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文檔簡介

液相色譜柱的選擇和方法開發(fā)

奧秘科技/AUMITechnologies(US)

內(nèi)容概要

?色譜基本概念回顧

?色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)

色譜基本概念回顧

色譜(chromatography)

?色譜原理

?色譜分類:氣相/液相和高效液相(HPLC);反相/正相/離子交換/HILIC/混合固定相

?色譜功能:分析(種類/定量),純化

?液相色譜儀器結(jié)構(gòu)及功能:泵,脫氣機,混合器,進樣器(閥),色譜柱,柱溫箱,檢測器(流通池)

分離度

)1()1()4(?????kkaaNRs?Rs-Resolution?N–TheoreticalPlateNumber?α–Selectivity?k–RetentionFactor?拖尾

1.SeparationofCompoundsAandB靈敏度

?LOD:LimitofDetection?LOQ:LimitofQuantification

柱效

-峰形(拖尾因子)

重現(xiàn)性

?分離度(R)

-保留時間(V,T,K)

-選擇性(

α)

-柱效

(N)

?靈敏度

色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)

色譜柱與色譜條件對色譜性能的影響

?分離度《

-選擇性

鍵合類型,基質(zhì)表面特性;流動相、溫度

-柱效

保留體積,粒徑,柱長,基質(zhì)表面特性;流動相,

溫度,上樣量,流速

?峰對稱性《

基質(zhì)表面特性,鍵合類型,流動相,溫度

?保留體積《

柱長,孔隙率,比表面積,基質(zhì)表面特性,鍵合類型;流動相,溫度

?靈敏度《

粒徑,基質(zhì)表面特性,鍵合類型;流動相,溫度

?穩(wěn)定性和重現(xiàn)性《

基質(zhì)表面特性,鍵合類型;流動相,溫度

流動相

《pH,緩沖鹽種類,溶劑;

影響色譜柱性能的主要因素

1、

色譜柱的構(gòu)型

?

色譜柱內(nèi)徑

?

色譜柱長度

2、

固定相柱填料

?

粒徑

?

比表面積

?

孔徑

?

孔隙率

?

基質(zhì)表面特性:

-表面活性:硅膠純度、硅羥基的酸性、均勻性和數(shù)量

-耐堿性

?

鍵合類型

-官能團、是否封尾

-鍵合相的保留行為、耐酸性

色譜柱的構(gòu)型對色譜柱性能的影響

色譜柱的構(gòu)型對色譜柱性能的影響:長度和直徑

色譜柱尺寸

對色譜分離的影響:

?短柱(15-100mm)-運行時間短,柱壓低

?長柱(150-250mm)-分辨率高,運行時間長

?窄徑柱(?2.1mm)–

滿足檢測器和樣品量限制

?寬徑柱(3-7.8mm)-載樣量高,抗污染,壽命

制備柱

(內(nèi)徑>10mm)

用于純化制備

柱填料對色譜柱性能的影響

柱填料對C18色譜柱性能的影響:粒徑

硅膠粒徑和類型對柱效的影響

d硅膠粒徑和類型對壓力的影響

柱填料對C18色譜柱性能的影響:粒徑II

目前市場主要可供選擇的填料粒徑

?1.7μm,1.8μm,2.2μm-

快速液相色譜柱:匹配快速色譜儀

?

2.7μm-

多孔殼層:在常規(guī)液相色譜儀上實現(xiàn)快速分離(Halo)?3.0μm,3.5μm-

普通快速分析

?5.0μm-

常規(guī)分析

顆粒越小,柱效越高,但是耐污染性能下降,柱壓升高.柱填料對C18色譜柱性能的影響:比表面積

?

每克填料的表面積,與粒度,孔徑有關(guān)

?比表面積大,保留增加,載樣量增加,平衡時間增加(梯度洗脫尤為注意)?

根據(jù)需要選擇合適的比表面積

柱填料對C18色譜柱性能的影響:孔徑I

?

多孔材料的95%以上表面在孔內(nèi)部

?

樣品分子直徑小于平均孔徑,才能進入微粒內(nèi)部

?

孔徑至少是樣品流體學直徑的4倍

?

