課題 微生物的實驗室培養(yǎng)

課題微生物的實驗室培養(yǎng)第一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一一、基礎知識（一）培養(yǎng)基1、概念人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。2、培養(yǎng)基的類型和用途（1）按物理性質(zhì)劃分：①液體培養(yǎng)基③半固體培養(yǎng)基②固體培養(yǎng)基注：（固體、半固體培養(yǎng)基需添加凝固劑，如瓊脂；兩者的差別是添加量的多、少；液體培養(yǎng)基不加凝固劑。）（用于工業(yè)生產(chǎn)）（微生物保存、分離、鑒定、活菌計數(shù)）（觀察微生物的運動、分類、鑒定）第二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基第三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一（2）按化學成分劃分：①合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分明確（用化學成分已知的化合物配制）（微生物的分類、鑒定）②天然培養(yǎng)基含化學成分不明的天然物質(zhì)（工業(yè)生產(chǎn)）（3）按用途劃分：①選擇培養(yǎng)基加入某化學物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要微生物的生長。（作用：分離微生物、進行選擇培養(yǎng)，進行選擇培養(yǎng)可以增加所需目的菌的濃度。）第四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一青霉素抗青霉素基因基因工程，對導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌的篩選第五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素的培養(yǎng)基:分離到酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌②鑒別培養(yǎng)基根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成的，用以鑒別不同種類的微生物。第六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一伊紅－美藍AABBCCDD大腸桿菌在伊紅－美藍培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)黑色

注：病毒專性活細胞寄生，目前不能利用人工培養(yǎng)基來培養(yǎng)，需接種在動植物組織中才能增值。常用于培養(yǎng)動物病毒的是活雞胚。第七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一3、培養(yǎng)基的成分不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽。（1）碳源為微生物提供所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)，需要量最大。①概念：②來源：無機碳源：CO2、NaHCO3等有機碳源：糖類（常用的碳源尤其是葡萄糖）

、脂肪酸、花生粉餅、石油等③作用：構(gòu)成細胞的物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物；有些是異養(yǎng)微生物的能源；思考：大腸桿菌，硝化細菌，藍藻，乳酸菌分別選用哪種碳源？糖類，二氧化碳，二氧化碳，糖類第八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一（2）氮源①概念：為微生物提供所需氮元素的營養(yǎng)物質(zhì)。②來源：無機氮源：N2、NH3、NH4+、NO3-等。有機氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等③作用：主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮的代謝產(chǎn)物。注：“含C、N”的有機物常是異養(yǎng)微生物的氮源，也是碳源，即有些化合物作為營養(yǎng)要素成分時并不是單一方面的作用。思考：培養(yǎng)根瘤菌、大腸桿菌、硝化細菌時分別需要哪一類氮源？N2，銨鹽或硝酸鹽，NH3第九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一（3）水（4）無機鹽（5）培養(yǎng)基內(nèi)所需的其他條件①概念：微生物生長不可缺少的微量有機物。注：并不是所有微生物都需要添加特殊營養(yǎng)物質(zhì)，有些需要添加，原因是它們自身缺乏合成這些物質(zhì)的酶或合成能力有限。如：培養(yǎng)乳酸桿菌需要在培養(yǎng)基中添加維生素。②來源：維生素、氨基酸、堿基等。③作用：酶、核酸的組成成分。Ⅰ、特殊營養(yǎng)物質(zhì)（生長因子）第十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一Ⅱ、pH值如:培養(yǎng)霉菌需酸性、培養(yǎng)細菌需中性或微堿性。Ⅲ、氧氣的含量如:培養(yǎng)厭氧微生物時需要提供無氧的條件。4、培養(yǎng)基的配制原則（1）目的要明確（根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的）（2）營養(yǎng)協(xié)調(diào)（注意營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例）（3）pH適宜第十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一例1：為了檢測飲用水中是否含有某種細菌，配制的培養(yǎng)基的配方如下表：

(1)該培養(yǎng)基所含的碳源有________________，其功能是________________。

(2)該培養(yǎng)基所含的氮源是________________，其功能是________________。

(3)該培養(yǎng)基除含碳源、氮源外，還有微生物需要的營養(yǎng)物質(zhì)是________________。

(4)該細菌在同化作用上的代謝類型是________________。

(5)該培養(yǎng)基可用來鑒別哪種細菌(

)

A．霉菌 B．大腸桿菌C．酵母菌D．乳酸菌乳糖、蔗糖、蛋白胨構(gòu)成微生物的細胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物蛋白胨合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物水、無機鹽異養(yǎng)型C第十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一（二）無菌技術1、概念

泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵（目的）:防止外來雜菌的入侵。2、無菌技術包括的四個方面（措施）（1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌；（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近旁進行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。第十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一3、消毒與滅菌（1）消毒①概念：使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。在生物體的一定部位產(chǎn)生一種特殊的生殖細胞叫孢子。孢子的特點是能直接長成新個體。第十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一②常用方法:a、煮沸消毒法100℃煮沸5-6min，用于一般物品的消毒。b、巴氏消毒法70-75℃下煮30min或80℃下煮15min，對一些不耐高溫的液體，如牛奶的消毒。c、化學藥劑消毒酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等，如酒精擦拭雙手、氯氣消毒水源等。d、紫外線消毒對接種室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強消毒效果，然后使用紫外線進行物理消毒。只適用于表面滅菌和空氣滅菌。第十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一（2）滅菌使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。常用方法:a、灼燒滅菌用于金屬用具（接種環(huán)、接種針）、接種過程中試管口和瓶口的滅菌；b、干熱滅菌160～170℃，1～2h。能耐高溫的需要保持干燥的物品，用于玻璃器皿、金屬用具的滅菌，所用設備是干熱滅菌箱

