生物工程制藥之基因工程制藥

生物工程制藥之基因工程制藥第一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日

基因工程技術(shù)就是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌，實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。

第二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.1基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥物的優(yōu)點：1、大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽，為臨床使用提供有效的保障；2、可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍3、可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；4、內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時存在的不足之處，可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除；5、可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源。

第三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.2基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程

目的基因的克隆；構(gòu)建DNA重組體；將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌；工程菌的發(fā)酵；外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化；產(chǎn)品的檢驗等。第四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.2.1制備基因工程藥物的一般程序：

獲得目的基因

組建重組質(zhì)粒構(gòu)建基因工程菌培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物分離純化除菌過濾

半成品檢定

成品檢定

包裝

第五頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥

基因的表達(dá)系統(tǒng)有原核生物系統(tǒng)和真核生物生物系統(tǒng)。選擇表達(dá)系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達(dá)量的多少和分離純化的難易。第六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥

通常將基因工程藥物的生產(chǎn)分為上游和下游技術(shù)。上游階段是研究開發(fā)必不可少的基礎(chǔ)，它主要是分離目的基因，構(gòu)建工程菌，主要在實驗室完成。下游階段是從工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制，該階段是將實驗室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化。

下游加工技術(shù)主要包括工程菌大規(guī)模培養(yǎng)最佳參數(shù)的確定、新型生物反應(yīng)器的研制、高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)、分離純化的優(yōu)化控制、高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)、生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計和制造、電子計算機(jī)的優(yōu)化控制等。第七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.3目的基因的獲得對于原核生物，其基因總量不大，可以選用合適的限制性核酸內(nèi)切酶切下目的基因，而對于真核生物不能進(jìn)行直接分離。

真核細(xì)胞中基因總量較大，從染色體中直接分離純化目的基因極為困難，另外，真核基因一般都有內(nèi)含子，如果以原核細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，即使分離出真核基因，由于原核細(xì)胞缺乏mRNA轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)，真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA也不能被加工、拼接成為成熟的mRNA，因此不能直接克隆真核基因?？寺≌婧嘶虺Ｓ玫姆椒ㄓ心孓D(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。

第八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.3.1內(nèi)含子（introns）

DNA分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)，編碼區(qū)又分為外顯子和內(nèi)含子。一般外顯子控制遺傳和蛋白質(zhì)的合成，在真核細(xì)胞DNA中有部分區(qū)域不參與編碼蛋白，使用限制性內(nèi)切酶測量DNA長度，發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞的mRNA長度明顯小于與之對應(yīng)的DNA長度。在顯微鏡下，這部分不編碼的區(qū)域在轉(zhuǎn)錄時會彎曲成環(huán)狀，“Ω”形，讓具有功能的片段靠近，這樣，在轉(zhuǎn)譯為mRNA時，負(fù)責(zé)合成mRNA的聚合酶就跳過這些內(nèi)含子。內(nèi)含子可能具有分隔基因以免造成復(fù)制出現(xiàn)混亂的作用。第九頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.3.2逆轉(zhuǎn)錄法

逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA，然后進(jìn)行互補(bǔ)DNA的克隆表達(dá)。從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取mRNA，以其為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白質(zhì)mRNA的互補(bǔ)DNA，再以互補(bǔ)DNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶作用下，最終合成編碼該蛋白質(zhì)的雙鏈DNA序列，該序列不含內(nèi)含子。

第十頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥、mRNA的純化細(xì)胞內(nèi)含有三種RNA，mRNA占RNA總量的2%-5%，相對分子量大小不一致，分離也有很大的困難，但是mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸（polyA）組成的末端，長達(dá)20-250個腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸-纖維素上，從而可以用親和層析法將mRNA從細(xì)胞總RNA上分離出來，可得到純度較高的mRNA。

第十一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥、互補(bǔ)DNA第一鏈的合成

mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脫氧胸苷酸為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始互補(bǔ)DNA的合成。在合成反應(yīng)體系中加入一種放射性標(biāo)記的dNTP，在反應(yīng)中以及反應(yīng)后可通過測定放射性標(biāo)記的dNTP摻入量，計算出互補(bǔ)DNA的合成效率，在凝膠電泳后，進(jìn)行放射自顯影分析產(chǎn)物的分子大小，探索最佳反應(yīng)條件。dDNA：雙脫氧核糖核酸dNTP：三磷酸脫氧核苷dATP：三磷酸脫氧腺苷第十二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥、互補(bǔ)DNA第二條鏈的合成