300?孔徑用于:超過50個氨基酸的肽或25個殘基的低聚寡核苷酸

樣品分子直徑小于平均孔徑,才能進入微粒內(nèi)部

柱填料對C18色譜柱性能的影響:孔徑II

由于小孔徑填料比表面積大,小分子的保留值在小孔徑填料通常更大

條件:

C8色譜柱,4.6×150mm,

3.5um,

A溶劑,0.1%TFA水溶液;

B溶劑,0.1%TFA于80%乙腈-

水中;

20min梯度,1030%B;60°C,

1.5ml/min柱填料對C18色譜柱性能的影響:硅膠純度I2.3-二羥基萘

OHOHOHOH2.7-二羥基萘

min01234567mAU010203040VWD1A,Wavelength=230nm(LPF\07091702.D)30084084min0123456mAU01020304050VWD1A,Wavelength=230nm(LPF\07090605.D)Aea2532882275Aea4003992889min01234567mAU0510152025303540VWD1A,Wavelength=230nm(LPF\07091208.D)24503471min0246810mAU510152025VWD1A,Wavelength=230nm(LPF\07091202.D)3944Aea1766865934TF=1.31

BrandW,AQColumn5μm,4.6mm×150mm

BrandZ,C18Column5μm,4.6mm×150mm

VenusilMPC185μm,4.6mm×150mmBrandH,C18Column5μm,4.6mm×150mmmin0123456789mAU010203040VWD1A,Wavelength=230nm(LPF\07091711.D)2899BrandU,C18Column5μm,4.6mm×150mm!

TF=1.42

TF=1.39

TF=1.69

TF=?

流動相:

甲醇:水=65:35流速:

1mL/min溫度:

35℃

檢測波長:

230nm進樣量:

20μL

硅膠純度-金屬含量

硅膠基質(zhì)類型及發(fā)展史

?TypeA:原料來源:水玻璃;高金屬含量,高活性,極性化合物容易形成拖尾和死吸附

?TypeB:原料來源:有機硅烷(四乙氧基硅烷)水解/燒結(jié)/酸洗

?雜化及表面雜化

?整體柱

?殼層柱

柱填料對C18色譜柱性能的影響:硅膠純度II

硅膠純度-金屬含量

d固定相對色譜柱性能的影響:硅羥基的影響

殘余硅羥基的影響

普通硅膠當流動相的pH值大于4.5-5.0時,表面的硅羥基會帶負電荷,堿性化合物拖尾。

解決方法

封尾

雙層表面修飾

表面雜化

固定相對色譜柱性能的影響:殘余硅羥基的影響

封尾

鍵合填料與小硅烷進行后續(xù)反應,如三甲基氯硅烷,反應掉部分殘余硅羥基,以增加表面覆蓋率。

缺點:

不能完全反應(仍有50%的硅羥基未被反應)

在pH<3時,TMS易流失,耐用性,穩(wěn)定性不好

TMS固定相對色譜柱性能的影響:殘余硅羥基的影響

不同長度和體積的鍵合相對表面覆蓋率的影響

固定相對色譜柱性能的影響:殘余硅羥基的影響

SiOSiOSiOSiOSiOSiOHOOOOOOOHOOSiOSiSiOSiOOOOHHOOOSiSiOOOHSiSiSiSiOOOOCH3CH3CH3CH3SiOSiOSiOSiOSiOSiOOOOOOSiOSiOOOSiOSiSiOSiOOOOOOOSiSiOOOSiHHSiOOOCH3CH3CH3SiOOOCH3CH3CH3SiOOOCH3CH3CH3SiOSiOSiOSiOSiOSiOOOOOOOSiOOOSiOSiSiOSiOOOOOOOSiSiOOOSiHHSiSiOHOHOHSiOHOHOHSiOHOHOHSiOSiOSiOSiOSiOSiOOOOOOOOOOSiOSiSiOSiOOOOOOOSiSiOOOSiHHSiSiSiOHOHSiOHOHSiOHOHR-Si(CH3)2-X(CH3)2Si-R(CH3)2Si-R(CH3)2Si-RHydrolysis雙層表面修飾

降低表面硅羥基活性,硅膠表面更加均勻

固定相對色譜柱性能的影響:殘余硅羥基的影響

硅膠雙層表面修飾后

?

新增加表面層硅羥基活性更低-新硅羥基pH=5.2,

普通硅羥基pH約為3.5更對稱的峰型,提高柱效,提高靈敏度

?

硅膠表面更均勻-硅膠微晶形成過程中的不光滑表面被覆蓋

重現(xiàn)性更好

?

