狂犬病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

一、實(shí)驗(yàn)室操作前的要求及準(zhǔn)備二、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法當(dāng)前第1頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)1實(shí)驗(yàn)室操作前的要求及準(zhǔn)備（一）實(shí)驗(yàn)室條件及生物安全操作要求（二）檢測(cè)標(biāo)本的要求（三）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備當(dāng)前第2頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)2（一）實(shí)驗(yàn)室條件及生物安全操作要求1、暴露前免疫工作人員需要暴露前免疫意外暴露于狂犬病毒時(shí),必需立即報(bào)告部門負(fù)責(zé)人。2、P2實(shí)驗(yàn)室

操作所有潛在狂犬病感染的材料均應(yīng)在P2或P3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行(實(shí)驗(yàn)室固定毒在P2，病人或動(dòng)物分離的街毒在P3）。3、P3實(shí)驗(yàn)室

對(duì)動(dòng)物標(biāo)本進(jìn)行狂犬病毒分離時(shí)，必須在P3以上條件的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

沒有P3實(shí)驗(yàn)室，嚴(yán)禁從事狂犬病毒分離工作。當(dāng)前第3頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)34、個(gè)人防護(hù)實(shí)驗(yàn)前要穿戴好防護(hù)服、眼鏡、手套，作好技術(shù)上的準(zhǔn)備。5、防止氣溶膠擴(kuò)散由于空氣傳播狂犬病毒已經(jīng)得到證實(shí)，因此高速混懸或離心操作應(yīng)在密閉狀態(tài)下進(jìn)行。6、實(shí)驗(yàn)后消毒處理實(shí)驗(yàn)后要作好善后消毒處理,狂犬病毒對(duì)脂溶劑（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制劑和四銨化合物敏感，操作完畢對(duì)操作臺(tái)、實(shí)驗(yàn)材料等要用相應(yīng)的消毒劑或高壓蒸汽進(jìn)行消毒處理。當(dāng)前第4頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)41、采集時(shí)間

（1）應(yīng)盡量采集較新鮮的標(biāo)本。（2）采集時(shí)無(wú)菌操作，避免標(biāo)本污染2、標(biāo)本保存（1）盡量低溫保存（2）存放于無(wú)菌離心管中并進(jìn)行編號(hào)。

3、標(biāo)本類型（1）唾液、腦脊液、眼角膜、咬傷處皮膚組織、腦組織、血清等。（2）唾液、腦脊液、眼角膜、咬傷處皮膚組織、腦組織等均可用于病原學(xué)檢測(cè)，其中以腦組織中的陽(yáng)性率最高；血清和腦脊液可用于抗體的檢測(cè)。（二）檢測(cè)標(biāo)本的要求當(dāng)前第5頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)5（三）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備1、實(shí)驗(yàn)室及儀器的準(zhǔn)備（略）2、各種試劑及材料的準(zhǔn)備（略）當(dāng)前第6頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)6實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法（一）DFA法（二）巢式PCR法（三）其它檢測(cè)方法（四）狂犬病診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS281-2008）中的檢測(cè)方法（五）美國(guó)CDC狂犬病實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)中的檢測(cè)方法當(dāng)前第7頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)7（一）DFA法（直接熒光抗體法）

——檢測(cè)狂犬病毒抗原

免疫熒光技術(shù)Ab優(yōu)點(diǎn)Ag(尤其是不產(chǎn)生細(xì)胞病變的病毒安全快速簡(jiǎn)便敏感性和特異性較高當(dāng)前第8頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)8熒光抗體的染色方法可分為兩類：直接法—熒光抗體直接與標(biāo)本內(nèi)的抗原反應(yīng),優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便、快捷、有效減少非特異性染色,只適用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的抗原；間接法

—熒光抗體作為第二抗體，與直接結(jié)合胞內(nèi)抗原的第一抗體反應(yīng),既可檢測(cè)胞內(nèi)抗原，也可以檢測(cè)體液中的特異抗體相對(duì)直接法操作步驟增多

DFA原理：

抗體蛋白分子

++抗原→形成抗原抗體復(fù)合物→通過熒光顯微鏡→檢測(cè)抗原

熒光素當(dāng)前第9頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)9操作：1、材料和儀器2、操作步驟i.印片：

