酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其產物的金屬離子螯合能力

酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其產物的金屬離子螯合能力李丹;趙新淮【摘要】利用谷氨酰胺酶(EC3.5.1.2)對酪蛋白進行限制性脫酰胺和水解處理，以SDS及排阻色譜分析評價產物的蛋白質降解情況，并制備具有較低脫酰胺度的脫酰胺酪蛋白產物.在酪蛋白質量濃度為5%、谷氨酰胺酶添加量400U/kg酪蛋白、37^的條件下分別反應6h、12h和24h,制得脫酰胺度分別為2.8%、5.8%和8.5%,水解度分別為2.5%、3.4%和4.9%的脫酰胺酪蛋白.評價這3種脫酰胺酪蛋白產物對Fe2+和Ca2+的螯合能力，結果表明,脫酰胺酪蛋白產物對Fe2+和Ca2+的螯合能力高于酪蛋白，并隨著脫酰胺度的增加而提高.【期刊名稱】《食品與發(fā)酵工業(yè)》【年(卷)，期】2010(036)011【總頁數(shù)】5頁(P21-25)【關鍵詞】谷氨酰胺酶;酪蛋白;脫酰胺;螯合能力;鐵;鈣【作者】李丹;趙新淮【作者單位】東北農業(yè)大學，乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱,150030;東北農業(yè)大學，乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱,150030【正文語種】中文食品蛋白質經過特定的修飾會改變其相應性質，如酶法水解既能獲得具有生物活性的肽［1］，又可提高食品蛋白質的功能性質［2］。酶處理方法的反應條件相對溫和，一般不會導致有毒物質的產生。食品蛋白質經過脫酰胺作用后，能夠改善一些功能性質，因此具有潛在的食品加工應用價值［3］。例如，燕麥分離蛋白經脫酰胺處理后溶解性、乳化性等功能性質均有顯著增強［4］。對小麥蛋白進行脫酰胺作用，結果表明，中性pH條件下脫酰胺小麥蛋白的溶解性及乳化性質有顯著的提高［5］。另外，蛋白質水解產物對一些礦物質元素（如Fe2+和Ca2+）有較好的螯合作用，可以作為配體來提高礦物質的溶解性，提高礦物質的生物利用率［6］。Kumagai等［7］發(fā)現(xiàn)，去肌醇六磷酸大豆球蛋白經脫酰胺后對Ca2+的螯合能力，相比大豆球蛋白以及去肌醇六磷酸大豆球蛋白對Ca2+的螯合能力都有所增強。研究還發(fā)現(xiàn)，即使經消化酶作用后，去肌醇六磷酸脫酰胺大豆球蛋白仍具有較高的Ca2+螯合能力，并且脫酰胺大豆球蛋白及其水解產物顯著提高小腸對Ca2+的吸收利用率［8］。本研究利用谷氨酰胺酶（EC3.5.1.2）對酪蛋白進行限制性脫酰胺，得到較低脫酰胺度或水解度的脫酰胺產物，并對其Fe2+和Ca2+螯合能力進行評價和比較。酪蛋白（蛋白質含量93.8%）、3-（2-毗啶基）-5,6-雙（4-苯磺酸）-1,2,4-三嗪（ferrozine）、谷氨酰胺酶（EC3.5.1.2），均購自Sigma公司;標準蛋白Marker,購自索萊寶科技有限公司;其他試劑均為分析純試劑。UV-2401PC紫外-可見分光光度計，日本島津公司；KjeltecTM3200全自動凱式定氮儀，瑞士Foss公司;UVP/C8484-05G凝膠成像分析系統(tǒng)，美國UVP公司;AKTA100蛋白純化儀，美國GEAmersham公司;AA-800原子吸收分光光度計，美國PerkinElmer公司。配制質量濃度為10%酪蛋白溶液，并用0.2mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH至7.0。配制0.01g/mL谷氨酰胺酶溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），將一定量的酪蛋白溶液與超純水、不同體積的谷氨酰胺酶溶液混合，配制成酪蛋白質量濃度為5%、酶添加量分別為100、400、700U/kg酪蛋白的反應體系。反應體系在37^下酶解6-36h,按照以下方法分別測定產物的脫酰胺度及水解度。以未加谷氨酰胺酶溶液的酪蛋白溶液為空白。1.3.2.1蛋白質含量、脫酰胺度以及水解度的測定蛋白質含量:凱氏定氮法［9］。脫酰胺度測定:苯酚-次氯酸鹽法［10］。反應結束后，取反應液2mL置于離心管中，并立即加入2mL質量分數(shù)為12%的三氯乙酸終止反應，12000r/min離心10min除去沉淀，上清液待測。