表面純度更高-硅膠金屬雜質(zhì)被覆蓋

極性化合物保留和分離更好

鍵性化合物峰形對比

Testconditions:Columndimension:4.6mmx150mmSample:doxepin,nortriptyline,trimipramineamitriptylineMobilephase:Acetonitrile/0.01Msodiumphosphate(pH=6)=70/30Temperature:30oCFlow:1mL/minDetection:UV254nm

BrandAC18(non-endcapped,)C18(non-endcapped,twin-layerASBC18

ZorbaxSBC18

SaponinsExtract

4.6x150mmcolumn,1%formicacid/MeOH=80/20固定相對色譜柱性能的影響:殘余硅羥基的影響

雙層表面修飾

代表產(chǎn)品:

StableBondC18,PolarBondC18,SurfBondC180.01ng/mLPseudoephedrineAUMIBauloStableBondC18,2.1×50mm,5μmBrandAC182.1×50mm,5μmPhenomenexLunaC18,2.0×50mm,5μm固定相對色譜柱性能的影響:鍵合類型

A縱向交聯(lián):保留和選擇不穩(wěn)定

B橫向交聯(lián):寬pH適用

C單體鍵合:重現(xiàn)性好,柱效高

D單體(空間保護):低pH穩(wěn)定

E極性官能團嵌合反相固定相

固定相對色譜柱性能的影響:

基質(zhì)表面特性+鍵合類型

〉反相鍵合相的保留行為

同一廠家相同硅膠基質(zhì)的反相柱:

?

保留值隨含碳量的增加而增加

?

比表面積越大,保留值越大

?

鍵合碳鏈越長,保留越大

C18

C8>C3>C1,長鏈之間差別不大

反相鍵合相的保留行為

不同廠家色譜柱的

保留值,選擇性與峰型

色譜柱:4.6*150mm,流動相:乙腈-0.05M磷酸鉀緩沖液,pH3.2(65:35);流速:1ml/min,

拖尾峰T0(尿嘧啶)

P:吡啶

L:苯酚

N:N,N-二甲基苯胺

B:4-丁基苯甲酸

J:甲苯

固定相對色譜柱性能的影響:

基質(zhì)表面特性+鍵合類型

〉鍵合相的穩(wěn)定性

鍵合相的穩(wěn)定性

?

低pH值,鍵合相流失

?

高pH值,硅膠溶解

影響色譜柱壽命,方法不重現(xiàn)

鍵合類型對鍵合相穩(wěn)定性影響

低pH值,鍵合相流失

鍵合類型對鍵合相穩(wěn)定性影響(II)

空間位阻保護,延緩鍵合相流失

固定相對色譜柱性能的影響:

鍵合硅膠的穩(wěn)定性

高pH值,硅膠基質(zhì)溶解

pH9時,色譜柱的穩(wěn)定性

固定相對色譜柱性能的影響:

鍵合硅膠的穩(wěn)定性

碳雜化,延硅膠緩高pH值水解

雜化顆粒:

WatersXterra表面碳雜化示意圖

pH=12條件下的穩(wěn)定性

min051015202530mAU0510152025303540

2.080

2.320

4.068

6.961

9.775

14.276min051015202530mAU0510152025303540

2.040

2.311

4.337

7.090

9.965

14.2714amines,ACN/1%Ammoniaaqueous=25%:75%,40oC,4.6x150mm,5um

1h200h總結(jié):如何選擇色譜柱和相應的色譜條件

?了解目標化合物的性質(zhì):結(jié)構(gòu)(官能團)、pKa、分子量、濃度范圍、溶解度、極性

?了解色譜柱的性質(zhì)

?粒徑,孔徑,比表面積>保留強度和柱效;抗污染性

?基質(zhì)表面特性,鍵合類型>保留強度,選擇性,柱效,對稱性,靈敏度,穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

?選擇相應的色譜條件

色譜柱選擇

(II)

?替代:粒徑,比表面,基質(zhì)表面特性,鍵合類型相似

?新方法開發(fā):

-粒徑:2umvs3umvs5um(分析時間,靈敏度,儀器,價格,壽命)

-內(nèi)徑/柱長:內(nèi)徑3mmvs4.6vs7.8(對分離影響不大,成本);柱長與粒徑相關(guān)

-比表面:200-400(低比表面耐污染,高比表面利于分離)

-孔徑:

在滿足比表面前提下大孔徑較好

-硅膠基質(zhì)表面特性:1)盡可能使用高純硅膠;2)盡可能使用低酸性硅膠;3)當流動相pH>9盡可能使用表面雜化;4)使用多硅羥基殘留,可加強對于極性化合物保留或削弱對

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