現(xiàn)代生物技術(shù)在抗生素工業(yè)中的應(yīng)用

第八章現(xiàn)代生物技術(shù)在抗生素工業(yè)中的應(yīng)用

周濃副教授

重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院當(dāng)前第1頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)當(dāng)前第2頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)當(dāng)前第3頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)抗生素、氨基酸、核苷酸、維生素等基因工程藥物、疫苗及抗體產(chǎn)品傳統(tǒng)生物制藥現(xiàn)代生物制藥傳統(tǒng)生物制藥工業(yè)的特點(diǎn)產(chǎn)量與發(fā)酵規(guī)模大出口比重大示范效應(yīng)明顯當(dāng)前第4頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)產(chǎn)業(yè)規(guī)模大2007年我國抗生素原料銷售收入350多億元，我國抗生素原料藥產(chǎn)能、產(chǎn)量居世界首位產(chǎn)能過萬噸產(chǎn)品：青霉素、頭孢菌素、紅霉素中國已經(jīng)成為氨基酸生產(chǎn)和消費(fèi)大國,年消費(fèi)量約140萬t左右維生素現(xiàn)已成為國際醫(yī)藥與保健品市場的主要大宗產(chǎn)品之一，每年維生素市值已達(dá)25億美元，我國年產(chǎn)能力約20萬t

大容積發(fā)酵罐當(dāng)前第5頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)傳統(tǒng)育種方法與現(xiàn)代生物技術(shù)

在制藥工業(yè)中的比較傳統(tǒng)的育種方法:要用經(jīng)典的方法育種盲目性高不能組合不同菌株的優(yōu)良性狀現(xiàn)代生物技術(shù):基因重組改造菌種提高產(chǎn)品產(chǎn)量改造傳統(tǒng)的發(fā)酵生產(chǎn)工藝,節(jié)約能源和原料,降低污染當(dāng)前第6頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)誘變育種采用誘變因子促使微生物遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致其性能改善到菌種優(yōu)化方法物理誘變因子紫外線、射線

化學(xué)誘變劑化學(xué)因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等突變是隨機(jī)過程，篩選過程大，不能增加拷貝數(shù)當(dāng)前第7頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)現(xiàn)代生物技術(shù)：理性化育種建立在微生物生理代謝理論和抗生素合成機(jī)理基礎(chǔ)上，有目的調(diào)節(jié)產(chǎn)生菌生理代謝、調(diào)節(jié)生物合成途徑或改造其生物合成基因結(jié)構(gòu)到育種。鏈霉菌為主到次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌到基因克隆表達(dá)宿主系統(tǒng)日益完善當(dāng)前第8頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)新觀點(diǎn)：系統(tǒng)代謝工程改造菌種ParkJH,etal.CurrentOpinioninBiotechnology,2008,19:454-460SystemMetabolicEngineering當(dāng)前第9頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)大量引進(jìn)國外高產(chǎn)菌株

我國至今用于大規(guī)摸工業(yè)生產(chǎn)的生產(chǎn)菌株，如青霉素、紅霉素、頭C、各種氨基酸、阿維霉素、泰樂霉素、黃霉素以及高表達(dá)水平的基因工程產(chǎn)品等幾乎都是從國外高價(jià)引進(jìn)。因此，從根本意義上來說，我國的傳統(tǒng)生物制藥工業(yè)和現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)缺乏競爭力。當(dāng)前第10頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)現(xiàn)代生物技術(shù)改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)抗生素提高產(chǎn)量和改善組分產(chǎn)生新的雜合抗生素OlanoCetal.MetabolicEngineering2008,10:281-292.紅霉素全基因組序列當(dāng)前第11頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)現(xiàn)代生物技術(shù)改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)氨基酸獲得高產(chǎn)菌種纈氨酸組氨酸蘇氨酸異亮氨酸纈氨酸高產(chǎn)菌種代謝工程改造當(dāng)前第12頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)現(xiàn)代生物技術(shù)改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)維生素:獲得高產(chǎn)菌種簡化生產(chǎn)工藝維生素C我國發(fā)明了維生素C兩步發(fā)酵法，使中國維生素C生產(chǎn)技術(shù)居世界先進(jìn)水平維生素C產(chǎn)量5萬噸以上，占全球產(chǎn)量的40%當(dāng)前第13頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)背景20世紀(jì)70年代,重組DNA技術(shù)興起應(yīng)用于醫(yī)藥蛋白多肽方面,取得了突出的效果.80年代,重組DNA技術(shù)應(yīng)用于結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的次級代謝產(chǎn)物的生物合成.(鏈霉菌)目前,抗生素生物合成酶基因的分離,質(zhì)粒的選擇,基因重組于轉(zhuǎn)移和宿主表達(dá).(已克隆的抗生素合成基因有23種之多)基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用當(dāng)前第14頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)第一節(jié)重組DNA技術(shù)在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。當(dāng)前第15頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)

