分子生物學(xué)第一章緒 論

一、分子生物學(xué)的基本含義分子生物學(xué)是從分子水平研究生命本質(zhì)為目的的一門新興邊緣學(xué)科，它以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳信息和細(xì)胞信息傳遞中的作用為研究對象，是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快并正在與其它學(xué)科廣泛交叉與滲透的重要前沿領(lǐng)域。所謂在分子水平上研究生命的本質(zhì)主要是指對遺傳、

生殖、生長和發(fā)育等生命基本特征的分子機(jī)理的闡明，從而為利用和改造生物奠定理論基礎(chǔ)和提供新的手段。當(dāng)前第1頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)分子水平指的是那些攜帶遺傳信息的核酸和在遺傳信息傳遞及細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間通訊過程中發(fā)揮著重要作用的蛋白質(zhì)等生物大分子。生物大分子均具有較大的分子量，由簡單的小分子核苷酸或氨基酸排列組合以蘊(yùn)藏各種信息，并且具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)以形成精確的相互作用系統(tǒng)，由此構(gòu)成生物的多樣化和生物個(gè)體精確的生長發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)。闡明這些復(fù)雜的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是分子生物學(xué)的主要任務(wù)。當(dāng)前第2頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)Mendel的遺傳因子階段摩爾根的基因階段順反子階段現(xiàn)代基因階段一、基因的發(fā)展當(dāng)前第3頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)Mendel的遺傳因子階段Mendel提出：生物的某種性狀是由遺傳因子負(fù)責(zé)傳遞的。是顆粒性的，體細(xì)胞內(nèi)成雙存在，生殖細(xì)胞內(nèi)成單存在。遺傳因子是決定性狀的抽象符號。1866年發(fā)表論文，提出分離規(guī)律和獨(dú)立分配規(guī)律；1900年Mendel遺傳規(guī)律被重新發(fā)現(xiàn)當(dāng)前第4頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)1909年丹麥遺傳學(xué)家Yohannsen(1859-1927)發(fā)表了“純系學(xué)說”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel“遺傳因子”的概念。但沒有提出基因的物質(zhì)概念。當(dāng)前第5頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)Morgan的基因階段MorganT.H.等提出了基因的連鎖遺傳規(guī)律。說明了基因是在染色體上占有一定空間的實(shí)體?；虿辉偈浅橄蠓枺毁x予物質(zhì)內(nèi)涵。當(dāng)前第6頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)順反子階段1957年，本澤爾（SeymourBenzer）以T4噬菌體為材料，在DNA分子水平上研究基因內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)，提出了順反子（cistron）概念。順反子是1個(gè)遺傳功能單位，1個(gè)順反子決定1條多肽鏈。當(dāng)前第7頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)當(dāng)前第8頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)現(xiàn)代基因階段操縱子（operon）：結(jié)構(gòu)基因+調(diào)控元件+調(diào)節(jié)基因LacOperon當(dāng)前第9頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)2．跳躍基因

指DNA能在有機(jī)體的染色體組內(nèi)從1個(gè)地方跳到另一個(gè)地方，它們能從1個(gè)位點(diǎn)切除，然后插入同一或不同染色體上的另一個(gè)位置。3．?dāng)嗔鸦?/p>

1個(gè)基因被間隔區(qū)分成不連續(xù)的若干區(qū)段，這種編碼序列不連續(xù)的間斷基因被稱為斷裂基因。4．假基因

不能合成出功能蛋白質(zhì)的失活基因

。5．重疊基因

不同基因的核苷酸序列有時(shí)是可以共用的即重疊的。當(dāng)前第10頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)1983年，McClintock由于在50年代提出并發(fā)現(xiàn)了可移動(dòng)遺傳因子（jumpinggene或稱mobileelement）而獲得Nobel獎(jiǎng)。BarbraMcClintock當(dāng)前第11頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)1993年，美國科學(xué)家Roberts和Sharp因發(fā)現(xiàn)斷裂基因(introns)而獲得Nobel獎(jiǎng)當(dāng)前第12頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)Gene的定義“基因”的分子生物學(xué)定義是：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。Agenecanbedefinedasfollowing:

TheentirenucleicacidsequencethatisnecessaryforthesynthesisofafunctionalpolypeptideorRNAmolecule.當(dāng)前第13頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)分子生物學(xué)發(fā)展簡史當(dāng)前第14頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)19世紀(jì)后期到20世紀(jì)50年代初，是現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的準(zhǔn)備和醞釀階段。在這一階段產(chǎn)生了兩點(diǎn)對生命本質(zhì)的認(rèn)識上的重大突破.確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)確定了DNA是生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)一、準(zhǔn)備和醞釀階段當(dāng)前第15頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)19世紀(jì)末Buchner兄弟證明酵母無細(xì)胞提取液能使糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名稱，酶是生物催化劑。20世紀(jì)20-40年代提純和結(jié)晶了一些酶（包括尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、黃酶、細(xì)胞色素C、肌動(dòng)蛋白等），證明酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)生命的許多基本現(xiàn)象（物質(zhì)代謝、能量代謝、消化、呼吸、運(yùn)動(dòng)等）都與酶和蛋白質(zhì)相聯(lián)系，可以用提純的酶或蛋白質(zhì)在體外實(shí)驗(yàn)中重復(fù)出來。在此期間對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識也有較大的進(jìn)步。1902年EmilFisher證明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是多肽；40年代末，Sanger創(chuàng)立二硝基氟苯（DNFB）法、Edman發(fā)展異硫氰酸苯酯法分析肽鏈N端氨基酸；1953年Sanger和Thompson完成了第一個(gè)多肽分子--胰島素A鏈和B鏈的氨基全序列分析。由于結(jié)晶X-線衍射分析技術(shù)的發(fā)展，1950年P(guān)auling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)模型。所以在這階段對蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)都有了認(rèn)識。當(dāng)前第16頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)遺傳物質(zhì)是核酸的確定肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)煙草花葉病毒的重建實(shí)驗(yàn)當(dāng)前第17頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)當(dāng)前第18頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)當(dāng)前第19頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)結(jié)論：加熱殺死的S型菌有某種轉(zhuǎn)化因子當(dāng)前第20頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)Avery在1944年更精密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提取可能的轉(zhuǎn)化因子：DNA、RNA、蛋白質(zhì)、莢膜進(jìn)行試驗(yàn)分別用降解DNA、RNA、蛋白質(zhì)的酶作用于S型菌細(xì)胞抽提物組分提純試驗(yàn)結(jié)果：DNA組分純度越高，轉(zhuǎn)化效率越高。結(jié)論：使R型菌變?yōu)镾型菌的物質(zhì)是S型菌的DNA當(dāng)前第21頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)Avery在1944年的報(bào)告中這樣寫道：當(dāng)溶液中酒精的體積達(dá)到9/10時(shí)，有纖維狀物質(zhì)析出；如稍加攪動(dòng)，這種物質(zhì)便會(huì)像棉線繞在線軸上一樣繞在硬棒上，溶液中的其他成分則以顆粒狀沉淀留在下面。溶解纖維狀物質(zhì)并重復(fù)沉淀數(shù)次，可提高其純度。這一物質(zhì)具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性，初步實(shí)驗(yàn)證實(shí)它很可能就是DNA。當(dāng)前第22頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)T2噬菌體感染試驗(yàn)

