第九章RNA的生物合成和加工課件

第九章RNA的生物合成和加工第一節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄第二節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工第三節(jié)RNA的復(fù)制與逆轉(zhuǎn)錄第四節(jié)RNA生物合成的抑制劑第一節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄研究的主要問題①RNA聚合酶②轉(zhuǎn)錄過程③轉(zhuǎn)錄后加工④轉(zhuǎn)錄的調(diào)控①~③是基本內(nèi)容，④是目前研究的焦點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因調(diào)控的核心轉(zhuǎn)錄----生物體以DNA為模板合成RNA的過程.轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。轉(zhuǎn)錄的起始由DNA上的啟動(dòng)子區(qū)控制，轉(zhuǎn)錄的終止由DNA上的終止子控制，轉(zhuǎn)錄所需的酶叫RNA聚合酶（依賴DNA的RNA聚合酶）,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：mRNA、rRNA、tRNA、小RNA.除某些病毒基因組RNA外，絕大多數(shù)RNA分子都來自DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。一、轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄單位:RNA鏈的轉(zhuǎn)錄，起始于DNA模板的一個(gè)特定位點(diǎn)，并在另一位點(diǎn)終止，此轉(zhuǎn)錄區(qū)域稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位可以是一個(gè)基因（真核），也可以是多個(gè)基因（原核）。轉(zhuǎn)錄單位的起點(diǎn)核苷酸為+1，起點(diǎn)右邊為下游（轉(zhuǎn)錄區(qū)），轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)左側(cè)（5′側(cè)）為上游，用負(fù)數(shù)表示：-1，-2，-3。依此類推。相同點(diǎn)：1.都以DNA為模板2.原料為核苷酸，都是生成3’，5’磷酸二酯鍵3.合成方向均為5′→3′方向4.都需要依賴DNA的聚合酶5.遵守堿基互補(bǔ)配對規(guī)律6.產(chǎn)物為多聚核苷酸鏈復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的異同點(diǎn)不同點(diǎn)：復(fù)制轉(zhuǎn)錄模板兩股鏈均作為模板模板鏈作為模板原料

dNTPNTP聚合酶

DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物子代DNA雙鏈mRNA;tRNA;rRNA配對A-T；G-CA-U；T-A；G-C引物需RNA引物--------

方式半保留復(fù)制不對稱轉(zhuǎn)錄

二、轉(zhuǎn)錄模板和酶（一）轉(zhuǎn)錄模板模板鏈：兩股DNA單鏈中只有一股可轉(zhuǎn)錄,作為模板,錄成RNA的這一股DNA鏈稱為模板鏈,或非編碼鏈,反意義鏈，（-）鏈編碼鏈：對應(yīng)的一股互補(bǔ)鏈稱為非模板DNA鏈或編碼鏈，有意義鏈，（+）鏈,與mRNA序列相同(U-T)的DNA鏈。模板轉(zhuǎn)錄的不對稱性特點(diǎn)：片段轉(zhuǎn)錄：即以一條DNA鏈一段為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄可能是一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄，也可能是幾個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)錄，因時(shí)間和空間不同，轉(zhuǎn)錄基因有差異。DNA分子上編碼鏈和非編碼鏈?zhǔn)窍鄬Φ摹Ｄ０彐湶⒎怯肋h(yuǎn)在同一條單鏈上DNA上能轉(zhuǎn)錄出mRNA然后指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的部分稱為結(jié)構(gòu)基因.其余的DNA可能轉(zhuǎn)錄(rRNA,tRNA),也可能不轉(zhuǎn)錄通常用正鏈DNA的堿基序列來表示基因的一級(jí)結(jié)構(gòu).（二）RNA聚合酶（RNApolymerase,RNApol):RNA聚合酶特性：作用條件：

4種NTP；Mg2+或Mn2+的存在；DNA模板；

反應(yīng)方向：5’→3’。不需引物RNA聚合酶缺乏核酸外切酶活性，不具備校對功能，因此RNA轉(zhuǎn)錄的保真度比DNA復(fù)制低的多。催化的反應(yīng)：不需引物,在單核苷酸的3’-OH上逐個(gè)加核苷酸。1、原核生物的RNA聚合酶（大腸桿菌）復(fù)合體，分子量為480kD，由六個(gè)亞基組成α2ββ′ωσ(全酶)，還含有兩個(gè)Zn+α2ββ′ω稱為核心酶，只催化鏈的延長，對起始無作用。σ亞基為啟動(dòng)因子不同的原核生物的核心酶相同，但σ亞基有所差別亞基亞基數(shù)分子量(KD）基因功能β’1160rpoC與模板DNA結(jié)合β1150rpoB與核苷酸結(jié)合，形成磷酸二酯鍵，起始和催化部位。σ170rpoD起始識(shí)別因子α237rpoA與DNA上啟動(dòng)子結(jié)合ω19----不詳E.coli