抗生素生物合成并非單一基因的直接產(chǎn)物，而是由初級代謝產(chǎn)物經(jīng)過一系列酶催化產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其形成過程是一個(gè)復(fù)雜的、多因素調(diào)節(jié)的過程傳統(tǒng)的提高微生物產(chǎn)生抗生素能力的方法主要是用誘變劑（如紫外線、化學(xué)誘變劑等）處理微生物，獲得生產(chǎn)能力較高的突變株。80年代，人們開始將DNA重組技術(shù)應(yīng)用于次級代謝產(chǎn)物的生物合成上；通過生物合成酶基因的分離、質(zhì)粒的選擇、基因重組與轉(zhuǎn)移、宿主表達(dá)等方面。當(dāng)前第16頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)傳統(tǒng)發(fā)酵法的弊端：采用經(jīng)典方法育種，盲目性高，無法集合不同菌株的優(yōu)良性狀?；蛑亟M技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：可以定向改造菌種，且能集多個(gè)菌株的多種優(yōu)良性狀于同一菌株，達(dá)到簡化工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量的目的。當(dāng)前第17頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)一、克隆抗生素生物合成基因的方法1.抗生素（鏈霉素）生物合成基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)①鏈霉菌抗生素生物合成基因組的一個(gè)典型特性是G-C堿基組成，（G+C）%高達(dá)70%以上；且三聯(lián)體密碼子中第3個(gè)堿基G、C比例極高②抗生素生物合成基因大多處于一個(gè)基因族中③抗生素生物合成基因除定位在染色體上外，有的定位于質(zhì)粒上當(dāng)前第18頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)2.克隆抗生素生物合成基因的方法1）阻斷變株法2）突變克隆法3）直接克隆法4）克隆抗生素抗性基因法5）寡核苷酸探針法6）同源基因雜交法7）在標(biāo)準(zhǔn)宿主系統(tǒng)中克隆檢測單基因產(chǎn)物當(dāng)前第19頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)1.阻斷變株法阻斷變株法

通過一系列阻斷變株的互補(bǔ)結(jié)果來確定被克隆的DNA片斷的性質(zhì)方法與步驟

野生型突變型篩選表型恢復(fù)型分析基因總DNA基因庫當(dāng)前第20頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)TetracenomycinC(tamC)TetracenomycinC(丁省霉素)

