第二十五章藥物生物轉化

第二十五章藥物生物轉化第一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)微生物轉化反應概述第二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一生物轉化是指外來化合物在體內，細胞或酶的作用經過一系列化學變化形成其衍生物或分解產物的過程，也成為代謝轉化。生物轉化常利用生長中的菌體，休止的菌體，酶，固定化酶以及固定化菌體作為母體進行藥物的轉化。主要的優(yōu)點有反應的區(qū)域專一性和立體專一性。第三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一早在2500年前的春秋戰(zhàn)國時期，人們就已經知道制醬和醋。在宋代，采用老的曲子進行接種釀酒。不過當時人們并沒有認識到可以利用微生物來合成化學物質。1864年巴斯德利用乙酸桿菌將乙醇氧化為乙酸。工業(yè)化的里程碑是50年代美國普強藥廠利用微生物黑根霉的羥化酶將黃體酮轉化為11α-羥基黃體酮，即對甾體化合物的結構改造。固定化細胞，基因重組等技術的發(fā)展，能將幾種不同合成基因構建到同一個工程菌中使得一次培養(yǎng)同時進行幾步轉化反應，使微生物轉化在天然藥物修飾中發(fā)揮更重要的作用。微生物轉化的發(fā)展第四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一第一階段：菌體生長階段，在該階段中主要是供給菌體豐富的營養(yǎng)，使其充分繁殖發(fā)育。（溫度，pH，通氣條件，培養(yǎng)及成分。）第二階段：微生物轉化階段，一般在生長階段結束時加入底物溶液，有些還需加入誘導劑。微生物轉化的不同階段第五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一分批培養(yǎng)轉化法利用酶進行生物轉化應用滲透細胞進行生物轉化應用孢子進行生物轉化應用固定化細胞進行生物轉化應用干燥細胞進行生物轉化靜息細胞轉化法常用的轉化方法第六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一微生物轉化實驗概要過程如下：選擇需要的菌株培養(yǎng)成熟菌絲或孢子選擇合適的轉化方式轉化培養(yǎng)或轉化菌絲及孢子懸浮液轉化轉化液的分離提取產品純化微生物轉化的過程第七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一由有活性中心都和特殊空間結構的酶作為催化劑；酶催化作用的速度極快；在常溫常壓和中性條件下進行高效轉化反應，簡化設備，降低成本；生物轉化的專一性，故底物不要求很純（Ex.粗淀粉）轉化過程容易調節(jié)（簡單的用酸，堿，溫度，離子調節(jié)）轉化過程產生雜質少，過程無毒，無臭，無味，可用于食品，醫(yī)療。把含酶細胞或酶本身固定在載體上，可使轉化過程連續(xù)化。酶來源廣泛?？梢詫崿F化學反應無法做到的轉化。微生物轉化的特點第八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)生物轉化反應類型第九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一氧化反應還原反應縮合反應脫氫反應烷烴雙端氧化碳鏈氧化降解123456第十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一最為常見的生物轉化反應，在甾體藥物合成上應用較多。環(huán)氧化反應是生物轉化中的一個重要類型，C=C經氧化可形成環(huán)氧化合物，可生產磷霉素。氧化反應第十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一許多醛類，無論式脂肪族，還是芳香族，飽和或不飽和，羥基或鹵素取代都能被微生物還原成醇。還原反應第十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一麻黃堿：利用微生物將苯甲醛和乙醛縮合成1-苯基-1-羥基丙酮，再與甲胺縮合，用活性鉛還原，得麻黃堿?？s合反應第十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一可的松脫氫后苯環(huán)形成雙鍵，具有較高的抗炎活性。脫氫反應第十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一該法是降解甾體物質側鏈的重要反應。采用鏈霉菌轉化阿魏酸制備香草醛為例。碳鏈氧化降解第十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一第三節(jié)微生物轉化在藥物中應用第十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一甾體指的是固醇或皮質類激素，由于這類激素都含有相同的結構，所以統(tǒng)稱為甾體類激素。甾體在臨床上應用十分廣泛，解熱鎮(zhèn)痛，消炎殺菌等。甾體微生物轉化第十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一1950年Kendall,Reichstein與Hench因發(fā)現類固醇的消炎作用而獲得諾貝爾獎。1952年以化學方法以牛膽汁中的脫氧膽酸為原料合成腎上皮質激素，反應共需31個步驟，產品售價每克$200；1952年利用Peterson利用黑根霉產生的羥化酶將反應過程縮短為3個步驟，產品售價每克$6；1980年使用突變的分支桿菌分解植物油中的固醇以作為原料，產品價格每克$0.46。甾體合成技術的演進第十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一羥化反應環(huán)氧化反應脫氫反應A環(huán)芳構化還原反應水解反應甾體生物轉化的類型第十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一羥化反應孕酮皮質激素第二十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一環(huán)氧化反應第二十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一A環(huán)芳構化脫氫第二十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一甾體生物轉化的原理和方法甾體生物轉化的原理不同于氨基酸，抗生素，蛋白質等的發(fā)酵。而是利用微生物中特殊的酶對甾體的某一部位進行特定的化學反應獲得的產物。在這一過程中為獲得較多的轉化酶，我們需要確保菌體產酶的最佳條件，誘導所需要的酶，抑制不需要的酶。在菌體生長期結束后加入甾體底物，由于其不溶于但能溶于可與水按一定比例混溶的有機溶劑，再加入培養(yǎng)液中轉化。第二十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一根據轉化時微生物的狀態(tài)可分為4種轉化方式：生長培養(yǎng)方式：在微生物培養(yǎng)的中后期加入底物，一邊培養(yǎng)，一遍轉化。靜態(tài)菌體懸浮方式：菌體充分生長后，離心得到的菌體懸浮在水或適當

