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文檔簡介
液相色譜柱的選擇和方法開發(fā)
奧秘科技/AUMITechnologies(US)
內(nèi)容概要
?色譜基本概念回顧
?色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)
色譜基本概念回顧
色譜(chromatography)
?色譜原理
?色譜分類:氣相/液相和高效液相(HPLC);反相/正相/離子交換/HILIC/混合固定相
?色譜功能:分析(種類/定量),純化
?液相色譜儀器結(jié)構(gòu)及功能:泵,脫氣機,混合器,進樣器(閥),色譜柱,柱溫箱,檢測器(流通池)
分離度
)1()1()4(?????kkaaNRs?Rs-Resolution?N–TheoreticalPlateNumber?α–Selectivity?k–RetentionFactor?拖尾
1.SeparationofCompoundsAandB靈敏度
?LOD:LimitofDetection?LOQ:LimitofQuantification
-
柱效
-峰形(拖尾因子)
重現(xiàn)性
?分離度(R)
-保留時間(V,T,K)
-選擇性(
α)
-柱效
(N)
?靈敏度
色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)
色譜柱與色譜條件對色譜性能的影響
?分離度《
-選擇性
〈
鍵合類型,基質(zhì)表面特性;流動相、溫度
-柱效
〈
保留體積,粒徑,柱長,基質(zhì)表面特性;流動相,
溫度,上樣量,流速
?峰對稱性《
基質(zhì)表面特性,鍵合類型,流動相,溫度
?保留體積《
柱長,孔隙率,比表面積,基質(zhì)表面特性,鍵合類型;流動相,溫度
?靈敏度《
粒徑,基質(zhì)表面特性,鍵合類型;流動相,溫度
?穩(wěn)定性和重現(xiàn)性《
基質(zhì)表面特性,鍵合類型;流動相,溫度
流動相
《pH,緩沖鹽種類,溶劑;
影響色譜柱性能的主要因素
1、
色譜柱的構(gòu)型
?
色譜柱內(nèi)徑
?
色譜柱長度
2、
固定相柱填料
?
粒徑
?
比表面積
?
孔徑
?
孔隙率
?
基質(zhì)表面特性:
-表面活性:硅膠純度、硅羥基的酸性、均勻性和數(shù)量
-耐堿性
?
鍵合類型
-官能團、是否封尾
-鍵合相的保留行為、耐酸性
色譜柱的構(gòu)型對色譜柱性能的影響
色譜柱的構(gòu)型對色譜柱性能的影響:長度和直徑
色譜柱尺寸
對色譜分離的影響:
?短柱(15-100mm)-運行時間短,柱壓低
?長柱(150-250mm)-分辨率高,運行時間長
?窄徑柱(?2.1mm)–
滿足檢測器和樣品量限制
?寬徑柱(3-7.8mm)-載樣量高,抗污染,壽命
制備柱
(內(nèi)徑>10mm)
–
用于純化制備
柱填料對色譜柱性能的影響
柱填料對C18色譜柱性能的影響:粒徑
硅膠粒徑和類型對柱效的影響
d硅膠粒徑和類型對壓力的影響
柱填料對C18色譜柱性能的影響:粒徑II
目前市場主要可供選擇的填料粒徑
?1.7μm,1.8μm,2.2μm-
快速液相色譜柱:匹配快速色譜儀
?
2.7μm-
多孔殼層:在常規(guī)液相色譜儀上實現(xiàn)快速分離(Halo)?3.0μm,3.5μm-
普通快速分析
?5.0μm-
常規(guī)分析
顆粒越小,柱效越高,但是耐污染性能下降,柱壓升高.柱填料對C18色譜柱性能的影響:比表面積
?
每克填料的表面積,與粒度,孔徑有關(guān)
?比表面積大,保留增加,載樣量增加,平衡時間增加(梯度洗脫尤為注意)?
根據(jù)需要選擇合適的比表面積
柱填料對C18色譜柱性能的影響:孔徑I
?
多孔材料的95%以上表面在孔內(nèi)部
?
樣品分子直徑小于平均孔徑,才能進入微粒內(nèi)部
?
孔徑至少是樣品流體學直徑的4倍
?