是一個(gè)有淡青鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素分離tamC—的突變株并分析阻斷性質(zhì)野生型總DNABamH1消化連接到pIJ702分離tamC+克隆其基因當(dāng)前第21頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)2.突變克隆法ligation重組整合載體轉(zhuǎn)化藥物產(chǎn)生菌整合質(zhì)?；蚴删wDNA片段發(fā)生整合，可能干擾某生物合成基因說明這個(gè)生物合成基因發(fā)生了插入突變，這個(gè)基因就是這個(gè)生物合成相關(guān)當(dāng)前第22頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)3.直接克隆法直接克隆法直接克隆整套的生物合成基因（適合于基因簇相對較?。?lt;30kb）的抗生素生物合成基因。局限：大片段基因簇的穩(wěn)定性、原始株的重要的調(diào)控因素當(dāng)前第23頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)頭霉素C基因的克隆篩選對C.terrigena抗性的菌株克隆其基因分別將轉(zhuǎn)化子涂平板部分酶切鏈霉菌總DNA選擇20-40kb的片段連接到pIJ943的BglⅡ位點(diǎn)轉(zhuǎn)化變青鏈霉菌1326篩選轉(zhuǎn)化子（不產(chǎn)黑色素、硫鏈絲菌素抗性）檢測產(chǎn)物：TLC，HPLC等。當(dāng)前第24頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)根據(jù)抗生素生物合成基因和抗性基因是連鎖的，表達(dá)上也是協(xié)同的，而且抗性基因比較?。?-2kb），容易檢測和克隆。ligation重組載體轉(zhuǎn)化抗性敏感得抗生素產(chǎn)生菌Vector藥物產(chǎn)生菌DNA酶切片段分析連鎖得生物合成基因probe產(chǎn)生菌genomeabankhybrid分離與之同源并帶有生物合成基因的DNA片段局限：有些抗生素不與合成基因連鎖，并且可能抗性不止一個(gè)，所以分析比較復(fù)雜。4.克隆抗生素抗性基因法當(dāng)前第25頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)紅霉素生物合成基因的克隆

得到陽性克隆分析表明：片段為35kb，含有所有紅霉素生物合成基因和抗性基因Mbo1酶切產(chǎn)生菌總DNA與穿梭粘粒pKC462a連接分析片段轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌SF8形成轉(zhuǎn)化子以含有紅霉素抗性基因質(zhì)粒pIJ43為探針進(jìn)行菌落原位雜交當(dāng)前第26頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)5.寡核苷酸探針法事實(shí)基礎(chǔ)

鏈霉菌基因?qū)γ艽a子的利用有明顯的不隨機(jī)性，即DNA中G+C的比例為70%以上，密碼子第三位有90%以上為G或C原理

分離抗生素生物合成酶后，獲得這些酶的氨基酸序列，根據(jù)氨基酸序列推倒出較低程度簡并性的基因序列，人工合成寡核苷酸探針，從基因文庫中就可克隆生物合成基因當(dāng)前第27頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)6.同源基因雜交法原理

利用一種已克隆的抗生素生物合成基因片段為探針，探測相關(guān)抗生素同源基因，最后分離及克隆抗生素生物合成基因

由于基因保守序列的同源性，利用同源基因雜交法克隆化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的抗生素生物合成基因是比較快速準(zhǔn)確的方法當(dāng)前第28頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)7.在標(biāo)準(zhǔn)宿主系統(tǒng)中克隆檢測單基因產(chǎn)物鳥槍克隆法把抗生素產(chǎn)生菌的DNA克隆到最常用的宿主——變青鏈霉菌中，通過檢測宿主中的個(gè)別基因產(chǎn)物，篩選克隆，從而分離基因。利用鳥槍克隆法，把抗生素產(chǎn)生菌DNA克隆到最常用的宿主—變青鏈霉菌中，通過檢測宿主菌中個(gè)別基因產(chǎn)物，篩選克隆，從而分離到相應(yīng)的基因。當(dāng)前第29頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)digestion質(zhì)粒genome