先用堿解或核酸酶(RNaseH)酶解的方法除去互補(bǔ)DNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然后以互補(bǔ)DNA第一鏈為模板合成第二鏈，并用核酸酶S1專一性切除單鏈DNA。第十三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥、互補(bǔ)DNA克隆載體有兩種質(zhì)粒和噬菌體，根據(jù)重組后插入的互補(bǔ)DNA是否能夠表達(dá)、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)，又將載體分為表達(dá)型載體和非表達(dá)型載體?；パa(bǔ)DNA插入片段小于10千堿基對，可選用質(zhì)粒載體，如大于10千堿基對則選用噬菌體作為載體。第十四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.3.3PCR法（鏈?zhǔn)綌U(kuò)增-聚合酶反應(yīng)法）

PCR技術(shù)與反轉(zhuǎn)錄方法的結(jié)合，是合成cDNA的較新方法，該方法是mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，不再合成cDNA第二鏈，而是在特異引物協(xié)助下，用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，特異地合成目的cDNA鏈，用于重組、克隆。第十五頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.3.4化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以采用人工化學(xué)合成法合成，其先決條件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，按相應(yīng)的密碼子推導(dǎo)出DNA的堿基序列。用化學(xué)方法合成目的基因不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進(jìn)行退火使連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。

人工化學(xué)合成的限制：1、不能合成太長的基因，50-60個堿基對；2、人工合成堿基對時，遺傳密碼的簡并會為選擇密碼子帶來很大的困難；3、費用較高。第十六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4基因表達(dá)基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。進(jìn)行基因表達(dá)，我們所關(guān)心的是目的基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。第十七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4.1宿主細(xì)胞的選擇宿主細(xì)胞應(yīng)滿足以下要求：1、容易獲得較高濃度的細(xì)胞；2、能利用廉價易得的原料；3、不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；4、發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；5、容易進(jìn)行代謝調(diào)控；6、容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作；7、產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取。第十八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4.1宿主細(xì)胞的選擇

宿主可分為兩大類：

原核細(xì)胞—大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌；

真核細(xì)胞—酵母菌、絲狀真菌、哺乳動物細(xì)胞。第十九頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥原核細(xì)胞

（1）大腸桿菌

生長迅速、對其研究比較深入，所以常用，特點：表達(dá)基因工程產(chǎn)物的形式多種多樣，有細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)（包含體）、胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)等，極少數(shù)還可以分泌到細(xì)胞外表達(dá)。

限制：沒有信號肽，所以產(chǎn)品多為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，提取時需破碎細(xì)胞，這樣細(xì)胞質(zhì)內(nèi)其他蛋白質(zhì)也釋放出來，造成提取困難，由于分泌力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表達(dá)產(chǎn)物必須在下游處理過程中經(jīng)過變性和復(fù)性處理才能恢復(fù)其生物活性。

第二十頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥原核細(xì)胞

（2）枯草芽孢桿菌

分泌能力強(qiáng)可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包含體，但該菌也不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化，另外由于它有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會對產(chǎn)物進(jìn)行降解。

（3）鏈霉菌

主要特點：不致病、使用安全、分泌能力強(qiáng)、可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力。

第二十一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥真核細(xì)胞

（1）酵母

特點：是研究基因表達(dá)調(diào)控最有效的單細(xì)胞真核微生物，基因組小，僅為大腸桿菌的4倍，世代時間短，有單倍體、雙倍體兩種形式。繁殖迅速、可以廉價地大規(guī)模培養(yǎng)，沒有毒性。能將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到胞外，表達(dá)產(chǎn)物能糖基化。

第二十二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥真核細(xì)胞

（2）絲狀真菌

特點：有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力，能正確進(jìn)行翻譯后加工，而且糖基化方式與高等真核生物相似。

（3）哺乳動物細(xì)胞

特點：產(chǎn)物可分泌到胞外，細(xì)胞培養(yǎng)液成分完全可控制，使產(chǎn)物純化較容易，表達(dá)產(chǎn)物能糖基化，接近或類似與天然產(chǎn)物；動物細(xì)胞生產(chǎn)慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度較稀。

第二十三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥真核細(xì)胞

綜上所述，目前使用最廣泛的宿主仍然是大腸桿菌和釀酒酵母。因為對它們的遺傳背景研究得比較清楚，建立了許多適合于它們的克隆載體和DNA導(dǎo)入方式，并且許多外源在這兩種宿主菌中得到表達(dá)成功。