試劑氏分取5.0g苯酚、25mg亞硝基鐵氰化鈉，溶于雙蒸水中，定容至500mL。試劑B:取2.5gNaOH溶于雙蒸水中，加入4.2mL的質量濃度為6.5%的次氯酸鈉溶液，定容至500mL。試劑A和試劑B均置于棕色試劑瓶中，4°C冰箱中儲存?zhèn)溆?。移?.0mL試劑A于試管中，加入20pL樣品溶液(或20pL雙蒸水)，充分振蕩、混勻。移取5.0mL試劑B加入到上述混合溶液中，充分振蕩、混勻°37C水浴中反應20min，冷卻至室溫，并在625nm波長測定溶液吸光值a(或b)。以硫酸銨標準溶液(0.2~1凹/時)繪制標準曲線;根據(jù)所得差值(ab)和標準曲線，計算樣品中游離氨濃度。稱取一定量的酪蛋白，置入水解管，然后加入5mL終濃度為3mol/L的H2SO4,用酒精噴燈密封水解管，110C下水解24h。水解完畢后，將水解液中和至中性并稀釋一定倍數(shù)后，按上述方法，在625nm波長測定水解液稀釋液的吸光值。根據(jù)標準曲線，計算出酪蛋白中谷氨酰胺和天冬酰胺殘基總量。脫酰胺度計算公式如式(1)：⑶蛋白質水解度的測定:鄰苯二甲醛(OPA)法［11］。OPA試劑:取2.00g十二烷基磺酸鈉(SDS),加入一定量硼酸緩沖溶液(pH9.5),待完全溶解后，加入1mL80mg/mL的OPA乙醇溶液、200"片蔬基乙醇，最后用硼酸緩沖溶液定容至100mL。此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。將樣品溶液稀釋至一定倍數(shù)后，取3mL樣品稀釋液與同體積OPA試劑混合并開始計時，準確反應5min，立即在分光光度計上340nm波長處測吸光值。以亮氨酸標準溶液（12~36pg/mL）繪制標準曲線，利用標準曲線計算樣品中游離氨基濃度（pmol/mL）。水解度計算公式如式（2）:1.3.2.2SDS分析采用不連續(xù)垂直板狀凝膠電泳，濃縮膠濃度為4%、分離膠濃度為15%。濃縮膠和分離膠配此組成見表1［12］。凝膠板面積120mmx100mm，凝膠厚度1.5mm，上樣量10"。電泳時初始電壓80V，待樣品進入分離膠時電壓增至120V;當漠酚藍指示劑遷移到凝膠板底部時，停止電泳。剝離凝膠，加入戊二醛固定液固定1h。取出固定好的凝膠在染色液（含0.25%考馬斯亮藍R250、45%甲醇、10%乙酸）中染色3-5h,棄去染色液，加入脫色液［V（甲醇）：V（冰乙酸）:V（水）=2:2:9］，經常更換脫色液，直至凝膠的藍色背景褪去，蛋白質色帶清晰為止。然后于凝膠成像系統(tǒng)中對各條帶進行分析。1.3.2.3排阻色譜分析采用Chu等人［13］的方法，略有改動。將酪蛋白以及脫酰胺酪蛋白產物溶于0.2mol/L、pH值12的磷酸鹽緩沖溶液中，終濃度為2mg/mL;洗脫劑為0.2mol/L、pH值12的磷酸鹽緩沖溶液。樣品溶液和洗脫劑通過0.45頃微孔濾膜過濾，并用超聲波脫氣。利用美國GEAmersham公司AKTA蛋白純化儀進行測定。柱子型號為10mmx300mm、填料為PharmaciaSuperdex-75凝膠。上樣量為0.5mL，壓力1.80MPa，洗脫速度0.5mL/min。蛋白質檢測波長280nm。每次進樣前用洗脫流動相沖洗進樣環(huán)。1.3.2.4Fe2+螯合能力測定采用Xu等人［14］的方法，稍有改動。準確吸取250"1mg/mL的樣品溶液（樣品最終濃度為100pg/mL）直接與XpL1mmol/L的FeCl2溶液混合（最終濃度為10~60pmol/L，此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配)，加入一定量的超純水使反應體系終體積為1.5mL?；靹蚝蠓胖?min，再加入1mL500pmol/L的Ferrozine水溶液(終濃度為200pmol/L),充分振蕩、混勻?；旌象w系在室溫下靜置10min，使充分反應形成Fe2+-Ferrozine復合物，用紫外分光光度法在562nm條件下測吸光值。對照樣中加入一定量的EDTA溶液(終濃度為10pmol/L)o整個過程中，使用的水為超純水。樣品對Fe2+的螯合效率計算見公式(3):式中:AT,樣品吸光度;AC，對照樣吸光度［XpL1mmol/L的FeCl2溶液加入(2500-X)pL超純水］。1.3.2.5Ca2+螯合能力的測定采用Bao等人［15］的方法，略有改動。