ligationtransformHost-TestphenotypeShotgun當(dāng)前第30頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)抗生素基因簇的組成當(dāng)前第31頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)PABA合成酶基因——pab的克隆受體菌BamH1連接供體菌：過量生產(chǎn)PABA的磺胺抗性的灰色鏈霉菌總DNA篩選磺胺抗性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化分離基因當(dāng)前第32頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)克隆抗生素所用的方法當(dāng)前第33頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)二、幾種典型的抗生素生物合成基因的結(jié)構(gòu)紅霉素:參與紅霉素生物合成的基因長度為60kb，整個(gè)基因由23個(gè)ORF(openreadingframe)組成。中心部分約為35kb，稱為eryA，由3個(gè)ORF（eryAⅠ，eryAⅡ，eryAⅢ）組成，主要參與內(nèi)酯環(huán)的合成。eryF編碼細(xì)胞色素P450單氧化酶，使6位原子羥基化；”eryB”與”eryC”是兩組基因，分別與紅霉素的形成和紅霉內(nèi)酯的3-O-紅霉糖苷化有關(guān)，及與紅霉糖胺的形成或3-O-紅霉糖苷化有關(guān)；eryK編碼C-12羥基化酶。當(dāng)前第34頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)

AT-acyltransferaseACP-acylcarrierproteinKS-ketosynthaseKR-ketoreductaseDH-dehydrtaseER-enoylreductaseTE-thioesteras脫氧紅霉內(nèi)酯B脫氧紅霉內(nèi)酯B的生物合成ORF1ORF2ORF3當(dāng)前第35頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)

青霉素：pcbC基因編碼異青霉素N合成酶，通過“反向遺傳學(xué)”方法克隆IPNS的N末端氨基酸序列，根據(jù)已知的氨基酸序列，以合成的寡核苷酸為探針，通過雜交來識別含有相關(guān)DNA序列的克隆體，經(jīng)DNA序列分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可讀框，并能在大腸桿菌中表達(dá)，這種重組大腸桿菌可產(chǎn)生IPNS，故證實(shí)已克隆到了pcbC基因。當(dāng)前第36頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)按硫代模板機(jī)制進(jìn)行。ACV合酶合成δ-氨基己二酸-半胱氨酸-D-纈氨酸三肽。由IPN合酶催化形成異青霉素N。

++ACV合酶異青霉素NIPN合酶δ-氨基己二酸-半胱氨酸-D-纈氨酸三肽異青霉素的生物合成當(dāng)前第37頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)青霉素和頭孢菌素的生物合成當(dāng)前第38頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)三、提高抗生素產(chǎn)量的方法經(jīng)典方法通過物理或化學(xué)手段進(jìn)行誘變育種得到高產(chǎn)菌株基因工程方法定向改造基因提高基因的表達(dá)水平改造菌種生產(chǎn)能力當(dāng)前第39頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)提高抗生素產(chǎn)量在工業(yè)上改良微生物工業(yè)菌種，提高抗生素產(chǎn)量主要依賴物理化學(xué)手段進(jìn)行誘變育種，但是利用基因工程手段有目的地定向改造基因，提高基因表達(dá)，以及改造菌種生產(chǎn)能力具有極大發(fā)展?jié)摿?。?dāng)前第40頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)原理：在克隆菌株中，增加某一與產(chǎn)量有關(guān)的基因（限速階段的基因或正調(diào)節(jié)基因）劑量，使產(chǎn)量提高。方法1：將產(chǎn)生菌基因隨機(jī)克隆至原株直接篩選高產(chǎn)菌株當(dāng)前第41頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)抗生素合成途徑中的某個(gè)階段可能是整個(gè)合成中的限速階段，識別位于合成途徑中的“限速瓶頸”，并設(shè)法倒入能提高這個(gè)階段酶系的基因拷貝數(shù)，就有可能增加最終抗生素的產(chǎn)量。故增加生物合成中限速階段酶基因劑量有可能提高抗生素產(chǎn)量?？股睾铣赏緩街械拇x支路的關(guān)鍵基因消除，提高紅霉素合成流量方法2：增加和敲除合成途徑的關(guān)鍵基因當(dāng)前第42頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)增加生物合成限速酶系編碼基因的拷貝數(shù)Methylmalonyl-CoA(mmCoA)metabolitenodeinerythromycinbiosynthesis當(dāng)前第43頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)開源：強(qiáng)化紅霉素合成甲基丙二酰CoA代謝節(jié)點(diǎn)拷貝甲基丙二酰CoA變位酶（MCM）操縱子，紅霉素產(chǎn)量增加50%。ReevesAR,etal.MetabolicEngineering,2007,9:293-303.當(dāng)前第44頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)節(jié)流：克拉維酸合成中3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因敲除LiRFetal.MetabolicEngineering,2006,8:240-252.當(dāng)前第45頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)當(dāng)前第46頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)依據(jù)在許多鏈霉菌中，調(diào)節(jié)基因嵌在控制抗生素產(chǎn)生的基因簇中正調(diào)節(jié)基因?qū)Y(jié)構(gòu)基因進(jìn)行正向調(diào)節(jié)負(fù)調(diào)節(jié)基因?qū)Y(jié)構(gòu)基因進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)

