細胞分子生物學碩士實驗課

細胞分子生物學碩士實驗課演示文稿當前第1頁\共有116頁\編于星期四\21點（優(yōu)選）細胞分子生物學碩士實驗課當前第2頁\共有116頁\編于星期四\21點基本實驗主要內容包括核酸分離提取和定性定量質粒和RNA提取電泳基因擴增和分析PCR技術轉染和報告系統(tǒng)細胞轉染熒光素酶報告當前第3頁\共有116頁\編于星期四\21點核酸制備和分析

最基本的實驗技術當前第4頁\共有116頁\編于星期四\21點一、核酸分離純化

核酸：DNA為雙鏈線性分子，在細胞中都以與蛋白質結合的狀態(tài)存在原核染色體DNA、質粒、細胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子RNA：單鏈線性分子并具有不同的結構特點，如真核生物mRNA分子多數(shù)在3＇端帶有polyA結構。當前第5頁\共有116頁\編于星期四\21點分離核酸應注意降解影響：化學降解-酸堿環(huán)境物理降解-DNA的雙鏈剛性生物降解：DNA酶抑制劑金屬二價離子螯合劑-EDTA-Na2抑制DNA酶活性（DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活）RNA酶（RNAase)抑制劑DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)（一過性抑制作用，不能使存在于核酸中樣本中）RNase阻抑蛋白（RNasin）（可在樣本中長期維持）

當前第6頁\共有116頁\編于星期四\21點核酸提取的主要步驟：

一般為破碎細胞，去除與核酸結合的蛋白質以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除鹽、有機溶劑等雜質，最后得到純化的核酸。當前第7頁\共有116頁\編于星期四\21點細胞破碎抽提去蛋白質沉淀核酸典型過程當前第8頁\共有116頁\編于星期四\21點分離提取核酸的主要步驟細胞的破碎機械處理高速組織搗碎機搗碎玻璃勻漿器勻漿液氮研磨法超聲波處理化學處理法(SDS、LDS，吐溫80,CTAB等）當前第9頁\共有116頁\編于星期四\21點核蛋白的解聚、變性蛋白的去除-將與核酸緊密結合的蛋白質分開，同時避免核酸降解。常用方法：濃鹽溶液（如NaCl）-核酸-蛋白質加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚（核酸依然溶解）SDS-SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質上游離出來的功能酚/氯仿抽提-酚／氯仿混合使用具有去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用（酚：氯：異戊醇=25：24：1）酸堿度的調整分離DNA和RNA分離提取核酸的主要步驟當前第10頁\共有116頁\編于星期四\21點沉淀是濃縮核酸最常用的方法。

應用：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質。分離提取核酸的主要步驟當前第11頁\共有116頁\編于星期四\21點核酸沉淀-鹽法鹽貯存液濃度（mol/L)終濃度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8當前第12頁\共有116頁\編于星期四\21點核酸沉淀-醇類乙醇對鹽類沉淀少，乙醇易揮發(fā)除去需要量大，一般要求低溫操作。異丙醇需體積小異丙醇難以揮發(fā)除去用70％乙醇漂聚乙二醇（PEG）適于微量珍貴樣本當前第13頁\共有116頁\編于星期四\21點二、定量定性分析紫外吸收法特征變性與復性中的紫外吸收DNA與RNA特點熒光染料法通常結合電泳方法核酸電泳定性定量當前第14頁\共有116頁\編于星期四\21點紫外吸收法嘌呤和嘧啶在260nm有特異的吸收峰,這個性質用于核酸的分析當前第15頁\共有116頁\編于星期四\21點DNA分子的變性DNA雙螺旋的有序結構受各種理化因子，如熱、酸堿、變性劑、有機溶劑以及稀釋的作用，轉變?yōu)闊o規(guī)則的線團結構。變性的特征增色效應,黏度和比旋下降，沉降系數(shù)增加，生物學活性喪失當前第16頁\共有116頁\編于星期四\21點DNA解鏈曲線增色效應(hyperchromiceffect)