將0.03g樣品溶解于3mL、pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液，37°C水浴中放置10min，充分溶解后加入0.04mol/L的CaCl2溶液1mLo37C水浴中反應30min后，6000r/min離心5min，收集上清液。將上清液稀釋至一定倍數(shù)，用原子吸收光譜法測定上清液中的Ca2+含量A。Ca2+螯合能力計算公式為：式中:AT,總Ca2+的量(mol);A，上清液中Ca2+的量(mol);P，蛋白質質量(g)。鈣含量測定:采用空氣-乙炔火焰原子吸收光譜法(FAAS法)。用質量分數(shù)為3%的硝酸溶液將Ca2+標準儲備液(國家標準物質研究中心)逐級稀釋成0、2、4、6、8.10pg/mL系列標準溶液。測定條件為:波長422.7nm,燈電流8mA,狹縫0.7nm，乙炔流量1L/min，空氣流量4.0L/min，燃燒器高度10mm。測定標準系列溶液(濃度由低到高)的Ca2+含量，儀器自動處理數(shù)據(jù)，并顯示標準曲線。確認后，按順序進行空白和樣品溶液的測定。計算機給出測定結果［10］。采用SPSS13.0軟件對結果進行統(tǒng)計、分析，采用Excel2003軟件繪制圖示。研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺酶對酪蛋白的脫酰胺作用隨酶添加量的增加而增加(如圖1所示)。在37C條件下，初始反應階段(0-18h)，酪蛋白的脫酰胺度隨反應時間的延長而顯著增加;反應24h以后，酪蛋白的脫酰胺度幾乎沒有顯著增加。因此，反應24h足可以完成酪蛋白的脫酰胺反應。對比酶添加量的影響，發(fā)現(xiàn)脫酰胺度隨著酶添加量的增加而大幅度增加。酶添加量為100U/kg酪蛋白或者400U/kg酪蛋白時，酪蛋白的脫酰胺度比酶添加量為700U/kg酪蛋白的脫酰胺度低。反應24h時，酶添加量分別為100、400、700U/kg酪蛋白時，酪蛋白的脫酰胺度分別為3.9、8.5、10.2%?？紤]到反應效率、酶成本等因素，在以后研究中酶添加量選用400U/kg酪蛋白。酪蛋白的脫酰胺度還與反應溫度有關（如圖2），可以看出，隨著反應時間的延長，酶添加量為400U/kg酪蛋白時，32、37和42°C進行的脫酰胺反應，只有37^下脫酰胺度最高，說明谷氨酰胺酶在37°C下的脫酰胺活力最高。因此，可以初步確定，酪蛋白脫酰胺反應的適宜反應條件為質量濃度為5%的酪蛋白溶液、反應溫度37C、酶添加量400U/kg酪蛋白。此條件下，當反應分別進行6、12、24h時，酪蛋白的脫酰胺度分別為2.8%、5.8%、8.5%，相應的水解度分別為2.5%、2.4%、4.9%，這些產物是具有較低脫酰胺度的水解酪蛋白，在以后的研究中分別稱為脫酰胺酪蛋白1、2、3。通過SDS發(fā)現(xiàn)，與酪蛋白相比，3種脫酰胺酪蛋白在分子質量為31.0ku附近的肽段幾乎完全被水解（如圖3所示），即谷氨酰胺酶使酪蛋白幾乎完全水解成小肽。小分子質量的肽主要分布在20.1、14.4ku附近以及14.4ku以下，并且隨著脫酰胺反應時間的延長，小分子質量的肽段更多。這再次說明谷氨酰胺酶對酪蛋白除了具有脫酰胺作用外，還有一定的水解作用。酪蛋白與2個脫酰胺酪蛋白的排阻色譜分析結果如圖4所示。從分析結果上看，2個脫酰胺蛋白的峰形與酪蛋白的峰形差異顯著，說明酪蛋白在脫酰胺過程中幾乎被完全水解并生成分子質量更?。ㄏ疵摃r間更長）的產物。這一結果也證明了SDS-PAGE分析結果，即谷氨酰胺酶對酪蛋白具有水解作用。以EDTA為對照樣，向EDTA、酪蛋白以及脫酰胺酪蛋白溶液中加入10~60pmol/L的Fe2+，考察它們對Fe2+的螯合能力，結果如圖5A所示。脫酰胺酪蛋白對Fe2+螯合的能力比酪蛋白、10pmol/L的EDTA的更強（尤其是在較高Fe2+添加量），整體上約增加50%~400%，并且脫酰胺酪蛋白螯合Fe2+的能力大小依次為脫酰胺酪蛋白3、脫酰胺酪蛋白2、脫酰胺酪蛋白1。圖5B為酪蛋白以及脫酰胺酪蛋白對Ca2+的螯合能力測定結果。脫酰胺酪蛋白1、脫酰胺酪蛋白2以及脫酰胺酪蛋白3的Ca2+螯合能力分別為1.23、1.41、1.49mmol/g，而酪蛋白為1.05mmol/g，即脫酰胺酪蛋白對Ca2+的螯合能力也是隨著脫酰胺度的增加而增強，并且都高于酪蛋白。這些結果表明，脫酰胺過程中酪蛋白的谷氨酰胺殘基轉換成谷氨酸殘基，因此，更多的Fe2+或Ca2+結合于脫酰胺酪蛋白。