用酒精浸泡載玻片30分鐘后取出、吹干，分別取不同部位的腦組織剖面,均勻的涂印在載玻片上；

ii.固定：

吹干后，取冷丙酮（4℃）室溫固定7～10分鐘；取出吹干，進(jìn)行步驟3，或置于－70℃冰箱保存；

iii.加熒光抗體：

將稀釋好的熒光抗體滴加在固定好的抗原片上（如果從冰箱中取出，則待霧氣散掉后再進(jìn)行此步驟。）；

當(dāng)前第10頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)10iv.孵育：

將抗原片放在濕盒中，37℃溫育30分鐘；v.洗片：

取出后，用緩流沖洗抗原片3～5秒，再用PBS振洗2遍，蒸餾水振洗1遍，每次2分鐘，吹干；

vi.封片鏡檢：

用90％甘油（PBS）封片，加蓋玻片，熒光顯微鏡觀察。

攪拌器及染色缸

當(dāng)前第11頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)11結(jié)果判斷：

仔細(xì)觀察每個(gè)視野的熒光強(qiáng)度，并結(jié)合不同視野的熒光分布，作出熒光強(qiáng)度的等級(jí)判斷：陰性、可疑、＋~＋＋＋＋－：無(wú)熒光；＋/－：極弱的可疑熒光；無(wú)熒光“－”

當(dāng)前第12頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)12＋：熒光較弱，但清晰可見；當(dāng)前第13頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)13＋＋：熒光明亮，且多個(gè)視野均有分布；當(dāng)前第14頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)14＋＋＋～＋＋＋＋：熒光閃亮，可見尼基氏小體清晰，且范圍廣泛；熒光強(qiáng)度“＋＋＋”熒光強(qiáng)度“＋＋＋＋”當(dāng)前第15頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)15當(dāng)前第16頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)16（二）巢式PCR方法——檢測(cè)狂犬病毒核酸

傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)模式一般需要三個(gè)步驟：制備模板：對(duì)待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行核酸（DNA或RNA）提取擴(kuò)增過程：采用PCR或RT-PCR技術(shù)對(duì)核酸進(jìn)行變性、退火、延伸擴(kuò)增；檢測(cè)過程：通過電泳等方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

SampleExtractRNAorDNAPCRElectrophoresisphotograph當(dāng)前第17頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)17巢式PCR（nested－PCR）：巢式PCR的原理：

是設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其中一對(duì)引物在另一對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的片段上，通過二次PCR反應(yīng)對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)。通常第一次采用能擴(kuò)增較大片段的引物，經(jīng)過循環(huán)擴(kuò)增后，將第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增。

優(yōu)點(diǎn)：

特異性、靈敏度均比常規(guī)PCR好。缺點(diǎn)：

比常規(guī)PCR易污染。當(dāng)前第18頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)18巢式PCR方法的操作：

1、RNA提?。篢rizol法

（1）以下步驟在P2生物安全柜中進(jìn)行

取不同位置的少量腦組織（50-100mg）＋1000μlTrizol先加200μl（研磨均勻）然后加滿至1000μl[液體（唾液、尿液等）取250μl＋750μlTrizolLS]↓-70℃過夜或顛倒Epp管30～40次以便充分混勻內(nèi)容物，室溫放置5分鐘（此步完可-70℃保存1個(gè)月）

當(dāng)前第19頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)19（2）以下步驟可在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行

-70℃取出，室溫融化→加200μl氯仿，快速顛倒Epp管數(shù)次（30秒），使其呈淡粉紅色↓室溫放置3min↓4℃離心，12000rpm，15min（其間標(biāo)記新的離心管，每管中加600μl異丙醇）↓取離心后水相600μl，加入新的離心管中，輕柔混勻↓室溫放置10min（－20℃放置30分鐘效果更佳）↓4℃離心，12000rpm，10min↓

當(dāng)前第20頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)20緩緩倒掉上清，用槍頭輕輕吸去殘存液體，可見少量沉淀↓加1ml75％乙醇（DEPCH2O新鮮配制）洗滌沉淀↓4℃離心12000rpm，10min↓緩緩倒掉上清，用槍頭輕輕吸去殘存液體，室溫干燥數(shù)分鐘（加入75％乙醇至－70℃可長(zhǎng)期貯存1～2年）↓腦組織的沉淀溶于70ulDEPCH2O中(2個(gè)EPP管分裝)[液體（唾液、尿液等）的沉淀溶于35ulDEPCH2O中]↓直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄或－70℃貯存