RNA聚合酶各亞基及其功能類型Ⅰ（或A）Ⅱ（或B）Ⅲ（或C）別名rRNA聚合酶hnRNA聚合酶小分子RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4.5SrRNA前體hnRNA（mRNA前體）tRNA和5SrRNA，snRNA前體對a－鵝膏蕈堿的繁感性不敏感抑制（高度敏感）抑制（中度敏感）2、真核生物的RNA聚合酶

三種RNA聚合酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,它們專一地轉(zhuǎn)錄不同的基因,其轉(zhuǎn)錄過程和產(chǎn)物已各不相同.三種RNA聚合酶對鵝膏覃堿的敏感性反應(yīng)不同.1、轉(zhuǎn)錄起始過程：A、在σ亞基引導(dǎo)下，RNA聚合酶全酶與啟動(dòng)子結(jié)合；B、DNA局部解開雙螺旋；形成轉(zhuǎn)錄泡C、酶滑向轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，

引入第一個(gè)NTP（ATP或GTP），然后與第2個(gè)NTP間形成磷酸二酯鍵。三、原核生物RNA的轉(zhuǎn)錄過程（以E.coli為例）轉(zhuǎn)錄起始因子僅與起始有關(guān)，RNA的合成一旦開始，便被釋放E-35-10pppG或pppA5’5‘3’3‘模板鏈σ+核心酶全酶σ(a)(b)(c)(d)σσσ

σ

的作用有點(diǎn)像是一把鑰匙。2、RNA鏈的延伸RNA合成方向5’→3’。速度：25-50b/s。a、合成開始后,σ亞基釋放，然后都由核心酶催化。b、核心酶沿模板鏈3′—5′移動(dòng)，選擇NTP，暫時(shí)形成DNA-RNA雜交鏈。c、核心酶，DNA和新產(chǎn)生的RNA區(qū)域形成轉(zhuǎn)錄鼓泡。鼓泡前DNA不斷解鏈，鼓泡后DNA同速復(fù)鏈。

因?yàn)椋篏=C＞A=T＞A=U故，鼓泡后DNA互補(bǔ)鏈取代雜交鏈中的RNA，恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)。3、終止RNA聚合酶到達(dá)轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)時(shí)，在終止子的幫助下，聚合反應(yīng)停止。RNA鏈和聚合酶脫離DNA模板鏈。轉(zhuǎn)錄的過程四、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并開始轉(zhuǎn)錄所必需的一段DNA序列。強(qiáng)啟動(dòng)子2秒鐘啟動(dòng)一次轉(zhuǎn)錄，弱啟動(dòng)子10分鐘一次。轉(zhuǎn)錄因子：RNA聚合酶在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常需要一些輔助因子（蛋白質(zhì)）參與作用，此類蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄因子。分析比較原核生物上百種啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)不同的啟動(dòng)子都存在共有序列，啟動(dòng)區(qū)具有共有的序列稱為保守序列或一致性序列.(一)原核生物的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)至少由二部分組成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶識(shí)別的信號(hào)；-10序列是酶的緊密結(jié)合位點(diǎn)（富含AT堿基，利于雙鏈打開）；AACTGTATATTATTGACATATAAT+1轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)5’3’3’5’