第二十四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4.2大腸桿菌中的基因表達(dá)、載體具備的基本條件根據(jù)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的特點，表達(dá)載體應(yīng)具備下列條件：（1）載體能夠獨立復(fù)制，有復(fù)制起點，有嚴(yán)緊型和松弛型，嚴(yán)緊型伴隨宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制，在宿主細(xì)胞中拷貝少（1-3）；松弛型的復(fù)制可不依賴與宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中拷貝多達(dá)3000個。（2）應(yīng)有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記，利于外源基因的克隆、鑒定和篩選。（3）應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動子，能為達(dá)成桿菌的RNA聚合酶所識別。（4）應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。（5）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無關(guān)的基因，同時很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。（6）所產(chǎn)生的mRNA必須有翻譯的起始信號。第二十五頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4.2大腸桿菌中的基因表達(dá)、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素

外源基因在宿主中的表達(dá)受許多因素影響的，所以在建立表達(dá)體系時要綜合考慮各種因素的作用，建立一個合適的表達(dá)體系，從而使外源基因得到最大的表達(dá)量，獲得最多的表達(dá)產(chǎn)物。（1）外源基因的拷貝數(shù)（劑量）外源基因是克隆到載體上的，所以載體在宿主中的拷貝數(shù)就直接與外源基因的表達(dá)相關(guān)，應(yīng)將外源基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒載體上，這對于提高外源基因的總體表達(dá)水平非常有利。第二十六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4.2大腸桿菌中的基因表達(dá)（2）外源基因的表達(dá)效率

A.啟動子的強(qiáng)度（在轉(zhuǎn)錄水平上直接影響基因的表達(dá)）真核基因啟動子不能被大腸桿菌RNA聚合酶識別，真核基因欲高效表達(dá)，必須將真核基因編碼區(qū)置于大腸桿菌RNA聚合酶能識別的強(qiáng)啟動子控制下，常用的強(qiáng)啟動子有l(wèi)ac,

trp,

tac,

PL,bla等。

B.核糖體結(jié)合位點的有效性

C.SD序列和起始密碼的間距，主要指表達(dá)非融合蛋白。SD序列（Shine-DelgarnoSquence）：1974年由J.Shine和Delgarno發(fā)現(xiàn)故此命名，mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列，在細(xì)菌mRNA起始密碼子AUG上游10個堿基左右處，有一段富含嘌呤的堿基序列能與16srRNA的3’端識別，幫助從起始AUG處開始翻譯。

D.密碼子的組成等都會不同程度地影響外源基因的表達(dá)。第二十七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4.2大腸桿菌中的基因表達(dá)（3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性

表達(dá)的外源基因，作為應(yīng)急反應(yīng)，宿主細(xì)胞迅速產(chǎn)生降解該蛋白質(zhì)（目的產(chǎn)物）的酶，使得實際產(chǎn)量很低。可采用下列方法來提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白形式；B.利用大腸桿菌的信號肽或某些真核多肽中自身的信號肽，把真核基因產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)桨麧{周質(zhì)的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；C.采用位點特異性突變的方法，改變真核蛋白二硫鍵的位置，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；D.選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞。第二十八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4.2大腸桿菌中的基因表達(dá)（4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的大量表達(dá)，必然會影響宿主細(xì)胞正常的生長代謝，有些產(chǎn)物對宿主還會有毒害作用，將細(xì)胞殺死，為了減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷，同時還得提高外源基因的表達(dá)水平，可以采取以下手段或方式：A.當(dāng)宿主細(xì)胞大量生長時，抑制外源基因的表達(dá)。即將細(xì)胞的生長和外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)分成兩個階段，使表達(dá)產(chǎn)物不會影響細(xì)胞的正常生長，當(dāng)宿主細(xì)胞的生物量達(dá)到飽和時，再進(jìn)行基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)合成，以減低宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷；B.將宿主細(xì)胞的生長與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開，當(dāng)宿主細(xì)胞迅速生長時，抑制重組質(zhì)粒的復(fù)制，當(dāng)細(xì)胞生長量累積到一定水平后，再誘導(dǎo)細(xì)胞中重組質(zhì)粒的復(fù)制，增加質(zhì)?？截悢?shù)。（缺點：外源基因大量表達(dá)的同時，質(zhì)粒上其他基因也大量表達(dá)，不利于產(chǎn)物分離純化）

第二十九頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4.2大腸桿菌中的基因表達(dá)（5）工程菌的培養(yǎng)條件

優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因大量表達(dá)。質(zhì)粒載體PBV220和PET系統(tǒng)介紹（課本23頁）IPTG：異丙基-B-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside）Bindingoftherepressor-

IPTGcomplextotheoperatorcanbestudiedbyusinggreaterconcentrationsoftheproteininthemethylationprotection/enhancementassary.Thelargeamountcompensatesfortheoperator,thecomplexmakesexactlythesamepatternofcontactswithDNAasthefreerepressor.AnanalogousresultsisobtainedwithmutantrepressorswhoseaffinityforoperatorDNAisincreased,theytoomakethesamepatternofcontacts.