的緩沖液中，再加入甾體進行轉化。混合培養(yǎng)方式：以A出發(fā)轉化成B，需要兩種以上的酶參與，單獨轉化費

時費力，所以常采用混合培養(yǎng)的方法，可以一步得到B

省略了中間過濾步驟。固定化方式：一次制成的菌液反復用于轉化是可行的，為了避免溶菌，

需要將其固定在水不溶載體上進行轉化。第二十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一影響甾體生物轉化的因素物理因素攪拌：增加攪拌速度，可以增加溶氧使基質均勻，提高轉化率。通氣：增加氧的溶解，促進菌體生長及生物轉化。培養(yǎng)基的組成碳源：常用的有葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，糊精。氮源：（有機，無機金屬離子：增加對轉化有益的離子，去除負向影響的離子。第二十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一產物的分析與分離方法純化需要用適當的與水不溶的有機溶劑將甾體從轉化液種提取出來。常用的有氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷等。溶劑的用量需根據產物在轉化液于提取液中的分配系數而定。提取時防止乳化。濃縮后利用各種色譜法得到較純的甾體轉化物。分析轉化過程中需要實時監(jiān)測殘余底物及生成產物的量及比例，以確定轉化終點。常用紫外分光光度法，HPLC等。第二十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一第四節(jié)新技術在微生物轉化的中應用