核酸分子加熱變性時，其在260nm處的紫外吸收急劇增加的現(xiàn)象。Tm值：當紫外吸收變化達到最大變化的半數(shù)值時，此時所對應的溫度稱為熔解溫度（Tm）、變性溫度或中點解鏈溫度。當前第17頁\共有116頁\編于星期四\21點3.4復性復性：變性DNA分開的兩股鏈在適當條件下重新生成雙鏈結構的過程退火（annealing）:熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻復性的過程。當前第18頁\共有116頁\編于星期四\21點在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。純度分析純DNA樣品OD260/OD280應為1.8純RNA樣品OD260/OD280應為小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質或酚污染；OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質，如核苷酸、氨基酸、酚等。測定結果分析當前第19頁\共有116頁\編于星期四\21點原理：DNA、RNA本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標準對照，可比較出被測DNA溶液濃度。注意，此法的特點：解決了紫外法無法判斷變性和降解干擾數(shù)據(jù)的問題（樣本保存）。尤其是結合核酸電泳，實際判斷意義更為重要！溴乙錠熒光法當前第20頁\共有116頁\編于星期四\21點核酸的保存DNADNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；長期保存樣品中可加入1滴氯仿。RNARNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;在RNA溶液中，加RNASIN凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。當前第21頁\共有116頁\編于星期四\21點凝膠電泳是分子克隆的中心技術之一。

1.瓊脂糖凝膠用于分離大于200～1000bp的片段;

操作簡單、快速，且分離范圍廣

2.聚丙烯酰胺凝膠用于分離5－500bp的片段;

效果好、分辨率極高，相差1bp的DNA片斷就能分開，能容納相對大量的DNA

用于核苷酸多態(tài)性的分析，測序

三、核酸電泳當前第22頁\共有116頁\編于星期四\21點影響DNA在凝膠中遷移速率的因素：

1DNA分子的大小2構象3凝膠濃度4電壓5緩沖液當前第23頁\共有116頁\編于星期四\21點瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2當前第24頁\共有116頁\編于星期四\21點儀器和試劑儀器電泳儀電泳槽灌膠模具等當前第25頁\共有116頁\編于星期四\21點Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）常用電泳緩沖液當前第26頁\共有116頁\編于星期四\21點電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內。②形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。上樣緩沖液當前第27頁\共有116頁\編于星期四\21點溴化乙錠（EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品DNA濃度。瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng。核酸染色劑注意事項：EB是致癌物質，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。當前第28頁\共有116頁\編于星期四\21點DNA分子量標準當前第29頁\共有116頁\編于星期四\21點瓊脂糖凝膠電泳的基本過程材料：電泳緩沖液（常用TAE或TBE）、電泳級瓊脂糖、溴化乙錠溶液（核酸顯示劑）、加樣緩沖液（保證核酸不在加樣孔中擴散和用于電泳時間的指示系統(tǒng)）、水平凝膠電泳裝置及制膠系統(tǒng)、直流電源系統(tǒng)。

基本過程：制膠放入電泳槽中并加入電泳緩沖液取出梳子將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中一定電壓條件下電泳合適的時間后停止電泳取出凝膠進行溴化乙錠染色凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結果

當前第30頁\共有116頁\編于星期四\21點當前第31頁\共有116頁\編于星期四\21點當前第32頁\共有116頁\編于星期四\21點當前第33頁\共有116頁\編于星期四\21點當前第34頁\共有116頁\編于星期四\21點瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡過程中

DNALadder的形成PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳當前第35頁\共有116頁\編于星期四\21點

聚丙烯凝膠電泳的銀染結果分析當前第36頁\共有116頁\編于星期四\21點

基本過程同DNA電泳一樣，但應明確一點的是，因為RNA分子對RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解；另外，因為RNA分子有二、三級結構可以影響其電泳結果，因此電泳時應在變性劑存在下進行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。