第三十頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4.2大腸桿菌中的基因表達(dá)IPTG：異丙基-B-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside）

IPTG一般用于蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG與乳糖操縱元的阻遏蛋白結(jié)合，使乳糖阻遏蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生變化，四聚體解聚成單體，失去與操縱子特異性緊密結(jié)合的能力，從而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以轉(zhuǎn)錄合成。第三十一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4.3真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式

包含體：外源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時，它們的構(gòu)象發(fā)生改變，或由于產(chǎn)生不合適的二硫鍵，或由于表達(dá)的蛋白不能正確折疊，因此不能形成具有活性的蛋白質(zhì)，而是形成水不溶性物質(zhì)，即包含體，包含體的形成大大降低了表達(dá)產(chǎn)物對宿主的毒害作用。

第三十二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4.3真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式

三種：融合蛋白、非融合蛋白、分泌型。

（1）融合蛋白

融合蛋白即通過基因重組技術(shù)得到的兩個基因重組后的表達(dá)產(chǎn)物，對于大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白，它的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，這樣的蛋白質(zhì)是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的。

優(yōu)點：基因操作簡便、蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定、不易被細(xì)菌酶類所降解、容易實現(xiàn)高效表達(dá)。

缺點：只能做抗原用，原核多肽序列可能會影響真核蛋白的免疫原性?？赏ㄟ^化學(xué)處理或特異性酶再切割，除掉融合蛋白的氨基端原核多肽，從而獲得生物活性。

第三十三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4.3真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式

（2）非融合蛋白

非融合蛋白：指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白以真核蛋白的mRNA的AUG為其始，在其氨基端不含任何原核多肽序列。表達(dá)非融合蛋白的操縱子必須改建為：細(xì)菌或噬菌體的啟動子—細(xì)菌的核糖體結(jié)合位點（SD序列）—真核基因的起始密碼子—結(jié)構(gòu)基因—終止密碼。關(guān)鍵點：要求核糖體結(jié)合位點序列與翻譯起始密碼之間的距離要合適，稍有不適就會影響表達(dá)效率。

優(yōu)點：能夠較好地保持原來的蛋白活性；

缺點：容易被蛋白酶破壞，氨基末端常帶有甲硫氨酸，在人體內(nèi)用藥時可能會引起人體免疫反應(yīng)。

第三十四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.4.3真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式

（3）分泌型

將外源基因接到信號肽之后，使之在胞質(zhì)內(nèi)有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，當(dāng)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜之間的周質(zhì)后時，被信號肽酶識別切割，從而釋放出有生物活性的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。

特點：一些可被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶所降解的蛋白質(zhì)在周質(zhì)中是穩(wěn)定的；由于有些蛋白質(zhì)能按一定的方式折疊，所以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時無活性的蛋白質(zhì)分泌表達(dá)時卻具有活性；蛋白質(zhì)信號肽和編碼序列之間能被切割，因而分泌后的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不含起始密碼所編碼的甲硫氨酸。產(chǎn)量不高，信號肽不被切割或不在特定位置上切割。

第三十五頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.5酵母中的基因表達(dá)

3.5.1、酵母載體

酵母載體是可以攜帶外源基因在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代細(xì)胞的DNA或RNA單位。從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進(jìn)行的，只有在最后階段再轉(zhuǎn)入酵母中。

第三十六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.5酵母中的基因表達(dá)

克隆載體：既能在原核細(xì)菌中進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制和表型選擇，又能在酵母中進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制和表型選擇，這類質(zhì)粒稱為克隆載體，這樣構(gòu)成的載體同時帶有細(xì)菌和酵母的復(fù)制原點和選擇性標(biāo)記。表達(dá)載體：將酵母的啟動子和終止子等有關(guān)表達(dá)控制序列引入克隆載體的適當(dāng)位點后，就構(gòu)成了酵母的表達(dá)載體系統(tǒng)。

第三十七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.5酵母中的基因表達(dá)

酵母表達(dá)載體有兩類：普通表達(dá)載體和精確表達(dá)載體。

普通表達(dá)載體：只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對其N末端氨基酸是否有增減并無嚴(yán)格要求。

精確表達(dá)載體：要求在啟動子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點，以利于接入外源基因，并使它在表達(dá)和加工后氮末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸。

第三十八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.5.2影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素

（1）外源基因的劑量（拷貝數(shù)）拷貝數(shù)要適當(dāng)，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因高效表達(dá)，但會引起細(xì)胞生長量的降低，單拷貝的質(zhì)粒載體對細(xì)胞的最大生長沒有影響，能達(dá)到較高效的表達(dá)

