酵母菌的培養(yǎng)與分離

酵母菌的培養(yǎng)與分離實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)培養(yǎng)和分離酵母菌的技術(shù)和方法【實(shí)驗(yàn)原理】大多數(shù)酵母菌為腐生，其生活最適pH為4.5一6,常見于含糖分較高的環(huán)境中，例如果園土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生長迅速，易于分離培養(yǎng)，在液體培養(yǎng)基中，酵母菌比霉菌生長得快。利用酵母菌喜歡酸性環(huán)境的特點(diǎn)，常用酸性液體培養(yǎng)基獲得酵母菌的培養(yǎng)液（這樣做的好處是酸性培養(yǎng)條件則可抑制細(xì)菌的生長），然后在固體培養(yǎng)基上用劃線法分離之?！緦?shí)驗(yàn)材料和用具】1、 甘蔗、成熟葡萄或蘋果等果皮、0.1%美藍(lán)染液、1ml的無菌吸管、無菌培養(yǎng)皿等。2、 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：原料：馬鈴薯（200克）、葡萄糖（20克）、瓊脂（15-20克）、蒸餾水（1000ml）。配制方法：（1） 先將馬鈴薯去皮，切片，稱200克并加蒸餾水1000ml，煮沸半小時(shí)，用紗布過濾，補(bǔ)足蒸餾水量至1000ml，制成20%的馬鈴薯汁。（2） 在20%的馬鈴薯汁中加入瓊脂，煮沸溶化，補(bǔ)足水分并在115攝氏度條件下高壓滅菌20分種。（3） 加入葡萄糖，制成培養(yǎng)酵母菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。3、乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液：配方同上，但不加瓊脂而加乳酸，按每1000ml培養(yǎng)液中含5ml乳酸的量加入，并分裝試管?！緦?shí)驗(yàn)步驟】l、接種：取一小塊果皮，不需沖洗，直接接入乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液管中，置28一30°C，培養(yǎng)24小時(shí)，可見培養(yǎng)液變混濁。2、 培養(yǎng)，用無菌吸管取上述培養(yǎng)后培養(yǎng)液0.lml，注入另一管乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，置28一30C再培養(yǎng)24小時(shí)或稍長（過長則霉菌長出）。3、 觀察：用無菌操作法取少許菌液置于載玻片中央的0.l%美藍(lán)染色液中，混勻后加蓋玻片制成水浸片，先用低倍鏡后換高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽生殖情況?；罱湍妇墒姑浪{(lán)還原，從而使菌體不著色，用此方法可判斷酵母菌的死活。4、分離：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基溶化后制成平板。用劃線法分離酵母菌培養(yǎng)液，從而得到單個(gè)菌落。挑取單個(gè)菌落反復(fù)再次劃線分離純化，最終可獲得純培養(yǎng)。4.1.1培養(yǎng)基制備流程4.1.1.1取12度生產(chǎn)定型（熱或冷）麥汁，調(diào)整pH至5.3-5.5，進(jìn)行稀釋，稀釋比例以最終煮沸濃度控制在12度為準(zhǔn)。4.1.1.2稀釋后麥汁冷卻（或加熱）至40^按每升2個(gè)蛋清攪至起泡后打入。升溫至60^保溫30分鐘，保溫結(jié)束后升溫至100°C煮沸30分鐘。4.1.1.3檢測調(diào)整濃度后過濾、分裝入試管、小三角瓶、大三角瓶，0.07Mpa滅菌30分鐘。4.1.1.4滅菌后培養(yǎng)基要貼有制備日期標(biāo)簽，空培（室溫放置）3天以上確認(rèn)無菌后方可使用。4.1.1.5卡氏罐培養(yǎng)基制備采用過濾后熱麥汁裝入清洗并經(jīng)0.10Mpa蒸汽殺菌1小時(shí)后的卡氏罐中0.10Mpa滅菌30分鐘，提前1-2天完成，確保接種溫度穩(wěn)定。當(dāng)天能夠迅速冷卻的，則取當(dāng)天麥汁處理，冷卻后接種。4.1.2無菌室衛(wèi)生操作流程4.1.2.1每天對(duì)室內(nèi)進(jìn)行30分鐘紫外殺菌。超凈臺(tái)用前提前打開風(fēng)機(jī)及自帶的紫外燈滅菌30分鐘。4.1.2.無菌操作前對(duì)無菌室進(jìn)行全面徹底清潔。地面、墻壁、天棚及空間采用甲醛熏蒸或75%酒精擦試。同時(shí)用紫外殺菌30分鐘。4.1.2.3卡氏罐接種，超凈臺(tái)無法操作時(shí)，室內(nèi)空間當(dāng)天再次進(jìn)行上述空間殺菌。4.1.2.4無菌室內(nèi)應(yīng)避免其他物品的擺放，尤其操凈臺(tái)面。以免破壞空氣層流。4.1.2.5每次擴(kuò)培時(shí)應(yīng)對(duì)無菌室內(nèi)空間及超凈臺(tái)進(jìn)行兩次空氣捕捉檢測。斜面接出及卡氏罐接種時(shí)各進(jìn)行一次。4.1.3實(shí)驗(yàn)室階段擴(kuò)培工藝流程安培管（或斜面菌種）在無菌條件下，接入裝10ml麥汁培養(yǎng)液的18X180mm試管中，在25C培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24小時(shí)（如從安培管轉(zhuǎn)接，需再活化一次）.將活化后的試管培養(yǎng)液搖均，在無菌條件下,分別接1ml入裝10ml麥汁培養(yǎng)液的18X180mm試管中，在25C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化24小時(shí).將試管中的10ml酵母培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到裝50ml麥汁培養(yǎng)液的150ml三角瓶中，在22C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí).將三角瓶中的50ml酵母培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到裝500ml麥汁培養(yǎng)液的1000ml三角瓶中，在19C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí).將三角瓶中的500ml酵母培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到裝3000ml麥汁培養(yǎng)液的5000ml三角瓶中，在19C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí).將三角瓶中的3000ml酵母培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到裝25L麥汁培養(yǎng)液的卡氏罐，在13C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)?48小時(shí).將卡氏罐中的酵母培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到裝300L麥汁培養(yǎng)液的漢生罐（種子罐），在13C條件下培養(yǎng)24小時(shí)?48小時(shí).4.1.3.1斜面菌種挑取應(yīng)在距離斜面頂部1/3處邊緣部位輕挑一菌耳。液體管之間的活化過程采取用無菌吸管吸取0.5ml注入10ml液體管內(nèi)，其他接種方式為全部到入（對(duì)瓶口粘培養(yǎng)液的用火烤干再塞蓋）。4.1.3.2對(duì)采用軟管連接進(jìn)行接種時(shí)，乳膠管能夠進(jìn)行拉刷刷洗時(shí)進(jìn)行拉刷清洗，用前連同罐一同蒸汽殺菌或采取105°C干熱滅菌30分鐘