xì)胞后1～4天，就可以檢測(cè)到基因的表達(dá)情況。表達(dá)完全由導(dǎo)入的質(zhì)粒來(lái)執(zhí)行，絕大多數(shù)質(zhì)粒沒(méi)有整合到染色體上而被降解或隨細(xì)胞分裂而丟失。永久轉(zhuǎn)染：導(dǎo)入的基因整合到細(xì)胞的染色體DNA中。

（五）外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)方式當(dāng)前第148頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（六）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)需要組織培養(yǎng)篩選時(shí)間長(zhǎng)價(jià)格昂貴當(dāng)前第149頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)當(dāng)前第150頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)具有真核細(xì)胞的翻譯后修飾功能；

正確的蛋白折疊、二硫鍵形成，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白；

高表達(dá)量，最高表達(dá)量可達(dá)昆蟲(chóng)細(xì)胞蛋白總量的50%；

可表達(dá)非常大的外源性基因（～200kD）；

具有在同一個(gè)感染昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因的能力；

對(duì)脊椎動(dòng)物是安全的。當(dāng)前第151頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)(一)昆蟲(chóng)桿狀病毒載體1、昆蟲(chóng)桿狀病毒許多農(nóng)林業(yè)昆蟲(chóng)的天敵，對(duì)人無(wú)寄生能力，安全性高?；蚪M特點(diǎn)：Baculivirus基因組龐大具復(fù)制非必需區(qū)，可用于改造為基因工程載體（多角體蛋白編碼序列、P10蛋白序列）當(dāng)前第152頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第153頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)2、桿狀病毒載體轉(zhuǎn)移載體

轉(zhuǎn)移載體（transfervector):同時(shí)含有原核序列(復(fù)制起始信號(hào)、抗性基因)和病毒基因組序列的載體,除可攜帶外源基因在原核中復(fù)制、擴(kuò)增外，還可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)同源重組，將外源基因插入病毒基因組，構(gòu)建重組病毒。當(dāng)前第154頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)基本元件原核序列：ori、抗性基因桿狀病毒啟動(dòng)子桿狀病毒復(fù)制非必需區(qū)MCS當(dāng)前第155頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第156頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（二）受體細(xì)胞1、sf（秋粘蟲(chóng)）細(xì)胞2、Bm（家蠶）細(xì)胞3、昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)當(dāng)前第157頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)（三）以桿狀病毒為載體表達(dá)目的基因的流程圖

當(dāng)前第158頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)三、基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)NorthernBlot、RT-PCR蛋白翻譯水平檢測(cè)ELISA、WesternBlot生物活性檢測(cè)根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物特性進(jìn)行設(shè)計(jì)當(dāng)前第159頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第160頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)RNA干擾將與mRNA對(duì)應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被稱(chēng)為RNA干擾（RNAi）。當(dāng)前第161頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)

siRNA誘導(dǎo)干擾復(fù)合體(siRNAinducedinterferencecomplex,RISC),依賴(lài)于RNA的RNA聚合酶(RNA2dependentRNApolymerase,RdRP)當(dāng)前第162頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)RNAi研究的一般技術(shù)路線當(dāng)前第163頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)當(dāng)前第164頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)

各種siRNA制備方法比較比較項(xiàng)目

化學(xué)合成siRNA

DNA載體shRNA

Lentiviral-shRNA

siRNA結(jié)構(gòu)

雙鏈RNA或發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA

發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA

發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA

RNA干擾持續(xù)時(shí)間

<72小時(shí)

<10天

>30天

適合的細(xì)胞系

轉(zhuǎn)染效率大于70%的細(xì)胞

轉(zhuǎn)染效率大于20%

但是可以傳代的細(xì)胞

幾乎所有細(xì)胞

單次制備費(fèi)用

低

中

高

重復(fù)使用費(fèi)用

中

低

低

是否可自行擴(kuò)增

不可以

可以

不可以

構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)siRNA

的細(xì)胞株

不滿(mǎn)足

滿(mǎn)足，但有風(fēng)險(xiǎn)

滿(mǎn)足，可以同時(shí)制備

多種穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系

組織特異性干擾實(shí)驗(yàn)

不滿(mǎn)足

滿(mǎn)足

滿(mǎn)足

干細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)

不滿(mǎn)足

不滿(mǎn)足

滿(mǎn)足

裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)

低重復(fù)性

低重復(fù)性

高重復(fù)性

轉(zhuǎn)基因knockdown實(shí)驗(yàn)

不滿(mǎn)足

不滿(mǎn)足

滿(mǎn)足

當(dāng)前第165頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)SiRNA的一般設(shè)計(jì)原則（1）從mRNA的AUG起始密碼開(kāi)始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議不要針對(duì)5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslatedregions，UTRs）。這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。（2）將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST。（3）選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

當(dāng)前第166頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞siRNAs需要進(jìn)入細(xì)胞后才能對(duì)蛋白的表達(dá)進(jìn)行抑制，因此將其高效地轉(zhuǎn)入細(xì)胞也是研究成功與否的關(guān)鍵步驟。例如，一個(gè)siRNA對(duì)某個(gè)特定基因表達(dá)的抑制效率是90%，但是其轉(zhuǎn)染效率只有10%，那么總的抑制率只有9%。目前傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法與試劑的效果都不是很理想。但是有專(zhuān)門(mén)的RNA轉(zhuǎn)染試劑，其原理也是基于脂質(zhì)體技術(shù)，可用于多種真核細(xì)胞的RNAi研究。當(dāng)前第167頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)陰性對(duì)照一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照。可以確認(rèn)基因表達(dá)水平的降低是否是序列特異性的RNAi的結(jié)果。作為負(fù)對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒(méi)有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒(méi)有同源性。

當(dāng)前第168頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)該選用針對(duì)看家基因（GAPDH、ACTB）的siRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)這條實(shí)驗(yàn)途徑是可行的?？瞻讓?duì)照不等于陰性對(duì)照，空白對(duì)照是不加siRNA的結(jié)果。當(dāng)前第169頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\14點(diǎn)RNAi的效果分析可從mRNA和蛋白質(zhì)兩方面進(jìn)行。mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern雜交等。蛋白質(zhì)：Western雜交；ELISA；免疫熒光等。細(xì)胞的代謝過(guò)程，生理生化系數(shù)等表型參數(shù)的變化是RNAi效果最終和最大的體現(xiàn)。當(dāng)前第170頁(yè)\共有180頁(yè)\編于星期四\