當(dāng)前第21頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)21注意事項(xiàng)：

1.操作時(shí)一定戴口罩手套，保證離心管槍頭無(wú)RNA酶2.一次提取核酸，樣本數(shù)不要太多（10個(gè)左右）3.加入氯仿后到加入異丙醇之前的操作應(yīng)盡量快速且作用時(shí)間準(zhǔn)確，否則容易降低提取效率4.異丙醇和乙醇作用時(shí)間略長(zhǎng)不影響結(jié)果5.加入異丙醇后所有的混均操作要輕柔，加液體時(shí)貼壁緩流，以免破壞到所提核酸6.盡量縮短RNA在空氣及室溫的暴露時(shí)間，水溶的RNA一定要低溫保存7.標(biāo)本及時(shí)放回-20℃或-70℃

當(dāng)前第22頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)222、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA1）pd(N)6稀釋至0.2ug/ul2）水浴預(yù)熱至65℃（其間標(biāo)記反應(yīng)管）3）33ulRNA液65℃水浴10min（其間準(zhǔn)備冰盒或碎冰）4）冰浴2min，瞬時(shí)離心。5）將液體轉(zhuǎn)移至試劑盒反應(yīng)管中32ul，先不要混勻。6）再向反應(yīng)管中加入1ulpd(N)60.2ug/ul或特異引物各0.5ul，使總體積達(dá)到33ul，室溫1min，混勻，瞬時(shí)離心。7）37℃水浴，60min8）-20℃或-70℃保存cDNA當(dāng)前第23頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)233、巢式PCR：當(dāng)前第24頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)24當(dāng)前第25頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)25瓊脂糖凝膠電泳

1．電泳槽中注入緩沖液TAE2．將做好的瓊脂膠放入電泳槽（加樣孔在負(fù)極方向）3．Marker加5ul，樣品加10ul5．電壓：100V6．時(shí)間：30min

照相：凝膠成像儀/紫外透射儀當(dāng)前第26頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)26（三）其它檢測(cè)方法1、ELISA——檢測(cè)抗原：包被抗體：用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋的抗狂犬病毒核衣殼IgG包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜；

封閉：用含0.3％牛血清白蛋白和5%蔗糖的pH9.6碳酸鹽緩沖液封閉30分鐘；加待檢標(biāo)本：將采集到的標(biāo)本研磨，用pH7.4PBS制成30％的懸液，離心取上清加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，同時(shí)設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照，200μl/孔，37℃孵育1小時(shí)；洗板：洗板四次；加酶標(biāo)抗體：后加入純化的酶標(biāo)記抗狂犬病毒抗體200μl/孔，37℃l小時(shí)；洗板：同上；加底物：加入酶反應(yīng)底物，室溫作用30分鐘；終止反應(yīng)：加2MH2SO4終止反應(yīng)；觀察結(jié)果：肉眼觀察或酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果。當(dāng)前第27頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)272、熒光灶抑制試驗(yàn)——檢測(cè)中和抗體

中和抗體：

為疫苗免疫力程度的評(píng)判指標(biāo)中和抗體水平等于或高于0.5IU/ml血清，表示能得到有效的保護(hù)快速熒光灶抑制試驗(yàn)（RFFIT）：為WHO推薦的檢測(cè)方法

制備細(xì)胞懸液(1×10cells/ml的BSR細(xì)胞懸液)

↓

稀釋血清和病毒(待測(cè)血清、對(duì)照血清、標(biāo)準(zhǔn)血清、病毒固定毒CVS株）

↓

中和血清和病毒(0.1ml血清和標(biāo)準(zhǔn)病毒稀釋液0.1m1，37℃中和1.5小時(shí))

↓

檢測(cè)剩余病毒(每孔加入50μl制備好的細(xì)胞懸液，37℃、5%C02過夜培養(yǎng))

↓

固定(棄掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，丙酮固定)

↓

熒光抗體檢測(cè)(干燥后，加熒光素標(biāo)記的抗狂犬病毒抗體，37℃30分鐘)

