細胞培養(yǎng)中的細節(jié)問題

細胞培養(yǎng)中的細節(jié)問題第一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一4.工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少ClassII)。操作過程中，應避免引起aerosol之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5.定期檢測下列項目：

5.1.CO2鋼瓶之CO2壓力

5.2.CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。

5.3.無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預濾網(wǎng)(300小時/預濾網(wǎng)，3000小時/HEPA)。

6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750)，定期更換水槽的水。第二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)篇-實驗用品1.種類︰

1.1.細胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteurpipet外，其它均為塑料無菌制品。

1.2.TC級培養(yǎng)盤表面均有coating高分子物質(zhì)以讓細胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask，plates,dishes,rollerbottle等，依實驗需要使用。

1.3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml

1.4.塑料離心管:15ml,50ml，均有2種不同材質(zhì)，其中polypropylene(PP)為不透明材質(zhì)，polystyrene(PS)為透明材質(zhì)，可依實驗需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。

1.5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。

1.6.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,500ml,1000ml

第三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2.清洗︰

2.1.新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05NHCl浸泡數(shù)小時，洗凈后才開始使用。

2.2.用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。

3.滅菌︰

3.1.實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃,15lb,20分鐘，置于oven中烘干。

3.2.實驗用玻璃pasteurpipet以干熱滅菌170℃,4小時。

3.3.液體或是固體廢棄物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高壓滅菌121℃,15lb,20分鐘處理。第四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)篇-培養(yǎng)基1.液體培養(yǎng)基貯存于4℃冰箱，避免光照，實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。

2.液體培養(yǎng)基(加血清)存放期為六個月，期間glutamine可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。

3.粉末培養(yǎng)基配制(以1升為例)：

3.1.細胞培養(yǎng)基通常須添加10%血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900ml，pH為7.2-7.4。NaHCO3為另外添加，若將NaHCO3粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應分別溶解后才混合，然后用CO2氣體調(diào)整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH)，因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH易發(fā)生改變。

第五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一3.2.材料：

純水(milli-Q水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要)，粉末培養(yǎng)基，NaHCO3，電磁攪拌器無菌血清瓶，0.1或0.2mm無菌過濾膜，pH計，真空泵，CO2氣體

3.3.步驟：

3.3.1.取粉末培養(yǎng)基溶于700mlmilli-Q水中，攪拌使其溶解。

3.3.2.稱取適量之NaHCO3粉末溶于200mlmilli-Q水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2氣體至飽和，約3-5分鐘。

3.3.3.將溶解且含飽和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合?；旌笕芤褐畃H應為7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入CO2氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時，pH會升高0.1-0.2。

3.3.4.以0.1或0.2mm無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4℃。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)

3.3.5.配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。第六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一附-配制培養(yǎng)基之生長測試材料：

MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)

6-wellTCplate(or35mmTCdish)

methanol

glacialaceticacid

10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)步驟：

1.以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCKcell，接種MDCK細胞于6-wellplate(或35mmTCdish)中，每個well接種1×102活細胞，同時作對照組實驗。

2.接種5～7天后，在100倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。

3.去除培養(yǎng)基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇：冰醋酸﹦3:1)，室溫下靜置10min。

4.去除固定液，水洗二次。

5.加入1ml10%Giemsasolution，，室溫下靜置染色2-3min。

6.去除染液，水洗二次。

7.以肉眼計數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細胞生長不佳，則丟棄之。第七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)篇-抗生素1.細胞庫之細胞培養(yǎng)基不加抗生素

1.1.培養(yǎng)自ATCC引進之細胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。

1.2.培養(yǎng)自其它實驗室引進之細胞株，制作tokenfreeze前培養(yǎng)基須添加抗生素，待tokenfreeze通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素。

2.寄送活細胞時，須將培養(yǎng)液充滿整個flask時，則須添加抗生素(penicillin100units/ml+streptomycin100ug/ml)。