RNA電泳當前第37頁\共有116頁\編于星期四\21點PCR技術當前第38頁\共有116頁\編于星期四\21點PCR(Polymerasechainreaction)是用一對寡聚DNA作為引物，通過加溫變性－退火－DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴增。由于這種擴增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng)25－30個循環(huán)后，擴增倍數(shù)可達106-9。

Dr.KarryMullis1985年發(fā)明，獲1993年度諾貝爾化學獎；目的:

用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。當前第39頁\共有116頁\編于星期四\21點PCR的類型㈠巢式PCR㈦原位PCR㈡多重PCR㈧定量PCR㈢不對稱PCR㈨差異顯示PCR㈣共享引物PCR㈩重組PCR㈤錨定PCR(十一)RT-PCR㈥彩色PCR(十二)RAPD----------當前第40頁\共有116頁\編于星期四\21點多重PCR:是指在一個單一反應中同時擴增多個序列的反應過程，能夠節(jié)省時間和精力（可彩色）。定量PCR技術是指以外參或內參為標準,通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測,進行PCR起始模板量的定量。用于擴增已知一端序列的目的DNA

基本概念當前第41頁\共有116頁\編于星期四\21點巢式PCR：利用兩套PCR引物對進行兩輪PCR擴增反應組成，在第一輪擴增中，外引物用以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在在內引物的存在下進行第二輪擴增。RT-PCR：測定RNA差別顯示ＰＣＲ和RAPD：利用隨機引物擴增并進行樣本間比較基本概念當前第42頁\共有116頁\編于星期四\21點（1）DNA模板的熱變性

將待擴增DNA加熱到940C左右，使雙鏈DNA解開成為單鏈，并游離于反應體系中作為模板。（2）模板與引物的結合（退火或復性）

將體系溫度降至合適溫度（520C左右），使加入的引物與模板DNA兩端（3ˊ端）堿基序列互補結合。當前第43頁\共有116頁\編于星期四\21點（3）引物延伸

將體系溫度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP

按堿基互補原則連接在DNA引物3ˊ端，使鏈延伸，形成兩條與模板互補的新鏈。

以上為1次PCR循環(huán)（變性、復性和延伸）

（新合成的鏈可作為下一輪循環(huán)的模板）

按照上述（變性、復性和延伸）3個步驟反復循環(huán)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)擴增。

模板DNA擴增倍數(shù)T=2n(n:循環(huán)次數(shù))。當前第44頁\共有116頁\編于星期四\21點2.PCR各要素及其作用（1）模板

PCR模板可以是DNA或RNA。以線性DNA模板為佳，量適中，一般為102105個拷貝；

RNA作為模板時，需要：

RNAcDNAPCR,稱此為RT-PCR.

（2）耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)

是從耐熱細菌體內提取的一種DNA聚合酶，可在95℃穩(wěn)定30分鐘。從而保證PCR在[94℃變性→52℃退火→72℃延伸]循環(huán)30次過程中不變性失活。

逆轉錄當前第45頁\共有116頁\編于星期四\21點（3）引物

引物是根據(jù)已知序列的模板DNA待擴增區(qū)兩端而設計的一對寡核苷酸小片斷，長度一般為1530個堿基。引物是保證PCR擴增產(chǎn)物的大小和特異性的關鍵因素，其設計與合成對PCR的成功至關重要。引物設計原則如下：當前第46頁\共有116頁\編于星期四\21點

引物設計應符合以下基本原則：

①長度適宜，一般為1530個堿基；②G+C含量，一般為40％60％；③4種堿基應隨機性分布；④引物自身不應存在互補序列；⑤兩個引物之間不應有多于4個堿基的互補；⑥引物3ˊ端不應有任何修飾；⑦引物5ˊ可以修飾。當前第47頁\共有116頁\編于星期四\21點48（4）緩沖溶液與Mg2+

PCR技術常用1050mmol/LTris-HCl、Ph8.38.88、偏堿緩沖液；并含有一定量的Mg2+濃度；（5）dNTP濃度

PCR一般用50200μmol/L的dNTP；并且4種dNTP濃度應相等；當前第48頁\共有116頁\編于星期四\21點（6）參數(shù)