隨著現代生物科學和生物技術的迅速發(fā)展，以及一些分析測試技術的應用，微生物轉化也得到了進一步的發(fā)展?；蚬こ碳夹g、固定化細胞轉化技術、雙水相轉化技術、超聲波技術、有機介質微生物轉化以及生物反應器等綜合應用于微生物轉化反應體系，不僅可使轉化的效率成倍增長，而且還有可能使整個反應過程連續(xù)、自動化。同時，一些分析測試技術如核磁共振、質譜等已經應用于微生物轉化的在線檢測。第二十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一一、基因工程技術在微生物轉化中的應用隨著近年來分子生物學的發(fā)展，人們對基因工程的認識也逐步加深，這為微生物轉化提供了新的思路。基因工程技術的發(fā)展和實用化為此開辟了有效途徑。只要生物細胞中存在有催化某一生化反應的酶，即使其量微不足道，應用基因重組技術，通過基因擴增與增強表達，人們就可能建立高效表達特定酶制劑的基因工程菌或基因工程細胞，從而進一步構建成新一代的催化劑——固定化工程菌或固定化工程細胞。第二十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一如，應用DNA重組技術建立了絲氨酸和色氨酸合成酶工程菌，這種工程菌組裝的生物反應器可以用甘氨酸和甲醛為原料制造絲氨酸，反應液含絲氨酸超過400g／L，再從絲氨酸與吲哚轉化生成色氨酸，反應液中色氨酸濃度達到200g／L。此外．利用基因工程還可以將能進行生物轉化的相關酶從微生物、植物甚至動物細胞中克隆出來．再導入一個微生物中進行表達，從而產生能對底物進行轉化的一系列酶，將原來復雜的幾種轉化過程縮短為一個轉化反應。目前在這方面的研究也是微生物轉化的一個趨勢，并且具有廣闊前景。第二十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一二、固定化細胞轉化技術在微生物轉化中的應用固定化細胞轉化技術自20世紀70年代問世以來．已經廣泛應用于工業(yè)、農業(yè)、醫(yī)學、環(huán)境保護、能源開發(fā)以及理論研究等方面，并取得了豐碩成果。利用固定化細胞轉化技術，省去了破碎細胞提取胞內酶的過程，完整細胞得到固定后，酶活損失較少，活性回收率高，并且保持了細胞內原有的多酶體系，對于一些需要多步催化的反應過程，一步即可完成。被固定的微生物細胞可以是處于生長狀態(tài)或體眠狀態(tài)的活細胞也可以是死亡的細胞(但胞內酶的活力仍存在)第三十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一

在微生物轉化過程研究最多的是固定化活細胞包埋技術。常用的包埋材料有聚丙烯酰胺(PAA)、聚氨基甲酸乙酯(PU)、海藻酸鹽凝膠、二氧基硅氧烷、葡聚糖凝膠、聚乙烯醇(PVA)等。以海藻酸鈣凝膠為例，其制備過程如下：在室溫條件下，將一定濃度的海藻酸鈉溶液與微生物細胞混合均勻后，滴加到氧化鈣溶液中，形成球珠。第三十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一Kaul等采用了海藻酸鹽固定化生物催化劑(簡單節(jié)桿菌)和底物(氧化可的松)進行碳一位和二位脫氫反應研究。每個凝膠珠都可以看成是一個小的生物反應器，由于縮短了擴散距離，轉化率明顯提高，反應結束后細胞還可以回收并重復使用第三十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一三、雙水相轉化技術在微生物轉化中的應用雙水相轉化技術早期主要用于生物分子和細胞的分離與純化。這是由于生物產品如蛋白質和酶往往是胞內產品，需要經細胞破碎后才能提取、純化，細胞顆粒尺寸的變化給固一液分離帶來了困難，另外這些產品的活性和功能對pH值、溫度和離子強度等環(huán)境特別敏感．為了克服這些缺點．出現了雙水相技術。近年來，該技術開始應用于微生物轉化過程．為生物催化過程引入了一種全新的反應體系第三十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一

雙水相技術的核心是成相介質的選擇以及介質濃度的控制，它直接影響到底物和產物在兩相中的分配。雙水相體系基本上可以分為兩大婁：高聚物-高聚物體系和高聚物-低分子物質體系。第三十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一高聚物一高聚物體系是較常用的，典型的例子如在水溶液中的聚乙二醇(PEG)和葡聚糖，當它們濃度達到一定時．溶液變渾濁，靜止后形成兩個液層，上層富集了PEG，下層則是葡聚糖。Flygare等以聚乙二醇、葡聚糖及Brij35組成的雙水相體系，利用分支桿菌(Mycobacteriumsp.)進行膽固醇側鏈降解制備雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)和雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)研究，上層聚乙二醇富集了菌體，使得菌體具有較高的轉化活力，轉化速率可達到1.0mg／(g·h)。第三十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一四、超聲波技術在微生物轉化中的應用