300?孔徑用于:超過50個氨基酸的肽或25個殘基的低聚寡核苷酸
樣品分子直徑小于平均孔徑,才能進入微粒內(nèi)部
柱填料對C18色譜柱性能的影響:孔徑II
由于小孔徑填料比表面積大,小分子的保留值在小孔徑填料通常更大
條件:
C8色譜柱,4.6×150mm,
3.5um,
A溶劑,0.1%TFA水溶液;
B溶劑,0.1%TFA于80%乙腈-
水中;
20min梯度,1030%B;60°C,
1.5ml/min柱填料對C18色譜柱性能的影響:硅膠純度I2.3-二羥基萘
OHOHOHOH2.7-二羥基萘
min01234567mAU010203040VWD1A,Wavelength=230nm(LPF\07091702.D)30084084min0123456mAU01020304050VWD1A,Wavelength=230nm(LPF\07090605.D)Aea2532882275Aea4003992889min01234567mAU0510152025303540VWD1A,Wavelength=230nm(LPF\07091208.D)24503471min0246810mAU510152025VWD1A,Wavelength=230nm(LPF\07091202.D)3944Aea1766865934TF=1.31
BrandW,AQColumn5μm,4.6mm×150mm
BrandZ,C18Column5μm,4.6mm×150mm
VenusilMPC185μm,4.6mm×150mmBrandH,C18Column5μm,4.6mm×150mmmin0123456789mAU010203040VWD1A,Wavelength=230nm(LPF\07091711.D)2899BrandU,C18Column5μm,4.6mm×150mm!
TF=1.42
TF=1.39
TF=1.69
TF=?
流動相:
甲醇:水=65:35流速:
1mL/min溫度:
35℃
檢測波長:
230nm進樣量:
20μL
硅膠純度-金屬含量
硅膠基質(zhì)類型及發(fā)展史
?TypeA:原料來源:水玻璃;高金屬含量,高活性,極性化合物容易形成拖尾和死吸附
?TypeB:原料來源:有機硅烷(四乙氧基硅烷)水解/燒結(jié)/酸洗
?雜化及表面雜化
?整體柱
?殼層柱
柱填料對C18色譜柱性能的影響:硅膠純度II
硅膠純度-金屬含量
d固定相對色譜柱性能的影響:硅羥基的影響
殘余硅羥基的影響
普通硅膠當流動相的pH值大于4.5-5.0時,表面的硅羥基會帶負電荷,堿性化合物拖尾。
解決方法
封尾
雙層表面修飾
表面雜化
固定相對色譜柱性能的影響:殘余硅羥基的影響
封尾
鍵合填料與小硅烷進行后續(xù)反應,如三甲基氯硅烷,反應掉部分殘余硅羥基,以增加表面覆蓋率。
缺點:
不能完全反應(仍有50%的硅羥基未被反應)
在pH<3時,TMS易流失,耐用性,穩(wěn)定性不好
TMS固定相對色譜柱性能的影響:殘余硅羥基的影響
不同長度和體積的鍵合相對表面覆蓋率的影響
固定相對色譜柱性能的影響:殘余硅羥基的影響
SiOSiOSiOSiOSiOSiOHOOOOOOOHOOSiOSiSiOSiOOOOHHOOOSiSiOOOHSiSiSiSiOOOOCH3CH3CH3CH3SiOSiOSiOSiOSiOSiOOOOOOSiOSiOOOSiOSiSiOSiOOOOOOOSiSiOOOSiHHSiOOOCH3CH3CH3SiOOOCH3CH3CH3SiOOOCH3CH3CH3SiOSiOSiOSiOSiOSiOOOOOOOSiOOOSiOSiSiOSiOOOOOOOSiSiOOOSiHHSiSiOHOHOHSiOHOHOHSiOHOHOHSiOSiOSiOSiOSiOSiOOOOOOOOOOSiOSiSiOSiOOOOOOOSiSiOOOSiHHSiSiSiOHOHSiOHOHSiOHOHR-Si(CH3)2-X(CH3)2Si-R(CH3)2Si-R(CH3)2Si-RHydrolysis雙層表面修飾
降低表面硅羥基活性,硅膠表面更加均勻
固定相對色譜柱性能的影響:殘余硅羥基的影響
硅膠雙層表面修飾后
?
新增加表面層硅羥基活性更低-新硅羥基pH=5.2,
普通硅羥基pH約為3.5更對稱的峰型,提高柱效,提高靈敏度
?
硅膠表面更均勻-硅膠微晶形成過程中的不光滑表面被覆蓋
重現(xiàn)性更好
?