理論上，酪蛋白中谷氨酰胺殘基轉換成谷氨酸殘基的數(shù)量越多（即脫酰胺度越高），螯合Fe2+或Ca2+的能力就越強。食品蛋白質具有螯合金屬離子的能力，蛋白質對Ca2+和Fe2+的螯合能力越強，越能夠提高元素的生物利用率，有利于機體對礦物質元素的吸收利用率。此外，F(xiàn)e2+和Cu2+能夠催化反應形成氧自由基，對Fe2+和Cu2+的螯合能力越強，則蛋白質的抗氧化能力就越強。綜上所述，脫酰胺酪蛋白可以作為一種很好的蛋白質基料，并在食品加工中具有一定的潛在應用價值。谷氨酰胺酶（EC3.5.1.2）對酪蛋白具有脫酰胺和肽鍵水解作用能力。在酪蛋白質量濃度為5%、谷氨酰胺酶添加量400U/kg酪蛋白、37°C的最佳反應條件下，分別反應6、12、24h制得3種脫酰胺酪蛋白，其脫酰胺度分別為2.8%、5.8%、8.5%，水解度分別為2.5%、3.4%、4.9%。SDS以及排阻色譜分析結果證明，谷氨酰胺酶對酪蛋白具有水解作用。分析結果表明，脫酰胺酪蛋白對Fe2+及Ca2+的螯合能力均高于酪蛋白，且螯合能力與脫酰胺度相關。[1]IwaniakA,DziubaJ.Animalandplantproteinsasprecur-sorsofpeptideswithACEinhibitoryactivity-Aninsilicostrategyofproteinevaluation[J].FoodTechnologyandBiotechnology,2009,47(4):441-449.[2]JamdarSN,RajalakshmiV,PednekarMD,etal.Influenceofdegreeofhydrolysisonfunctionalproperties,antioxidantactivityandACEinhibitoryactivityofpeanutproteinhydrolysate[J].FoodChemistry,2010,121(1):178-184.[3]HaardNF.Enzymaticmodificationofproteinsinfoodsystems[M].NewYork:CRCPress,2001:170-173.[4]MaCY,KhanzadaG.Functionalpropertiesofdeamidatedoatproteinisolates[J].JournalofFoodScience,1987,52(6):1583-1587.[5]YongYH,YamaguchiS,MatsumuraY.Effectsofenzymaticdeamidationbyprotein-glutaminaseonstructureandfunctionalpropertiesofwheatgluten[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2006,54(16):6034-6040.[6]MillerDD.FoodChemistry(3rdedition)[M].NewYork:MarcelDekkerInc,1996:617-649.[7]KumagaiH,IshidaS,KoizumiA,etal.Preparationofphytate-removed,deamidatedsoybeanglobulinsbyionexchangersandcharacterizationoftheircalcium-bindingability[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2002,50(1):172-176.[8]KumagaiH,KoizumiA,SudaA,etal.Enhancedcalciumabsorptioninthesmallintestinebyaphytate-removeddeamidatedsoybeanglobulinpreparation[J].BioscienceBiotechnologyandBiochemistry,2004,68^7):1598-1600.[9]GB/T5009.5—2003.食品中蛋白質的測定[S].[10]WeatherburnMW.Phenol-hypochloritereactionfordeterminationofammonia[J].AnalyticalChemistry,1967,39(8):971-974.[11]SpellmanD,McevoyE,OCuinn