變性溫度與時間

一般選擇：940C，30秒退火溫度與時間

取決于引物長度、濃度和G+C含量，一般選擇：Tm-5℃

延伸溫度與時間

一般選擇：70℃75℃循環(huán)次數(shù)

取決于模板濃度，一般循環(huán)：30次當前第49頁\共有116頁\編于星期四\21點50

PCR操作

各種PCR反應的操作基本相同，只是根據(jù)引物與靶序列不同，選擇不同的反應體系和循環(huán)參數(shù)。將PCR反應管置于DNA自動化熱循環(huán)儀上，輸入各種循環(huán)參數(shù)，使DNA擴增在熱循環(huán)儀上很方便地完成。

PCR技術優(yōu)點

特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時，對樣本質量要求不高，能快速、特異地擴增任何DNA片斷。

PCR缺點

由于高靈敏度，使易出現(xiàn)假陰性或假陽性結果。當前第50頁\共有116頁\編于星期四\21點51PCR產(chǎn)物分析凝膠電泳分析法

可用瓊脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物的大小。同時應以標準DNA分子量作平行對照，凝膠中加入溴化乙錠，電泳后，紫外檢測儀下觀察結果并拍照。

（在待檢靶序列拷貝數(shù)多、且僅擴增出一條帶時，用此法即可滿足檢測要求。）當前第51頁\共有116頁\編于星期四\21點PCR技術的應用基因檢測：基因克隆化DNA突變DNA序列分析當前第52頁\共有116頁\編于星期四\21點實時定量PCRreal-timePCR通過特定設計的PCR儀來實時監(jiān)測PCR擴增過程每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積數(shù)量，可以很好的推算模板的起始濃度。這種工作方式就成為實時定量PCR。實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍當前第53頁\共有116頁\編于星期四\21點兩種定量化學探針標記TaqManTM

特定的聚合酶染料染色SYBR?GreenI當前第54頁\共有116頁\編于星期四\21點一條探針，兩條引物引物位于探針的兩邊一條探針，兩個基團前邊是報告基團，后邊是淬滅基團3'5'RQ3'3'5'5'3'5'5'

TaqMan探針當前第55頁\共有116頁\編于星期四\21點當前第56頁\共有116頁\編于星期四\21點reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'當前第57頁\共有116頁\編于星期四\21點每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個單位信號信號強度與結合探針的DNA分子數(shù)成正比數(shù)量關系5’TaqMan探針上游引物3’3’5’下游引物RQ3’5’3’5’QR當前第58頁\共有116頁\編于星期四\21點探針法的優(yōu)點與DNA結合時發(fā)光游離時不發(fā)光

SYBRGreenI是一種DNA小溝結合染料當前第59頁\共有116頁\編于星期四\21點在PCR過程中染料與DNA結合發(fā)光聚合完成聚合開始

SYBRGreenI當前第60頁\共有116頁\編于星期四\21點每形成一個DNA雙鏈，就有一定數(shù)量的染料結合上去染料一結合，就產(chǎn)生熒光信號信號強度與DNA分子總數(shù)目成正比數(shù)量關系當前第61頁\共有116頁\編于星期四\21點當前第62頁\共有116頁\編于星期四\21點當前第63頁\共有116頁\編于星期四\21點分子生物學技術基因重組當前第64頁\共有116頁\編于星期四\21點DNA克隆也稱基因克隆或基因工程是指在體外對DNA分子按照既定的目的和方案，對DNA進行剪切和重新連接，然后把它導入宿主細胞，從而能夠擴增有關DNA片段，表達有關基因產(chǎn)物，進行DNA序列分析，基因治療，研究基因表達的調節(jié)因子（如啟動子、增強子等），以及研究基因的功能等。

當前第65頁\共有116頁\編于星期四\21點二、重組DNA技術基本原理及操作步驟基本原理目的基因的獲取DNA導入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達