；c、高壓蒸汽滅菌121℃，100kPa，15-30分鐘。用于培養(yǎng)基、無菌水等的滅菌，所用設備是高壓蒸汽滅菌鍋。第十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一二、實驗操作(以培養(yǎng)大腸桿菌為例)（一）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1、計算2、稱量注意：①牛肉膏比較黏稠，天平稱量時，放等大的稱量紙，防止牛肉膏粘在托盤上；②牛肉膏和蛋白胨都易吸潮，稱取時動作迅速，稱后要及時蓋上瓶蓋。第十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一3、溶化牛肉膏和稱量紙+水取出稱量紙加熱加蛋白胨和氯化鈉攪拌加瓊脂（不斷攪拌，防止糊底而導致燒杯破裂）補加蒸餾水至100ml思考溶化時為什么要將牛肉膏連同稱量紙一起加熱?可保證粘附在稱量紙上的牛肉膏也能溶于水中,減少誤差。加瓊脂的目的是什么?作為凝固劑第十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一4、滅菌①培養(yǎng)基：高壓蒸汽滅菌②培養(yǎng)皿：干熱滅菌思考在滅菌前,用牛皮紙、舊報紙包緊盛有培養(yǎng)基的錐形瓶的目的是什么？滅菌時能避免水蒸汽凝結(jié)時浸濕棉塞；取出培養(yǎng)基錐形瓶時也能起到隔絕空氣中雜菌污染的作用。培養(yǎng)皿能否用高壓蒸汽滅菌？不能,因為培養(yǎng)皿要保持干燥,應該用干熱滅菌。在培養(yǎng)微生物時，由于不同微生物適應的PH不同，因此在熔化后必須條件PH，那么是先調(diào)PH還是先滅菌?先調(diào)PH，后滅菌。第十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一5、倒平板第二十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手時即可開始倒平板。灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。思考培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到50℃時倒平板。用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？第二十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，將平板倒置，既可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染,又可以避免培養(yǎng)基中的水分過快地揮發(fā)。空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。平板冷凝后，為什么要將平板倒置？在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？第二十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一（二）純化大腸桿菌1、純化培養(yǎng)技術：自然環(huán)境中，微生物混在一起生長，要想純培養(yǎng)，首先要將單個細胞與其他細胞分離開，進而培養(yǎng)成可見的群體（即菌落）。2、細菌的菌落①定義：單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，會形成一個肉眼可見的、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體。②特征：大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等。③功能：菌種鑒定的重要依據(jù)。第二十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一形態(tài)各異的菌落第二十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一3、常用接種方法平板劃線法稀釋涂布平板法（主要用于純化培養(yǎng)）（主要用于分離菌種并計數(shù)）(1)平板劃線法：通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可分離到由一個細胞繁殖而來的菌落。接種環(huán)第二十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一第二十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一平板劃線法獲取的微生物經(jīng)恒溫培養(yǎng)后的生長情況第二十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作結(jié)束后灼燒：殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境及感染操作者。思考第一步灼燒：消滅接種環(huán)上的微生物避免污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒：為了殺死上一次劃線結(jié)束后，接種環(huán)殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。第二十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。第二十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一(2)稀釋涂布平板法：將菌液進行一系列的梯度稀釋后，分別涂布到固體培養(yǎng)基表面。稀釋度足夠高時，能培養(yǎng)出單個菌落。稀釋涂布平板法操作過程分兩個步驟，即系列稀釋操作和涂布平板操作。涂布器第三十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一系列稀釋操作101102103104105106第三十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一涂布平板操作第三十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一對涂布器進行灼燒滅菌；吸管頭不要接觸任何物體；在火焰周圍迅速操作。接種過程中如何進行無菌操作？思考

將接種后和未接種（作為對照組）的培養(yǎng)基均放到370C的恒溫箱中，培養(yǎng)12～24h后進行觀察并記錄結(jié)果。第三十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。三、結(jié)果分析與評價1、未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？2、在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似嗎？第三十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同。隨著時間的延長、菌落的不斷生長，使菌落不斷增大。無菌操作未達到要求：可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是接種時發(fā)生了污染；也可能是在培養(yǎng)的過程中受到了污染。3、培養(yǎng)12h和24h后，觀察到的實驗結(jié)果相同嗎？如果不同，請分析產(chǎn)生差異的原因？4、如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，請分析其可能的原因。第三十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基，放入4℃冰箱中保存。以后每3~6個月，要將菌種轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基。四、課題延伸1、菌種的臨時保存：2．菌種的長期保存：3ml甘油瓶中裝入1ml甘油后滅菌，再加入1ml菌液，混勻后放入-20℃冷凍箱保存。第三十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一例2：高中生物學實驗中，在接種時不進行嚴格無菌操作對實驗結(jié)果影響最大的一項是 （）A．將少許干酵母加入到新鮮的葡萄汁中 B．將毛霉菌液接種在切成小塊的鮮豆腐上C．將轉(zhuǎn)基因植物葉片接種到無菌培養(yǎng)基上 D．將土壤浸出液涂布在無菌的選擇培養(yǎng)基上C第三十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一例3：下列有關細菌培養(yǎng)的敘述，正確的是（）A．在瓊脂固體培養(yǎng)基上長出的單個菌落含有多種細菌B．在培養(yǎng)基中加入青霉素可抑制真