3.若要檢測mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin會抑制mycoplasma生長。

第八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一4.去除細菌污染之抗生素混合配方:penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin250ug/ml,bacitracin2.5units/ml，注意混合使用后藥物毒性會增強。

5.抗生素使用種類與濃度：

工作濃度.儲存溫度.殺滅細菌

penicillin100units/ml-20℃G(+)bacteria

streptomycin100ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria

chlotetracycline50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria

gentamicin50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria,mycoplasma

amphotericinB2.5ug/ml-20℃yeastandmolds

nystatin50ug/ml-20℃yeastandmolds

fungizone2.5ug/ml-20℃yeastandmolds第九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)篇-血清1.血清必須貯存于–20～-70℃，若存放于4℃，請勿超過一個月。如果一次無法用完一瓶，可將40～45ml分裝于無菌50ml離心管中，由于血清結(jié)凍時體積會增加約10%，必須預留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。

2.一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。

3.瓶裝(500ml)血清解凍步驟(逐步解凍法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。

第十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一4.heat-inactivation是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份(complement)去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為會造成沈淀物之顯著增多，且會影響血清之品質(zhì)。補體參與之反應有：cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsandplatelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecelltype。

5.勿將血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。

第十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一6.血清之沈淀物

6.1.凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin)造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000rpm,5min去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因為會阻塞過濾膜。

6.2.顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沈淀物的形成會顯著的增多。有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認為血清遭受污染，而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37℃環(huán)境下，又會使此沈淀物增多，更會誤認為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點應不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應立即停用，更換另一批號的血清。第十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一附-血清之生長測試材料：

MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)

a-MEM(alphamodifiedminimalessentialmedium,GibcoBRL12000-022)

6-wellTCplate(or35mmTCdish)

methanol

glacialaceticacid

10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)

步驟：

1.以a-MEMwith10%FBS(已測試過)培養(yǎng)MDCK細胞于T75flask至80%confluency。

2.以trypsin-EDTA處理細胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM制成細胞懸浮液，并測細胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM稀釋細胞濃度為1×102活細胞數(shù)/ml。

3.將1ml細胞懸浮液接種入6-wellplate中，并另加入1ml含不同濃度的血清(20%,10%,4%,2%,1%,0.4%)之a(chǎn)-MEM，使血清最終濃度為10%,5%,2%,1%,0.5%,0.2%。用已測試過之血清同時進行對照組試驗。

第十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一4.37oC，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。

5.去除培養(yǎng)基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇:冰醋酸﹦3:1)，室溫下靜置10min。

6.去除固定液，水洗二次。

7.加入1ml10%Giemsasolution，，室溫下靜置染色2-3min。

8.去除染液，水洗二次。

9.以肉眼計數(shù)群落數(shù)

10.計算SPE(SerumPlatingEfficiency)：

SPE=(no.ofcolonies/well)/100x100%

11.計算RPE(RelativePlatingEfficiency)：

SPE=[totalcoloniesofsixwell(test)/Totalcoloniesofsixwell(control)]x100%

比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測血清對細胞生長的影響。訂購多量同一批號的優(yōu)良血清，置于–70℃保存之第十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)篇-細胞傳代培養(yǎng)1.細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3至1:6，依細胞種類而異。

2.材料：

2.1.無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,

GibcoBRL21600-010)

2.2.trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：

以10ml分裝于15ml無菌離心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回溫。

2.3.新鮮培養(yǎng)基

2.4.無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶

3.步驟：

3.1.附著型胞(adherentcell)

3.1.1.吸掉舊培養(yǎng)液。

3.1.2.用D-PBS洗滌細胞一至二次。

第十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一3.1.3.加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，離心后再吸掉上清液。)

3.1.4.輕拍培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

第十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一3.2.懸浮型細胞(suspensioncell)

3.2.1.吸出細胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000rpm5分鐘。

3.2.2.吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

3.3.融合瘤(hybridoma)

3.3.1.有些hybridomacell需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。第十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)篇-細胞冷凍保存（一）1.注意事項：