將額外的正調(diào)節(jié)基因引入野生型菌株中，使獲得高產(chǎn)產(chǎn)物的最簡單的方法增加正性調(diào)節(jié)基因或降低負(fù)性調(diào)節(jié)基因也是增加抗生素產(chǎn)量的方法方法3：通過調(diào)節(jié)基因的作用當(dāng)前第47頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)紅霉素合成調(diào)節(jié)基因bldD的發(fā)現(xiàn)ChngC,etal.PNAS,2008,105:11346-11351當(dāng)前第48頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)美伐他汀合成調(diào)節(jié)基因mlcR的強(qiáng)化表達(dá)降血脂藥物ApplMicrobiolBiotechnol(2009)83:697–704當(dāng)前第49頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)事實(shí)依據(jù)1、抗生素的生產(chǎn)水平是由抗生素生物合成酶和對自身抗性的酶所共同決定的2、抗性基因經(jīng)常和生物合成基因連鎖，是激活生物合成基因基因轉(zhuǎn)錄的必需成分3、抗性基因必需先轉(zhuǎn)錄，建立抗性后，生物合成基因的轉(zhuǎn)錄才能進(jìn)行所以可以通過提高菌種自身的抗性水平來改良菌種，提高抗生素產(chǎn)量。

方法4：增加抗性基因當(dāng)前第50頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)鏈霉素抗性篩選法在選育博來霉素A2組分高產(chǎn)菌株中的應(yīng)用中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2007,38(5):344-346當(dāng)前第51頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)四、改善抗生素組分例:阿維菌素選育只能生產(chǎn)B2a的菌株是十分有意義的基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用多組分，生理活性上，相差大。應(yīng)用基因工程方法，可以定向的改造抗生素產(chǎn)生菌，獲得只產(chǎn)生有效組分的菌種。當(dāng)前第52頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)當(dāng)前第53頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)當(dāng)前第54頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)紅霉素基因工程技術(shù)

現(xiàn)狀次級代謝產(chǎn)物的復(fù)雜代謝調(diào)控機(jī)制分子改造局限于模式生物，缺乏工業(yè)生產(chǎn)菌株的應(yīng)用，國內(nèi)外沒有報(bào)道紅霉素生物合成途徑7264個(gè)基因，多基因簇

當(dāng)前第55頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)A（76.8%）B（3.9%）C（4.4%）原生產(chǎn)菌株HPLC組分圖當(dāng)前第56頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)紅霉素生物合成途徑的復(fù)雜性當(dāng)前第57頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)1丙酸＋6甲基丙二酸PKSeryA6-脫氧紅霉內(nèi)酯（6-dEB）eryFC-羥化酶紅霉內(nèi)酯（EB）L-mycarose糖基轉(zhuǎn)移酶eryB3-L-mycarose紅霉內(nèi)酯MEBD-desosamine糖基轉(zhuǎn)移酶eryC紅霉素D（ErD）C-12羥化酶eryK紅霉素C（ErC）eryG紅霉素A（ErA）甲基化酶eryG紅霉素B（ErB）C-12羥化酶eryK紅霉素F（ErF）紅霉素E（ErE）甲基化酶當(dāng)前第58頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)圍繞紅霉素菌種改造的工作