↓

觀察結(jié)果(PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察結(jié)果)

↓

計(jì)算中和抗體滴度(實(shí)驗(yàn)組中能使熒光灶抑制≥50％的血清最高稀釋倍數(shù)，即為被檢血清的中和抗體滴度)

步驟當(dāng)前第28頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)283、病毒分離A.細(xì)胞培養(yǎng)法——分離病毒研磨標(biāo)本→

制成懸液（用PBS或MEM，30％）→

離心（4℃2000r/min離心20m）→

取上清接種細(xì)胞（鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞、Vero細(xì)胞或BHK21細(xì)胞）→

吸附（2h）→

加維持液→

孵育(37℃、5％C02、4～5天)→

鑒定B.乳小白鼠接種法——分離病毒研磨標(biāo)本

→

制成懸液→

離心→取上清接種乳鼠腦內(nèi)（1～2日齡）→飼養(yǎng)→觀察發(fā)病情況(未發(fā)病的鼠保留至21天后作DFA檢測(cè))當(dāng)前第29頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)294、ELISA——檢測(cè)狂犬病毒抗體ELISA方法測(cè)定的是總抗體，不代表具有保護(hù)性的中和抗體水平其結(jié)果僅供參考。5、染色鏡檢——檢測(cè)內(nèi)基氏小體當(dāng)前第30頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)30（四）狂犬病診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS281-2008）中的檢測(cè)方法1、DFA法——檢測(cè)狂犬病毒抗原

意義：陽(yáng)性結(jié)果，表明有狂犬病毒感染，有確診意義。2、ELISA——檢測(cè)狂犬病毒抗原

意義：檢測(cè)到狂犬病毒抗原陽(yáng)性有診斷意義。3、細(xì)胞培養(yǎng)方法——分離狂犬病毒

意義：陽(yáng)性結(jié)果表明有狂犬病毒感染，有確診意義。當(dāng)前第31頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)314、RT-PCR——檢測(cè)狂犬病毒核酸原理：狂犬病毒為負(fù)鏈RNA病毒，PCR前需要經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶作用，合成一條cDNA鏈（RT）,再進(jìn)行PCR。檢測(cè)步驟：

1）病毒RNA的提取2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA3）PCR擴(kuò)增4）電泳意義：陽(yáng)性結(jié)果表明有狂犬病毒感染，有確診意義。當(dāng)前第32頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)325、狂犬病特異性抗體檢測(cè)狂犬病特異性抗體：

在自然感染情況下，狂犬病毒→通過帶有病毒的動(dòng)物唾液→進(jìn)入機(jī)體傷口→在入侵部位基本上不增殖（一般也不侵入血流）→故不能形成病毒血癥。

在感染后，狂犬病毒或其抗原→不能與機(jī)體免疫系統(tǒng)廣泛接觸→故機(jī)體無(wú)免疫應(yīng)答反應(yīng)（針對(duì)狂犬病毒）。

晚期，狂犬病→破壞血腦屏障→大量病毒抗原→進(jìn)入血流→刺激機(jī)體→產(chǎn)生大量特異性抗體。

因此，通常在發(fā)病早期血清中查不到抗體或抗體滴度很低，只在臨床疾病的晚期出現(xiàn)。當(dāng)前第33頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)33A.快速熒光灶抑制試驗(yàn)（RFFIT）——測(cè)定中和抗體意義：中和抗體水平等于或高于0.5IU/ml血清，表示能得到有效的保護(hù)B.ELISA——檢測(cè)狂犬病毒抗體意義：

1）接種過狂犬病疫苗的患者抗體滴度大于0.5IU/ml，表明已獲得一定的保護(hù)。2）未接種過疫苗的患者的抗體滴度大于1IU/ml，且近期有4倍增高，可考慮狂犬病。

3）部分狂犬病患者在臨死前抗體滴度也可能異常增高。當(dāng)前第34頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)34（五）美國(guó)CDC狂犬病實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)中的檢測(cè)方法

1、DFA——檢測(cè)狂犬病毒抗原

當(dāng)以下情況發(fā)生時(shí)，需要重復(fù)（證實(shí)性）檢測(cè):

1）包涵體顆粒典型