當前第66頁\共有116頁\編于星期四\21點重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基當前第67頁\共有116頁\編于星期四\21點載體功能克隆載體:

克隆一個基因或DNA片斷表達載體:

用于一個基因的蛋白表達整合載體:

把一個基因插入到染色體組中當前第68頁\共有116頁\編于星期四\21點載體來源：質粒載體噬菌體載體柯斯質粒載體真核細胞克隆載體當前第69頁\共有116頁\編于星期四\21點質粒*受體細胞結構插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細胞線性染色體〉1000kb病毒載體動物細胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞和細菌環(huán)狀pSVK3質粒，PBV,Ti質粒載體的種類和特征當前第70頁\共有116頁\編于星期四\21點一、質粒的生物學特性：1、質粒DNA的構型：

SC型共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA）

OC型開環(huán)DNA（ocDNA）

L型線性DNA（cDNA）2、不同質粒的分子量大小差異相當顯著：

106~108D

3、作為載體的質粒都含有三種共同的組分：復制基因（replicator）、選擇性記號、克隆位點

當前第71頁\共有116頁\編于星期四\21點當前第72頁\共有116頁\編于星期四\21點LOCSC當前第73頁\共有116頁\編于星期四\21點6、質粒DNA的復制類型：

低拷貝的質粒（1～3）：嚴緊型復制控制的質粒（接合型）高拷貝的質粒（10~60）：松弛型復制控制的質粒（非接合型）

7、質粒的不親合性

在同一個大腸桿菌細胞，一般不能同時含有兩種不同的。也稱為質粒的不相容性。是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關系密切的不同質粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。質粒的不親合性分子基礎，主要是由于它們在復制功能之間的相互干擾造成的。當前第74頁\共有116頁\編于星期四\21點質粒的拷貝數(shù)質?？截悢?shù)一般與其分子量成反比關系：質?？截悢?shù)=質粒DNA量/染色體DNA量×MWc/MWp

質粒的不相容性（incompatibility）在沒有選擇壓力的條件下，兩種不同質粒不能共存于同一宿主細胞內的現(xiàn)象。不相容質粒攜帶復制子基本相似，復制系統(tǒng)也相同，在復制和分配到子細胞的過程中相互競爭。當前第75頁\共有116頁\編于星期四\21點克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉錄、進而翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。當前第76頁\共有116頁\編于星期四\21點

2、質粒的拷貝數(shù)及分子的大小

插入分子量大的外源DNA會引起質?？截悢?shù)的下降。當前第77頁\共有116頁\編于星期四\21點

(4)表達型的質粒載體表達載體：按特殊設計構建的，能使克隆在其中特定位點的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細胞中正常轉錄并轉譯成相應蛋白質的克隆載體。

當前第78頁\共有116頁\編于星期四\21點主要包括：大腸桿菌的啟動子、及操縱位點序列、多克隆位點、轉錄及轉譯信號、質粒載體的復制起點及抗菌素抗性基因。待表達的真核基因編碼序列被克隆在緊挨于啟動子下游的多克隆位點上，而且必須是其編碼的蛋白質氨基酸末端這一頭靠近啟動子方向插入，才能在啟動子控制下進行有效的轉錄。當前第79頁\共有116頁\編于星期四\21點5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶

5′3′

3′5′

3′T(T)nT

T(T)nT3′5′

5′

3′

3′5′

5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體當前第80頁\共有116頁\編于星期四\21點受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導入方式轉化(transformation)轉染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導入受體菌當前第81頁\共有116頁\編于星期四\21點轉化（transformation）