第三十九頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.5.2影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素

（2）外源基因的表達(dá)效率

與啟動子、分泌信號、終止序列有關(guān)。（P29）酵母的啟動子由上游激活序列和近端啟動子（包括轉(zhuǎn)錄必需序列和起始密碼子）組成。要使外源基因在酵母中表達(dá)必須將外源基因克隆到酵母表達(dá)載體的啟動子和終止子之間，構(gòu)成表達(dá)框架。組成型啟動子：在酵母的各個生長時期全部存在并發(fā)揮作用，過早表達(dá)影響生長從而影響表達(dá)總量。誘導(dǎo)型啟動子：表達(dá)受誘導(dǎo)物或誘導(dǎo)條件的影響，分泌信號包括信號肽部分以及前導(dǎo)肽部分的編碼序列，它幫助后面的表達(dá)產(chǎn)物分泌出酵母細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)牟课挥砂麅?nèi)蛋白酶加工切斷表達(dá)產(chǎn)物與前導(dǎo)肽之間的肽鍵，產(chǎn)生正確的表達(dá)產(chǎn)物。

終止序列保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)牟课唤K止和加上多聚腺苷酸尾巴，這樣形成的mRNA可能比較穩(wěn)定并被有效地翻譯。

第四十頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.5.2影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素

信號肽Signalpeptide：是引導(dǎo)合成肽鏈轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）上的一段多肽，位于新合成肽鏈的N端，一般16-30個氨基酸殘基，含有6-15個帶正電荷的非極性氨基酸，由于信號肽又是引導(dǎo)肽鏈進(jìn)入ER網(wǎng)腔的一段序列，又稱開始轉(zhuǎn)移序列（Starttransfersequence）。前導(dǎo)肽leaderpeptide：信號肽的一種，位于成熟蛋白的N端，引導(dǎo)蛋白穿膜，并在后來被剪切掉，又稱轉(zhuǎn)運(yùn)肽，是游離核糖體上合成蛋白質(zhì)的N端信號，運(yùn)送蛋白質(zhì)。第四十一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.5.2影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素

（3）外源蛋白的糖基化

外源蛋白在分泌過程中發(fā)生糖基化。

糖基化為蛋白質(zhì)的重要翻譯后修飾過程，根據(jù)糖鏈和肽鏈的連接方式分為N-糖基化和O-糖基化。所謂蛋白質(zhì)糖基化工程是通過對蛋白質(zhì)表面糖鏈進(jìn)行改造，從而改良蛋白質(zhì)性質(zhì)的一種技術(shù)，糖基化對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)影響主要有：①溶解度，糖基化往往使蛋白質(zhì)的溶解度提高；②電荷，使蛋白質(zhì)的負(fù)電荷增加，因為糖醛酸、唾液酸解離后一般帶負(fù)電荷；③增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；④影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)；⑤增加糖蛋白的分泌效率。第四十二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日3.5.2影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素

（4）宿主菌株的影響

宿主菌株應(yīng)具備下列要求：菌體生長力強(qiáng)；非分泌型，表達(dá)產(chǎn)量與酵母生長密度正相關(guān)菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱；菌體性能穩(wěn)定；宿主菌株多為突變株，避免使用回復(fù)突變率高的不穩(wěn)定菌株。最好使用二倍體或多倍體。分泌能力強(qiáng)。

第四十三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.5.3動物細(xì)胞中的基因表達(dá)

動物細(xì)胞表達(dá)的特點：產(chǎn)物可分泌到細(xì)胞外，培養(yǎng)液成分可人工調(diào)控，產(chǎn)物純化比較容易，產(chǎn)物是糖基化的，接近或類似于天然產(chǎn)物；但動物細(xì)胞生長慢，單位體積生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度較小。第四十四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.6基因工程菌的穩(wěn)定性（P32）基因工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，至少維持25代以上。有分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，分裂不穩(wěn)定是指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象；質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。

第四十五頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.6基因工程菌的穩(wěn)定性（P32）3.6.1質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因常見的是分裂不穩(wěn)定，與兩個因素有關(guān)：1）含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；質(zhì)粒丟失率與宿主菌、質(zhì)粒特性和培養(yǎng)條件有關(guān)。2）這兩種菌的比生長速率差異的大小。含低拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率較大，增加工程菌中的質(zhì)?？截悢?shù)能提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。含高拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率較低，但是大量外源質(zhì)粒的存在使含質(zhì)粒菌的生長速率明顯低于不含質(zhì)粒菌，而不含質(zhì)粒菌一旦產(chǎn)生，能較快地取代含質(zhì)粒菌而成為優(yōu)勢菌，因而對這類菌進(jìn)一步提高質(zhì)?？截悢?shù)反而會增加含質(zhì)粒菌的生長負(fù)勢。第四十六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.6基因工程菌的穩(wěn)定性（P32）3.6.1質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因3）質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法：將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，均勻涂布于不含抗性標(biāo)記抗生素的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-12小時，然后隨機(jī)挑出100個菌落接種到含抗性標(biāo)記抗生素的平板上，培養(yǎng)10-12小時，統(tǒng)計長出的菌落數(shù)，每一樣品應(yīng)取3次重復(fù)的結(jié)果，計算出比值，該比值反映了質(zhì)粒的穩(wěn)定性