超聲波是指頻率高于2×104Hz的機械波。與其他聲波一樣，超聲波可以在彈性介質中傳播。因為超聲波的波長很短，所以具有很強的定向傳播能力。同時由于超聲波在液體和固體中傳播時吸收衰減很小，因此具有很強的穿透力。根據超聲波的使用范圍，?？梢詫⑵浞譃閮深悾阂活愂歉哳l超聲，頻率范圍為I~10MHz，這一類主要用于醫(yī)學成像和化合物結構的分析；另一類是功率超聲，頻率范圍為15～60kHz，主要用于過程強化反應。第三十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一應用超聲波技術，首先受到機械力的作用，而機械能又可以轉化為熱能。此外，當聲強足夠大時，又能產生空化效應。超聲波的機械效應包括振動效應和聲流效應，指超聲在媒介中傳播時引起質點振動以及聲流對質點的剪切力；超聲波的熱效應指超聲波在媒介中傳播的過程中被傳播介質吸收轉變?yōu)闊崮埽怀暡ǖ目栈赋暡せ顨馀莞鞣N動力學的表現形式。第三十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一

超聲波技術應用于微生物轉化過程，主要是涉及固液傳質的生物體系。超聲波可以產生上述的效應，較常規(guī)方法更有效地細化顆粒、增大傳質表面。這一過程主要發(fā)生于固液兩相界面及細胞壁、細胞膜附近的區(qū)域。在超聲場中，進行微生物轉化的環(huán)境和菌體均處于不斷的振動中。第三十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一對于環(huán)境而言，可加強分子的擴散效應，加速體系的混勻過程，減少各種代謝在液相中的梯度；對于菌體而言，可降低其細胞內胞液的黏度，提高膜的通透性。陽葵等等報道了采用超聲強度，超聲方式和時間對綠僵菌(Metarhiziumsp．)氧化16α,17α-環(huán)氧黃體酮的影響，并對微生物轉化體系中的超聲效應進行分析，第三十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一認為超聲使得反應物顆粒細化、增大了固液界面、加速了底物溶解和底物分子的傳遞；空化效應產生的沖擊力對細胞膜通透性發(fā)生變化，促進胞內酶的釋放及反應物向胞內的擴散。第四十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一五、有機介質中的微生物轉化

自從Buckland第一次利用有機溶劑四氯化碳(CCl4)為介質，采用諾卡菌(Nocardiasp.)將膽甾醇轉化為膽甾烯酮以來，在有機介質中進行微生物轉化成為了近幾年在該領域的研究熱點。因為在有機體系中可以有效地將產物及時分離出來，底物相應得到補充，從而消除底物和產物的抑制作用，提高轉化率。此外，由于一些底物或前體在水相中的溶解度很小，通過用有機相作為介質可以大大提供其溶解度，即增加了底物或前體的加入濃度，在一定程度上也提高了轉化率。第四十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一

一般來說，在有機介質中進行微生物轉化的過程中，有機溶劑與水形成兩相體系。包括有機介質(水不溶性)-發(fā)酵液和有機介質(水不溶性)-緩沖液兩種類型。Boren等在辛烷發(fā)酵液(1：1)組成的兩相體系中，將醋酸雄烯通過脫氫黃桿菌(Flavobacteriumdehydrogenans)轉化為4-雄烯-3,17-二酮，第四十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一結果發(fā)現利用發(fā)酵液作為第二相有利于微生物轉化進行，轉化率可高達98％，產物形成速率約是純水介質的6倍．這是因為在發(fā)酵液中輔酶容易再生。孫小梅等應用