表面純度更高-硅膠金屬雜質(zhì)被覆蓋
極性化合物保留和分離更好
鍵性化合物峰形對比
Testconditions:Columndimension:4.6mmx150mmSample:doxepin,nortriptyline,trimipramineamitriptylineMobilephase:Acetonitrile/0.01Msodiumphosphate(pH=6)=70/30Temperature:30oCFlow:1mL/minDetection:UV254nm
BrandAC18(non-endcapped,)C18(non-endcapped,twin-layerASBC18
ZorbaxSBC18
SaponinsExtract
4.6x150mmcolumn,1%formicacid/MeOH=80/20固定相對色譜柱性能的影響:殘余硅羥基的影響
雙層表面修飾
代表產(chǎn)品:
StableBondC18,PolarBondC18,SurfBondC180.01ng/mLPseudoephedrineAUMIBauloStableBondC18,2.1×50mm,5μmBrandAC182.1×50mm,5μmPhenomenexLunaC18,2.0×50mm,5μm固定相對色譜柱性能的影響:鍵合類型
A縱向交聯(lián):保留和選擇不穩(wěn)定
B橫向交聯(lián):寬pH適用
C單體鍵合:重現(xiàn)性好,柱效高
D單體(空間保護):低pH穩(wěn)定
E極性官能團嵌合反相固定相
固定相對色譜柱性能的影響:
基質(zhì)表面特性+鍵合類型
〉反相鍵合相的保留行為
同一廠家相同硅膠基質(zhì)的反相柱:
?
保留值隨含碳量的增加而增加
?
比表面積越大,保留值越大
?
鍵合碳鏈越長,保留越大
C18
C8>C3>C1,長鏈之間差別不大
≈
反相鍵合相的保留行為
不同廠家色譜柱的
保留值,選擇性與峰型
色譜柱:4.6*150mm,流動相:乙腈-0.05M磷酸鉀緩沖液,pH3.2(65:35);流速:1ml/min,
拖尾峰T0(尿嘧啶)
P:吡啶
L:苯酚
N:N,N-二甲基苯胺
B:4-丁基苯甲酸
J:甲苯
固定相對色譜柱性能的影響:
基質(zhì)表面特性+鍵合類型
〉鍵合相的穩(wěn)定性
鍵合相的穩(wěn)定性
?
低pH值,鍵合相流失
?
高pH值,硅膠溶解
影響色譜柱壽命,方法不重現(xiàn)
鍵合類型對鍵合相穩(wěn)定性影響
低pH值,鍵合相流失
鍵合類型對鍵合相穩(wěn)定性影響(II)
空間位阻保護,延緩鍵合相流失
固定相對色譜柱性能的影響:
鍵合硅膠的穩(wěn)定性
高pH值,硅膠基質(zhì)溶解
pH9時,色譜柱的穩(wěn)定性
固定相對色譜柱性能的影響:
鍵合硅膠的穩(wěn)定性
碳雜化,延硅膠緩高pH值水解
雜化顆粒:
WatersXterra表面碳雜化示意圖
pH=12條件下的穩(wěn)定性
min051015202530mAU0510152025303540
2.080
2.320
4.068
6.961
9.775
14.276min051015202530mAU0510152025303540
2.040
2.311
4.337
7.090
9.965
14.2714amines,ACN/1%Ammoniaaqueous=25%:75%,40oC,4.6x150mm,5um
1h200h總結(jié):如何選擇色譜柱和相應的色譜條件
?了解目標化合物的性質(zhì):結(jié)構(gòu)(官能團)、pKa、分子量、濃度范圍、溶解度、極性
?了解色譜柱的性質(zhì)
?粒徑,孔徑,比表面積>保留強度和柱效;抗污染性
?基質(zhì)表面特性,鍵合類型>保留強度,選擇性,柱效,對稱性,靈敏度,穩(wěn)定性和重現(xiàn)性
?選擇相應的色譜條件
色譜柱選擇
(II)
?替代:粒徑,比表面,基質(zhì)表面特性,鍵合類型相似
?新方法開發(fā):
-粒徑:2umvs3umvs5um(分析時間,靈敏度,儀器,價格,壽命)
-內(nèi)徑/柱長:內(nèi)徑3mmvs4.6vs7.8(對分離影響不大,成本);柱長與粒徑相關(guān)
-比表面:200-400(低比表面耐污染,高比表面利于分離)
-孔徑:
在滿足比表面前提下大孔徑較好
-硅膠基質(zhì)表面特性:1)盡可能使用高純硅膠;2)盡可能使用低酸性硅膠;3)當流動相pH>9盡可能使用表面雜化;4)使用多硅羥基殘留,可加強對于極性化合物保留或削弱對
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