第四十七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.6基因工程菌的穩(wěn)定性（P32）3.6.2提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法

除了選擇合適的宿主菌和載體外，采用兩階段法，第一階段先使菌體生長至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。在培養(yǎng)基中加入選擇性壓力如抗生素等，以抑制質(zhì)粒丟失菌的生長。適當(dāng)?shù)牟僮鞣绞揭部墒构こ叹L速率具有優(yōu)勢，調(diào)控溫度、pH、培養(yǎng)基組分、溶解氧，通過間歇供氧和改變稀釋速率都可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

第四十八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7基因工程藥物的分離純化3.7.1分離純化前的準(zhǔn)備

主要包括產(chǎn)物濃度、主要雜質(zhì)種類和濃度、鹽種類和濃度、溶解度、pH黏度、流體力學(xué)性質(zhì)和熱力學(xué)性質(zhì)。含目的產(chǎn)物的初始物料的特點1）菌種類型、形式，產(chǎn)物和副產(chǎn)物種類，產(chǎn)物所處位置，產(chǎn)物類似物、毒素和能降解產(chǎn)物的酶類2）原材料和培養(yǎng)基的來源及質(zhì)量是否穩(wěn)定。3）生產(chǎn)工藝和條件。包括滅菌方法、條件和生產(chǎn)方式和過程控制條件等。4）初始物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性。

第四十九頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.1分離純化前的準(zhǔn)備物料中雜質(zhì)種類和濃度

相關(guān)性和非相關(guān)性雜質(zhì)的含量、化學(xué)性質(zhì)與結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量、電荷性質(zhì)和數(shù)量、生物學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性（對熱、鹽、pH、有機(jī)溶劑等）、雜質(zhì)溶解度、分配系數(shù)、揮發(fā)性和吸附性能等。第五十頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.1分離純化前的準(zhǔn)備目的產(chǎn)物的特性目的產(chǎn)物主要有化學(xué)、物理和生物學(xué)性質(zhì)，主要包括化學(xué)組成、相對分子量、等電點、電荷分布及密度、溶解度、穩(wěn)定性（對熱、鹽、pH、有機(jī)溶劑和金屬離子等）、疏水性、擴(kuò)散性、擴(kuò)散系數(shù)、吸附性能、生物活性、親和性、配基種類和表面活性等。

產(chǎn)品質(zhì)量要求主要包括質(zhì)量指標(biāo)（純度、含量、生物活性、比活等）、產(chǎn)品用途。允許雜質(zhì)的種類和相應(yīng)的含量等。第五十一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.2分離純化的基本過程（p47，圖2-8）3.7.3細(xì)胞破碎方法物理法、化學(xué)法和生物法物理法：勻漿法、珠磨法、超聲法、高壓擠壓法等化學(xué)法：滲透沖擊、增溶法、脂溶法生物法：酶溶法第五十二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化（p50）離子交換層析1）離子交換層析（ionexchangechromatography，IEC），以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。2）正吸附和負(fù)吸附：將目的產(chǎn)物離子化，然后交換到介質(zhì)上，而雜質(zhì)不被吸附，從離子交換柱上首先流出，稱為正吸附，該方法獲得的目的產(chǎn)物純度高，還可以對產(chǎn)物起到一定的濃縮作用，適于處理產(chǎn)物濃度低，工作濃度大的溶液。將雜質(zhì)離子化后被交換，目的產(chǎn)物不被交換而直接流出，稱為負(fù)吸附，適于處理產(chǎn)物濃度高的工作液，但去除雜質(zhì)效果較差，產(chǎn)物純度不高。