（1952年，Hershey&Chase）

當(dāng)前第23頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)當(dāng)前第24頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)病毒重建試驗(yàn)雜種病毒的感染特征和蛋白質(zhì)外殼的特性是由其中的RNA決定的，而不是蛋白質(zhì)決定的當(dāng)前第25頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)結(jié)論證明核酸（DNA或RNA）是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)簡單的細(xì)菌（或病毒）解決復(fù)雜而重大的問題微生物與高等生物具有共同的遺傳本質(zhì)當(dāng)前第26頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)二、現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段當(dāng)前第27頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)1962年，Watson和Crick因?yàn)樵?953年5月25日的《Nature》提出DNA的反向平行雙螺旋模型而與Wilkins共獲Noble生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，后者通過X射線衍射證實(shí)了Watson-Crick模型。Watson和Crick所提出的脫氧核糖酸雙螺旋模型，為充分揭示遺傳信息的傳遞規(guī)律鋪平了道路。1、DNA雙螺旋模型的提出當(dāng)前第28頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962：fortheirdiscoveriesconcerningthemolecularstructureofnucleicacidsanditssignificanceforinformationtransferinlivingmaterial.

當(dāng)前第29頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)Wilkins通過對DNA分子的X射線衍射研究證實(shí)了該模型。RosalindE.Franklin1920-1958當(dāng)前第30頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)被遺忘的英格蘭玫瑰

RosalindE.Franklin1920-1958當(dāng)前第31頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)在發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)同時(shí)，Watson和Crick就提出DNA復(fù)制的可能模型。其后在1956年A.Kornbery首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶；1958年Meselson及Stahl用同位素標(biāo)記和超速離心分離實(shí)驗(yàn)為DNA半保留模型提出了證明；1968年Okazaki（岡畸）提出DNA不連續(xù)復(fù)制模型；1972年證實(shí)了DNA復(fù)制開始需要RNA作為引物；70年代初獲得DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，并對真核DNA聚合酶特性做了分析研究。

完善了對DNA復(fù)制機(jī)理的認(rèn)識3、中心法則和操縱子學(xué)說的提出當(dāng)前第32頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)以Nireberg等為代表的一批科學(xué)家經(jīng)過艱苦的努力，確定了遺傳信息以密碼方式傳遞，每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子，代表一個(gè)氨基酸，到1966年，全部破譯了64個(gè)密碼子，并提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”。當(dāng)前第33頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)在研究DNA復(fù)制將遺傳信息傳給子代的同時(shí)，提出了RNA在遺傳信息傳到蛋白質(zhì)過程中起著中介作用的假說。1958年Weiss及Hurwitz等發(fā)現(xiàn)依賴于DNA的RNA聚合酶；1961年Hall和Spiegelman用RNA-DNA雜交證明mRNA與DNA序列互補(bǔ)；逐步闡明了RNA轉(zhuǎn)錄合成的機(jī)理。當(dāng)前第34頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)

1968年，Nirenberg，Holley和Khorana共享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)Nirenberg：破譯DNA遺傳密碼；Holley：闡明了酵母丙氨酸t(yī)RNA的核苷酸序列，并證實(shí)了所有tRNA具有結(jié)構(gòu)上的相似性；Khorana：第一個(gè)合成了核酸分子，并且人工復(fù)制了酵母基因。當(dāng)前第35頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)中心法則