1.1.欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度。

1.2.冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。

1.3.注意冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22micronFGLPTelflon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如SigmaD-2650)，以5~10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。1.4.冷凍保存之細胞濃度：

第十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一1.4.1.normalhumanfibroblast:1~3x106cells/ml

1.4.2.hybridoma:1~3x106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死去。

1.4.3.adherenttumorlines:5~7x106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1-3x106cells/ml。

1.4.4.othersuspensions:5~10x106cells/ml,humanlymphocyte須至少5x106cells/ml。

1.5.冷凍保護劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backupculture，以防止冷凍失敗。1.6.冷凍方法：

1.6.1.傳統(tǒng)方法:4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16-18小時(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存。

1.6.2.程序降溫：利用等速降溫機以–1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至–120℃，放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。第十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)篇-細胞冷凍保存（二）2.材料：

2.1.生長良好之培養(yǎng)細胞

2.2.新鮮培養(yǎng)基

2.3.DMSO(SigmaD-2650)

2.4.無菌塑料冷凍保存管(Nalgene5000-0020)

2.5.0.4％w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)

2.6.血球計數(shù)盤與蓋玻片

2.7.等速降溫機(KRYO10SeriesII)

第二十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一3.步驟：

3.1.冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細胞生長情形。

3.2.配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10％，混合均勻，置于室溫下待用。

3.3.依細胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。

3.4.離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5x106cells/ml，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。

3.5.冷凍保存方法1:冷凍管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16～18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。

3.6.冷凍保存方法2:冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機中，再放入液氮槽中。程序為:program7:HBCELL第二十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)篇-冷凍細胞活化1.冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。

2.細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。

3.材料

37℃恒溫水，新鮮培養(yǎng)基，無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶，液氮或干冰容器

第二十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一4.步驟：

4.1操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。

4.2自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。

4.3將新鮮培養(yǎng)基置于37°C水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。

4.4取出冷凍管，立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以70%ethanol擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

4.5取出0.9ml解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例1:10～1:15)，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1ml解凍細胞懸浮液作存活測試。

4.6解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO或glycerol)，依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000rpm,5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

4.7若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。第二十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)篇-收到細胞的處理方式(一)1.收到細胞株包裹時，請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于–70°C，隔夜后，移到液氮)。

2.冷凍細胞解凍程序:

2.1.依據(jù)細胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細胞均無法立即適應不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類，若因?qū)嶒炐枰?，必須有所不同時，務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細胞適應后，方進行所需之實驗。

2.2.FBS(fetalbovineserum,胚牛血清),CS(calfserum,小牛血清)和HS(horseserum,馬血清)，對細胞而言差異極大，請務(wù)必依據(jù)細胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。

第二十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2.3.將培養(yǎng)基置于37°C水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。取出冷凍管，立即放入37°C水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿，否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化后，以70%ethanol擦拭冷凍管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

2.4.依據(jù)細胞種類和濃度，于無菌操作臺內(nèi)取10ml培養(yǎng)基加至T25或T75flask中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T25或T75flask內(nèi)之培養(yǎng)基，混合均勻，放入37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.5.對絕大多數(shù)細胞而言，1%以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除，待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數(shù)因?qū)MSO敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO者，則可將解凍后之細胞懸浮液放入5-10ml培養(yǎng)基中，離心300xg(約1000rpm)，5分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細胞均勻混合后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再放入37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第二十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)篇-收到細胞的處理方式(二)收到T25flask細胞時，處理方式為︰

1.于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25flask均加滿培養(yǎng)基。請檢查flask外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任何問題，不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。

2.將原封之T25flask靜置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中，使細胞回溫至37°C，并讓運送過程中少數(shù)脫落的細胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml培養(yǎng)基于flask內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細胞置入培養(yǎng)箱中，或細胞已長滿盤，則將細胞做傳代培養(yǎng)。第二十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一附-細胞計數(shù)與存活測試（一）1.原理：

1.1.計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。

1.2.血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目。

1.3.存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypanblue染料，如果細胞不易吸收trypanblue，則用紅色之Erythrosinbluish。