轉化是指將質粒或其他外源DNA導入處于感受態(tài)的宿主細胞，并使其獲得新的表型的過程。轉化常用的宿主細胞是大腸桿菌。大腸桿菌懸浮在CaCl2溶液中，并置于低溫（0～5℃）環(huán)境下一段時間，鈣離子使細胞膜的結構發(fā)生變化，通透性增加，從而具有攝取外源DNA的能力，這種細胞稱為感受態(tài)細胞（competentcell）。當前第82頁\共有116頁\編于星期四\21點質粒載體篩選方法插入失活α－互補：IPTG,X-GAL直接篩選：抗生素表達篩選（抗體篩選）Probe篩選當前第83頁\共有116頁\編于星期四\21點質粒載體缺點ＣaCl2轉化效率低克隆片段小于１０kb大量篩選時需要細胞裂解當前第84頁\共有116頁\編于星期四\21點4.DNA重組體的鑒定外源DNA片斷是否插入載體構成重組DNA分子，而插入片斷大小，是否突變及插入位置，順序及方向則關系到構建載體是否擴增，我們所需要的基因或表達，表達相應的產(chǎn)品，所以需要進一步鑒定DNA重組體（1）酶切鑒定是必需的，基于下述:A.限制性圖譜個體特異性，不同的載體或DNA分子物理圖譜不同，酶切后片段大小不一樣，電泳圖譜不一樣。

B.同一載體連接不同的DNA片斷，不同的載體連接同一片段(片段上也有位點）酶切圖譜是不同的。

C.插入法(單酶單切點)或替代法(雙酶雙位點)酶切，一般來說用3種限制酶切：①可鑒定載體及②插入片段的大小,方向,切后并電泳分析,以確定是否得到預期的rDNA。當前第85頁\共有116頁\編于星期四\21點（2）若構建DNA重組體是為了克隆某個基因，可進行在序列測定。（3）若構建表達載體，可進行表達產(chǎn)物鑒定。當前第86頁\共有116頁\編于星期四\21點

藍-白篩選（α互補）

許多載體（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和氨基端145個氨基酸的編碼信息。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點。這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細胞。宿主和載體編碼的片段各自均無酶活性，但它們可以互補形成具有酶學活性的蛋白質。這種現(xiàn)象稱為α互補。

當前第87頁\共有116頁\編于星期四\21點

α互補的檢測當前第88頁\共有116頁\編于星期四\21點α-互補藍白篩選當前第89頁\共有116頁\編于星期四\21點原位雜交當前第90頁\共有116頁\編于星期四\21點當前第91頁\共有116頁\編于星期四\21點實驗十二DNA的連接與轉化

1.ＤＮＡ分子的體外連接2．ＤＮＡ的轉化及轉化子的篩選當前第92頁\共有116頁\編于星期四\21點一．實驗目的及背景

當我們已經(jīng)獲得目的基因片段，選擇好適當?shù)目寺。ɑ虮磉_，轉化）質粒載體，并確定重組方案后，下面要進行的就是ＤＮＡ片段之間的體外連接，從而獲得重組子。此重組子可轉入相應的宿主菌中用于對目的基因的擴增以及目的基因表達（如現(xiàn)代基因工程藥物的生產(chǎn)），還可用于序列分析和轉基因等重要生物技術的研究中。當前第93頁\共有116頁\編于星期四\21點1、ＤＮＡ分子的體外連接

ＤＮＡ分子的體外連接就是在一定條件下，由ＤＮＡ連接酶催化兩個雙鏈ＤＮＡ片段組鄰的５’端磷酸與３’端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學過程，ＤＮＡ分子的連接是在酶切反應獲得同種酶互補序列基礎上進行的。當前第94頁\共有116頁\編于星期四\21點連接反應中值得注意的幾個問題：1.ＤＮＡ連接酶常用的ＤＮＡ連接酶有兩種：