Crick于1954年所提出的遺傳信息傳遞規(guī)律1954年首次提出的“中心法則”1970-1980年的“中心法則”21世紀(jì)后修正的“中心法則”當(dāng)前第36頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)1961年，法國科學(xué)家Jacob和Monod提出并證實(shí)了操縱子（operon）作為調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞代謝的分子機(jī)制。他們還推測存在一種與DNA序列相互補(bǔ)、能將它所編碼的遺傳信息帶到蛋白質(zhì)合成場所并翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)的mRNA（信使核糖核酸）。對分子生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了極其重要的指導(dǎo)作用。當(dāng)前第37頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)FrancoisJacob(Left),JacquesMonod(Center)&AndreLwoff(Right),1965分享了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)當(dāng)前第38頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)三、初步認(rèn)識生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段當(dāng)前第39頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用1970年Smith等分離并純化了限制性核酸內(nèi)切酶HindII；1972年，H.W.Boyer等相繼發(fā)現(xiàn)了EcoRI一類重要的限制性內(nèi)切酶。1967年，世界上有五個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)DNA連接酶，特別是1970年H.G.Khorana等發(fā)現(xiàn)的T4DNA連接酶具有更高的連接活性。1970年，Baltimore等和Temin等在RNA腫瘤病毒中各自發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶，完善了中心法則，用于構(gòu)建cDNA文庫。1.重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展當(dāng)前第40頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)1970年Smith等分離并純化了限制性核酸內(nèi)切酶HindII；1972年，H.W.Boyer等相繼發(fā)現(xiàn)了EcoRI一類重要的限制性內(nèi)切酶。當(dāng)前第41頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)1967年，世界上有五個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)DNA連接酶，特別是1970年H.G.Khorana等發(fā)現(xiàn)的T4DNA連接酶具有更高的連接活性。當(dāng)前第42頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)1970年，Baltimore等和Temin等在RNA腫瘤病毒中各自發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶。當(dāng)前第43頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)當(dāng)前第44頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)載體的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用載體主要是小分子量的復(fù)制子如：病毒、噬菌體、質(zhì)粒。1972年，美國Stanford大學(xué)的P.Berg等首次成功地實(shí)現(xiàn)了DNA的體外重組；pSC101質(zhì)粒載體，ColE1質(zhì)粒載體，pBR322質(zhì)粒載體，pUC質(zhì)粒載體，pGEM-3Z質(zhì)粒，穿梭質(zhì)粒載體，pBluescript噬菌粒載體etc.當(dāng)前第45頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)當(dāng)前第46頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)在多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）的兩側(cè)，存在一對T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子，用以定向指導(dǎo)插入在多克隆位點(diǎn)上的外源基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)；具有單鏈?zhǔn)删wM13或f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)來自ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，保證pBluescript噬菌粒載體在有或無輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復(fù)制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA；編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因，作為轉(zhuǎn)化子克隆的選擇標(biāo)記；含有一個(gè)lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學(xué)顯色法篩選噬菌粒載體的重組子。當(dāng)前第47頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn) LacZ編碼β-半乳糖苷酶氨基端146個(gè)氨基酸的α-肽，IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)該基因表達(dá)，合成的β-半乳糖苷酶α-肽能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶相互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶，能水解外源加入培養(yǎng)基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成藍(lán)色的溴氯吲哚，使生長于含X-gal培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化菌落呈藍(lán)色。當(dāng)前第48頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞技術(shù)1944年，肺炎鏈球菌被成功轉(zhuǎn)化。1970年，大腸桿菌才被成功轉(zhuǎn)化，得益于CaCl2的應(yīng)用當(dāng)前第49頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)轉(zhuǎn)化定義：同源或異源的游離DNA分子(質(zhì)粒和染色體DNA)被自然或人工感受態(tài)細(xì)胞攝取，并得到表達(dá)的基因轉(zhuǎn)移過程。感受態(tài)細(xì)胞：具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞。當(dāng)前第50頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)當(dāng)前第51頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)自然遺傳轉(zhuǎn)化1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（S.pneumoniae）的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。目前已知有二十多個(gè)種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力:枯草芽孢桿菌：20%細(xì)胞出現(xiàn)感受態(tài)，持續(xù)幾小時(shí)；肺炎鏈球菌：培養(yǎng)后100%細(xì)胞為感受態(tài)；、大腸桿菌不能出現(xiàn)自然的感受態(tài)狀態(tài)。必備條件：1.建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞；2.外源游離DNA分子。當(dāng)前第52頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)人工轉(zhuǎn)化在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。不是由細(xì)菌自身的基因所控制；用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高，因?yàn)橘|(zhì)粒的轉(zhuǎn)化多數(shù)情況下不涉及重組過程。當(dāng)前第53頁\共有56頁\編于星期五\17點(diǎn)2、基因組研究的發(fā)展分子生物學(xué)已經(jīng)從研究單個(gè)