研究內(nèi)容：調(diào)節(jié)羥化酶（eryK）和甲基化酶（eryG）表達(dá)，優(yōu)化紅霉素D轉(zhuǎn)化為紅霉素A兩條代謝途徑的通量分布當(dāng)前第59頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)幾種基因操作后獲得的不同突變株情況匯總ChenYetal.ApplEnviron.Microbiol.2008,6:1820-1828.當(dāng)前第60頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)基因工程菌發(fā)酵基因工程菌紅霉素組分跟蹤

50L發(fā)酵罐發(fā)酵批次數(shù)據(jù)

基因工程菌多參數(shù)相關(guān)分析現(xiàn)生產(chǎn)菌種6742162

1232

當(dāng)前第61頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)五、改進(jìn)抗生素生產(chǎn)工藝氧：將血紅蛋白基因克隆到放線菌中，促進(jìn)有氧代謝、菌體生長和抗生素合成。傳統(tǒng)方法：對發(fā)酵罐進(jìn)行改造（成本高，利用率?。┗蚬こ淘诳股厣a(chǎn)中的應(yīng)用基因工程方法：引入血紅蛋白基因到產(chǎn)生菌中，在細(xì)胞中表達(dá)血紅蛋白，從提高細(xì)胞自身代謝功能解決溶氧供求矛盾透明顫菌血紅蛋白（VitreoscillahemolobinVHb)對氧的親和力提高，臨界氧下降DOOURCLCVHB當(dāng)前第62頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)透明顫菌血紅蛋白基因在產(chǎn)黃青霉中的克隆與表達(dá)產(chǎn)黃青霉生物量提高9.76%，青霉素產(chǎn)量提高了9.68%中國抗生素雜志，2006，7：400-402.當(dāng)前第63頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)六、產(chǎn)生雜合抗生素組合生物合成：利用生物合成酶基因的底物寬容性及其相互作用進(jìn)行生物合成酶基因的重組、組合、互補(bǔ)、替換等操作，以產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)化合物。與原有化合物相比，這些新化合物的結(jié)構(gòu)改變可以發(fā)生在母核上，也可以發(fā)生在母核的修飾上。用途

?為功能化合物包括新藥的篩選提供人工“天然產(chǎn)物”庫?定向改造已有功能化合物提供了綠色途徑。當(dāng)前第64頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)1.基因重組當(dāng)前第65頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)2.酶基因突變當(dāng)前第66頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)3.引入酶基因當(dāng)前第67頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)4.酶催化形成新產(chǎn)物

當(dāng)前第68頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)組合生物合成操作策略當(dāng)前第69頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)紅霉素的組合生物合成當(dāng)前第70頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)當(dāng)前第71頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)紅霉素組合生物合成：新化合物BasnetDB,etal.J.Biotechnol.2008,135:92-96.當(dāng)前第72頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)必特螺旋霉素簡介利用組合生物合成技術(shù)將碳霉素產(chǎn)生菌的4”-異戊酰轉(zhuǎn)移酶基因（carE）克隆到螺旋霉素產(chǎn)生菌Streptomycesspiramyceticus

F21中而獲得的基因工程雜合抗生素我國第一個(gè)基因工程抗生素，目前已作為一類新藥進(jìn)入二期臨床藥效學(xué)：表明必特螺旋霉素的抗菌活性及治療效果優(yōu)于乙酰螺旋霉素、麥迪霉素和紅霉素。當(dāng)前第73頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)必特螺旋霉素結(jié)構(gòu)

R：HCOCH3COCH2CH3R’：COCH2CH(CH3)2

COCH2CH2CH3COCH2CH3COCH2CH3COCH3當(dāng)前第74頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)第二節(jié)