(1)來自大腸桿菌的ＤＮＡ連接酶

(2)來自噬菌體的Ｔ４ＤＮＡ連接酶。二者的作用機理類似。當前第95頁\共有116頁\編于星期四\21點Ｔ４ＤＮＡ連接酶作用機制Ｔ４連接酶作用分三步：１．Ｔ４ＤＮＡ連接酶與輔助因子ＡＴＰ形成酶－ＡＭＰ復合物。２．酶－ＡＭＰ復合物結合到具有５’－磷酸基和３’－羥基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ腺苷化。３．產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來.當前第96頁\共有116頁\編于星期四\21點2.連接反應的溫度ＤＮＡ連接酶的最適反應溫度為３７℃，但在此溫度下，粘性末端的氫鍵結合很不穩(wěn)定，折衷方法是１２℃過夜。當前第97頁\共有116頁\編于星期四\21點3.DNA的平未端和粘性末端由于內切酶產(chǎn)生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而連接反應中就有平未端連接和粘性末端連接。二者連接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物濃度，酶濃度選擇上是有差異的，當前第98頁\共有116頁\編于星期四\21點4.堿性磷酸酶處理質粒載體為了提高連接效率，一般采取提高ＤＮＡ的濃度，增加重組子比例。這樣就會出現(xiàn)ＤＮＡ自生連接問題，為此通常選擇對質粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其５’末端的磷酸基，防止環(huán)化，通過接反應后形成的缺口可在轉化細胞后得以修復。見下圖。當前第99頁\共有116頁\編于星期四\21點5.連接反應的檢測連接反應成功與否，最后的檢測要通過下一步實驗，轉化宿主菌，陽性克隆的篩選來確定。我們下面的實驗從粘性末端為例操作。當前第100頁\共有116頁\編于星期四\21點2．ＤＮＡ的轉化及轉化子的篩選

一．實驗目的及背景體外通過基因工程手段所構建的含目的基因的重組質粒，選用轉化和篩選技術，可獲得含重組的陽性克隆。在此陽性克隆中，ＤＮＡ可在生物體系中大量擴增，繁殖，保存以及表達目的基因的產(chǎn)物，這是ＰＣＲ體外擴增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮＡ重組技術，所獲得的，不同目的需要的陽性菌株已廣泛應用于科研，醫(yī)藥生產(chǎn)和生物發(fā)酵等領域。當前第101頁\共有116頁\編于星期四\21點１．抗生素篩選法菌株為某種抗生缺陷型，而質粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素，卡拉霉素等）這樣只有轉化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。本實驗利用抗生篩選轉化子。當前第102頁\共有116頁\編于星期四\21點２互補法現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含有一個大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的調控序列和頭１４６個氨基酸偏碼區(qū)。這個偏碼區(qū)中插入一個多克隆位點。受體菌則含編碼β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。當外源基因插入時，二者溶為一體后，有β－半乳糖苷酶表達，在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培養(yǎng)基中形成蘭色菌落。而當有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入失活，而使lacZ基因不表達而形成白色菌斑。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。當前第103頁\共有116頁\編于星期四\21點脂質體轉染實驗與熒光素酶活性檢測當前第104頁\共有116頁\編于星期四\21點目的了解轉染過程。學習熒光素酶報告基因的原理、檢測方法。當前第105頁\共有116頁\編于星期四\21點報告基因是一種編碼某種易于檢測蛋白質的基因，通過它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調控。該技術的主要優(yōu)點是高靈敏度、可信性及檢測方便且適合大規(guī)模檢測。當前第106頁\共有116頁\編于星期四\21點什么是報告基因？所謂的報告基因（reportergene）,是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。該基因的表達與插入基因的表達有關。該技術的主要優(yōu)點是高靈敏度、可信性及檢測方便且適合大規(guī)模檢測。當前第107頁\共有116頁\編于星期四\21點理想的報告基因內源性低細胞內其它的基因產(chǎn)物不會干擾報告基因的檢測報告基因編碼產(chǎn)物的檢測應該快速、簡便、靈敏度高并且重復性好Reporter當前第108頁\共有116頁\編于星期四\21點熒光素酶報告基因載體常用的螢光素酶報告基因載體：螢火蟲螢光素酶報告基因載體海腎螢光素酶報告基因載體

pGL2,pGL3,pGL4螢火蟲熒光素酶報告基因：螢火蟲luc以其高度的靈敏性和很寬的線性范圍而成為哺乳動物細胞中使用最多的報告基因。本次所用載體：promega公司的pGL3-promoter

所用質粒：pGL3-promoter-E