第五十三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化（p50）離子交換層析3）離子交換劑：由三部分組成，分別為載體、活性基團(tuán)（功能基團(tuán)）和平衡離子（反離子）組成陽離子交換劑：活性基團(tuán)帶？？？，平衡離子帶？？？陰離子交換劑：活性基團(tuán)帶？？？，平衡離子帶？？？4）離子交換劑的再生：指對使用過的離子交換劑進(jìn)行處理，使其恢復(fù)原有性狀的過程，一般先用大量水洗，再用酸堿交替浸泡的方式處理，除去與活性基團(tuán)結(jié)合的雜質(zhì)，使交換劑恢復(fù)原有的交換能力。第五十四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日3.7.4重組蛋白的分離純化（p50）離子交換層析5）離子交換劑的轉(zhuǎn)型：是指離子交換劑由一種活性離子轉(zhuǎn)為另一種活性離子的過程，用HCl可以將陽離子樹脂轉(zhuǎn)為Cl型，用NaOH處理可以將其轉(zhuǎn)化為OH型，用甲酸鈉處理可以轉(zhuǎn)為甲酸型。6）離子交換劑的保存：首先處理洗去蛋白等雜質(zhì)，加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?，一般加?.02%的疊氮化鈉，4℃下保存?；蚬こ讨扑幍谖迨屙摚舶耸?，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化（p50）離子交換層析6）離子交換過程樹脂選擇

主要考慮交換劑結(jié)合力的強(qiáng)弱，如疏水性強(qiáng)（疏水性強(qiáng)適合分離小分子物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸）和親和力強(qiáng)弱（親和力強(qiáng)適合分離蛋白質(zhì)），樹脂的分辨率，樹脂的穩(wěn)定性，樹脂的交換容量，樹脂的操作條件等（p53，纖維素、葡聚糖、瓊脂糖離子交換載體）。樹脂的處理和裝柱：去雜、清洗、轉(zhuǎn)型樹脂的平衡：平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和pH選擇要從產(chǎn)物的穩(wěn)定性，產(chǎn)物與雜質(zhì)與交換劑的結(jié)合力大小和平衡緩沖液本身是否與離子交換劑結(jié)合幾個方面考慮。第五十六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化（p50）離子交換層析上樣

主要考慮的樣品濃度，樹脂交換容量（對目的產(chǎn)物和雜質(zhì)），樹脂的親和力。洗脫梯度洗脫：分為離子強(qiáng)度梯度洗脫和pH梯度洗脫，前者即改變洗脫液的離子強(qiáng)度，使與離子交換劑結(jié)合的各組分洗脫下來。pH梯度洗脫是改變洗脫液pH值來進(jìn)行梯度洗脫的一種方法，一般對于陽離子交換劑，洗脫液pH值是從低到高改變。對于陰離子交換劑，洗脫液pH值是從高到低改變。階段洗脫：采用不同種類的緩沖溶液分階段進(jìn)行洗脫，當(dāng)分離組分與樹脂的親和力差別較大時，采用該方法比較適合。第五十七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥思考題：1.影響離子交換層析分辨率的主要因素有哪些？2.洗脫過程主要的考察因素有哪些？第五十八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥疏水層析1）疏水層析（hydrophobicinteractionchromatography，HIC），是利用不同蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水性基團(tuán)相互作用力的差異，對各種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。流動相一般采用中性鹽溶液，通過改變鹽溶液的濃度使目的蛋白從層析介質(zhì)上被逐步洗脫下來，蛋白質(zhì)與固定相之間主要是疏水作用力，因此，蛋白質(zhì)不易變性和失活。第五十九頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥疏水層析2）疏水層析的基本原理蛋白質(zhì)表面多由親水基團(tuán)和部分疏水基團(tuán)（疏水區(qū)域）組成，不同蛋白質(zhì)疏水區(qū)疏水性強(qiáng)弱不同，對于同一種蛋白質(zhì)由于鹽濃度等外環(huán)境的不同，其表面疏水力強(qiáng)弱也不同，在離子強(qiáng)度較高的鹽溶液中，蛋白質(zhì)表面疏水部位的水化層容易發(fā)生破壞，暴露出較多的疏水部位，即疏水作用力增大，從而使蛋白質(zhì)在疏水介質(zhì)上分配系數(shù)增大。因此疏水層析一般采用高濃度鹽溶液上樣，低濃度鹽溶液進(jìn)行洗脫。第六十頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化（p50）疏水層析3）疏水層析的介質(zhì)多聚糖（如瓊脂糖）：機(jī)械強(qiáng)度差，少用硅膠（Si-O-Si-C或Si-C鍵合）常用疏水功能基：苯基、短鏈烷基、丁基、烷氨基、聚乙二醇、聚醚等。疏水作用與功能基的疏水性和密度成正比，功能基修飾密度過小，疏水力不足，密度過大洗脫困難。第六十一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化疏水層析4）影響疏水層析的主要因素離子強(qiáng)度離子種類：遵循Hofmeister原則疏水作用是一種吸熱過程，因此增加溫度可以提高蛋白質(zhì)與功能基的作用力，有利于蛋白吸附，但溫度上升容易使蛋白變性失活。