基因工程技術(shù)在新藥研究中的應(yīng)用當(dāng)前第75頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)靶酶當(dāng)前第76頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)受體當(dāng)前第77頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)第三節(jié)細(xì)胞工程在傳統(tǒng)制藥工業(yè)中的應(yīng)用當(dāng)前第78頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)當(dāng)前第79頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)當(dāng)前第80頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)抗生素類藥物總結(jié)

一、定義

瓦克斯曼于1942年首先給抗生素下了一個(gè)明確的定義：抗生素是一個(gè)低分子量的微生物代謝產(chǎn)物，在低濃度時(shí)（低于1mg／mL）能抑制其他微生物生長。81當(dāng)前第81頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)抗生素半合成抗生素次級代謝產(chǎn)物當(dāng)前第82頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)抗感染藥物抗菌藥物化學(xué)治療藥（化療藥）當(dāng)前第83頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)化療提出者：保羅.恩利希（德國，1911）當(dāng)前第84頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)走出“化療就是腫瘤化療”的誤區(qū)當(dāng)前第85頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)如果說，原子彈是第二次世界大戰(zhàn)中殺傷力量最強(qiáng)的武器，那么，青霉素就是從這個(gè)戰(zhàn)場拯救生命最多的藥物。難怪有人把原子彈、雷達(dá)和青霉素并列為第二次世界大戰(zhàn)期間的三大科學(xué)發(fā)明。1942年美國制藥公司對青霉素進(jìn)行批量生產(chǎn)。1944年用于二戰(zhàn)盟軍青霉素終于在1943年問世86當(dāng)前第86頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)S.A.SelmanAbrahamWaksman(1888～1973)

烏克蘭裔美國生物化學(xué)家土壤微生物學(xué)家

1952年獲得諾貝爾獎瓦克斯曼拋棄了傳統(tǒng)的靠碰巧來分離抗生素的方法，開始通過篩選成千上萬的微生物來有意識、有目的地尋找抗生素。瓦克斯曼被稱為抗生素之父。瓦克斯曼.S.A87當(dāng)前第87頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)抗生素類藥物研制的歷史青霉素G19291958年batchelor分離6－APA，半合成青霉素頭孢菌素C1961年鏈霉素（1944）氯霉素（1947）紅霉素（1952）萬古霉素（1956）金霉素土霉素四環(huán)素（1948）（1950）（1952）半合成四環(huán)素類半合成紅霉素類利福霉素（1958）卡那霉素（1958）慶大霉素（1963）利福平氨基糖苷類

β—內(nèi)酰胺類氯霉素全合成（1949）881961年AbraHAM分離7－ACA，半合成頭孢菌素多粘菌素B（1947）新霉素（1948）林可霉素（1962）當(dāng)前第88頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)二、產(chǎn)生菌目前已知的天然抗生素不下萬種。主要來源于:放線菌來源：其中近半數(shù)為放線菌所產(chǎn)生，其中主要是鏈霉菌屬。如鏈霉素、金霉素、紅霉素、創(chuàng)新霉素、爭光霉素和春雷霉素等；細(xì)菌來源：細(xì)菌所產(chǎn)生的有桿菌肽、短桿菌肽、多粘菌素等；真菌來源（青霉菌和黑曲霉菌）：真菌所產(chǎn)生的有青霉素、灰質(zhì)霉素等。89當(dāng)前第89頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)三、生物合成以生物合成途徑為基礎(chǔ)，抗生素可劃分為：1.一級代謝的同系物(氨基酸、核苷酸、輔酶等同系物)，這些小分子，生物合成的方式和結(jié)構(gòu)上與一級代謝相似。2.由聚合作用產(chǎn)生的抗生素。90當(dāng)前第90頁\共有98頁\編于星期四\9點(diǎn)2.由聚合作用產(chǎn)生的抗生素（1）多肽類抗生素及其衍生物，是由一些氨基酸聚合形成多肽鏈，再進(jìn)一步進(jìn)行改造。（2）由乙酸和丙酸單位衍生的抗生素，包