第二十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一附-細胞計數(shù)與存活測試（二）2.材料：

0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)

Erythosinbluishstain

取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethyl

paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline

血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip)，計數(shù)器(counter)，低倍倒立顯微鏡

粒子計數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)

3.步驟：

3.1.取50ml細胞懸浮液與50mltrypanblue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。

3.2.取少許混合液(約15ml)自血球計數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosinbluish)。

3.3.計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，最后乘以104，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。

4大格*細胞總數(shù)x2x104/4=細胞數(shù)/ml

*每一大格的體積=0.1cmx0.1cmx0.01cm=10-4ml

第二十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一3.4.若不用血球計數(shù)盤，可用Coultercounter作自動計數(shù)，惟無法辨別死細胞或活細胞。

3.5.范例：

T75monolayerculture制成10ml細胞懸浮液，取0.1ml溶液與0.1mltrypanblue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)之細胞數(shù)目。

活細胞數(shù)/方格：55,62,49,59

死細胞數(shù)/方格：5,3,4,6

細胞總數(shù)=243

平均細胞數(shù)/方格=60.75

稀釋倍數(shù)=2

細胞數(shù)/ml：60.75x104x2=1.22x106

細胞數(shù)/flask：1.22x106x10ml=12.2x106

存活率：225/243﹦92.6%第二十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一升級篇-細胞培養(yǎng)11冷凍管應如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。2細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應馬上去除DMSO？

除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。第三十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一3可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活。4可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？

不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。第三十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一升級篇-細胞培養(yǎng)25何謂FBS,FCS,CS,HS?

FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS(calfserum)則是指小牛血清。HS(horseserum)則是指馬血清。6培養(yǎng)細胞時應使用5%或10%CO2？或根本沒有影響？

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時，細胞培養(yǎng)時應使用10%CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應使用5%CO2培養(yǎng)細胞。第三十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一7何時須更換培養(yǎng)基？

視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。

8培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。9附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA濃度？應如何處理？

一般使用之trypsin-EDTA濃度為0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20°C，避免反復冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會。10懸浮性細胞應如何繼代處理？

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。第三十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一升級篇-細胞培養(yǎng)311欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動物細胞，其離心速率一般為300xg(約1,000rpm)，5-10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細胞死亡。12細胞之接種密度為何？依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。13細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。第三十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一14DMSO之等級和無菌過濾之方式為何？

冷凍保存使用之DMSO等級，必須為Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650)，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于4°C，避免反復冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO之Nylon材質(zhì)濾膜。15冷凍保存細胞之方法？

冷凍保存方法一:冷凍管置于4°C30~60分鐘→(-20°C30分鐘*)→-80°C16~18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。

冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3°C至–80°C以下，再放入液氮槽vaporphase長期儲存。*-20°C不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。第三十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一升級篇-細胞培養(yǎng)416細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度？

冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106cells/mlvial，融合瘤細胞則以5x106cells/mlvial為宜。17應如何避免細胞污染？細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。18如果細胞發(fā)生微生物污染時，應如何處理？

加入相應抗生素。直接滅菌后丟棄之。19支原體(mycoplasma)污染的細胞，是否能以肉眼觀察出異狀？

第三十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。20支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？

支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之數(shù)據(jù)方有意義。21偵測出細胞株有支原體污染時，該如何處理？

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。22CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？

定期(至少每兩周一次)以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。第三十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一升級篇-細胞培養(yǎng)523為何培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾之CO2，以調(diào)整pH值。24各種細胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？

不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。第三十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一25購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？

研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。26購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80°C太久。27收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊第三十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一升級篇-細胞培養(yǎng)628如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長?？傊?，首選MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)最好首選AIMV（12005）培養(yǎng)基（SFM）。

29L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

第四十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一30GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

31什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。第四十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一升級篇-細胞培養(yǎng)732培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

34二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。第四十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一33目錄上說，Hank‘s平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank’s平衡鹽溶液(HBS)和Earle‘s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？

HBS和EBS的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2