表面活性劑可與吸附劑及蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，減弱蛋白質(zhì)的疏水吸附。第六十二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化疏水層析4）疏水層析對蛋白復(fù)性的基本原理變性蛋白進(jìn)入疏水層析柱后，變性蛋白瞬間失去水分子，形成局部疏水環(huán)境以利于蛋白分子形成疏水核，并從疏水核開始折疊。隨著流動相的不斷變化，變性蛋白逐漸得以復(fù)性，最后被洗脫下來。并不針對發(fā)生不可逆變性的蛋白。第六十三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化

親和層析（p56）1）親和層析（affinitychromatography,AC）是利用固定化配體與目的蛋白之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，這種結(jié)合既特異又可逆，改變條件可以解除這種結(jié)合。2）親和層析的原理通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質(zhì)（載體）上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進(jìn)行分離純化。被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體，配體與載體共價結(jié)合，構(gòu)成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。蛋白質(zhì)生物特異性可以幫助選擇特異性的配體，一般目的蛋白與配體結(jié)合而不保留雜質(zhì)，要選擇親和力適中而特異性較強(qiáng)的配基，其解離常數(shù)要求在10-8~10-4mol/L。第六十四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化

親和層析（p56）3）親和吸附劑（載體）①良好的理化穩(wěn)定性②較多的化學(xué)活性基團(tuán)，能與配體穩(wěn)定共價結(jié)合，并且在結(jié)合后不改變基質(zhì)與配體的基本性質(zhì)。③多孔立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使被吸附的大分子自由通過而增加配體的有效濃度。④高親水性的惰性物質(zhì)，減少非特異性吸附，同時使生物分子容易接近。⑤良好的機(jī)械性能以及顆粒的均一性。第六十五頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化

親和層析（p56）4）常用親和吸附劑（載體）①纖維素：無定性微纖維、微晶纖維素和球狀纖維素等。②瓊脂糖凝膠：由D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖。商品主要有：Sepharose2B,Sepharose4B,Sepharose6B(pharmacia),UtralgelsA-2、A-4、A-6SepharoseCL（2，3-二溴丙烷處理的瓊脂糖）③聚丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺與甲叉雙聚丙烯酰胺聚合物）商名品：Biogel-P④其它：UtralgelsACA等。第六十六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化

親和層析（p56）5）配體理論上，親和層析的任何一方都可以作為配基，作為配基的理想配體一般滿足條件：①與待分離物親和力適當(dāng)②與待分離物特異性較強(qiáng)以保證較高分辨率③與載體穩(wěn)定結(jié)合，并在結(jié)合后結(jié)構(gòu)無明顯變化④較穩(wěn)定，盡可能重復(fù)使用。分為：特異性配體非特異性配體第六十七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化

親和層析（p56）6）載體的活化第六十八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化

親和層析（p56）7）配體與載體的偶聯(lián)第六十九頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化

親和層析（p56）8）操作過程上樣：①慢（上樣速度要慢；平衡過程慢；可以多次上樣）②緩沖液離子強(qiáng)度適當(dāng)③上樣溫度較低洗脫：分為特異性洗脫和非特異性洗脫特異性洗脫：可以用與配體有親和力的洗脫物質(zhì)進(jìn)行洗脫；也可以與目的產(chǎn)物有親和力的洗脫物質(zhì)進(jìn)行洗脫。非特異性洗脫：改變外界條件，包括洗脫液pH、離子強(qiáng)度和溫度等因素，降低目的產(chǎn)物與配基親和力而將之洗脫下來，上述條件的選擇以不使產(chǎn)物喪失活性為根本原則。第七十頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日基因工程制藥3.7.4重組蛋白的分離純化

親和層析（p56）9）金屬螯合層析（ChealtingAC）一般采用環(huán)氧活化型Sepharose6B與金屬螯合劑（如EDTA、二亞氨二己酸、氨基水揚(yáng)酸、8-羥基喹啉等）偶合成配基，再用金屬離子處理（如Ni2+、Zn2+、Cd2+等），制成金屬螯合層析柱，一些含有His、Cys、Trp、Phe的蛋白質(zhì)可以用上述層析方法進(jìn)行分離純化，也可以用于寡聚核苷酸等分離?；咎幚矸椒ǎ簩h(huán)氧型瓊脂凝膠膨脹洗滌→將亞二氨二醋酸鈉溶于4mol/L的Na2CO3→將該溶液加入凝膠，65℃反應(yīng)24h→蒸餾水洗滌凝膠→裝柱→金屬鹽溶液緩慢過柱（如1