35序列

Sextama

框

10序列Pribnow框1、-10序列（Pribnow框）在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游大約-10處，有一個(gè)6bp的保守序列TATAAT，稱Pribnow框。每個(gè)位點(diǎn)的保守性在45%-100%。頻度：T89A89T45A60A50T96Pribnow框是啟動(dòng)子的關(guān)鍵部位。決定轉(zhuǎn)錄方向。酶在此部位與DNA結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物。-10序列有助于DNA局部雙鏈解開。2、-35序列（Sextama框）在-10序列上游還有一個(gè)保守序列，其中心約在-35位置，稱為-35序列.頻率：T82T84G78A65C54A45功能：-35序列提供RNA聚合酶識(shí)別信號(hào).σ因子的初始識(shí)別位點(diǎn)。在很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度。（二）真核啟動(dòng)子RNA聚合酶Ⅱ(mRNA)的啟動(dòng)子有三個(gè)保守區(qū)：－25到－30有TATA框，是解鏈位置，并決定轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)；失去TATA框，轉(zhuǎn)錄可能在許多位點(diǎn)上開始。－75位置有CAAT框（共有序列GCCAATCT），與RNA聚合酶的結(jié)合有關(guān)；上游還有GC框（序列GGGCGG），某些轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合。后兩個(gè)稱為上游因子，對轉(zhuǎn)錄起始頻率有較大影響RNApolⅢ的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)部(轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)下游)。五、終止子和終止因子終止子（terminators)：提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的一段DNA序列。終止因子：協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別終止子的蛋白質(zhì)輔助因子?？菇K止因子：有些終止子的作用可被特異的因子所阻止，使酶越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，稱為通讀，這類引起抗終止作用的蛋白質(zhì)稱為抗終止因子。通讀常見于某些噬菌體的時(shí)序控制。大腸桿菌有兩類終止子：簡單終止子（不需ρ因子的終止）。產(chǎn)物回文對稱區(qū)有一段富含GC對的序列，回文后有寡聚尿苷酸UUUU（終止點(diǎn)前）。原核生物終止子a、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成：

DNA上的回文序列使RNA產(chǎn)物3’端自身堿基互補(bǔ)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，雜合鏈趨于解體。b、產(chǎn)物的寡聚U片段促進(jìn)RNA從DNA上脫落：

雜交鏈中A-U間氫鍵相對較弱，新生RNA易從模板上脫落，不需ρ因子即可終止。不需ρ因子的終止依賴ρ因子終止的終止子。必須在有ρ因子時(shí)才能發(fā)揮作用，終止點(diǎn)前無寡聚U序列，回文對稱區(qū)不富含GC。

ρ因子是一個(gè)6聚體蛋白，其功能：1）終止因子；

2）NTPase活性，3）解旋酶活性。終止過程：

1）在RNA存在下，水解NTP產(chǎn)能，使ρ因子與RNApol結(jié)合；

2）解旋酶活性使RNA：DNA雜合鏈拆開，釋放RNA，酶和ρ因子一起從DNA上脫落下來。

需ρ因子終止第二節(jié)、RNA的轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后加工－轉(zhuǎn)錄生成的RNA，稱初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（前RNA，RNA前體）－無論式原核生物或真核生物，初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都必須經(jīng)過一定的加工、修飾才能表現(xiàn)其生物學(xué)功能，此過程稱為轉(zhuǎn)錄后加工原核生物轉(zhuǎn)錄后加工相對簡單－原核生物的mRNA通常是邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯，一般不進(jìn)行加工修飾－穩(wěn)定的tRNA和rRNA常經(jīng)過一系列的加工才成為活性分子真核生物轉(zhuǎn)錄后加工較復(fù)雜大腸桿菌有7個(gè)rRNA的轉(zhuǎn)錄單位，它們分散在基因組的各處。每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA以及若干個(gè)tRNA基因所組成。一、原核生物中RNA的加工1、原核rRNA前體的加工剛轉(zhuǎn)錄的rRNA為30S，先在特定的堿基上或核糖進(jìn)行甲基化（核糖2-甲基）修飾；后逐步裂解（核酸內(nèi)切酶RNAaseⅢ的切割）產(chǎn)生核糖體RNA的前體P16和P23，P5由RNAaseE作用產(chǎn)生；再由相應(yīng)核酸酶切除附加序列。原核rRNA前體的加工步驟：P16P23P516S23S5S（一般不含甲基化）rRNA原初轉(zhuǎn)錄物30srRNA和幾個(gè)tRNA16s,23s,5sP16,P2330s專一核酸酶切割核酸酶裂解甲基化tRNA基因不止一個(gè)拷貝。tRNA基因大多成簇存在，或與rRNA基因，或與蛋白質(zhì)基因組成混合轉(zhuǎn)錄單位。tRNA前體加工步驟：（1）由核酸內(nèi)切酶(RNaseP、RNaseF)切斷tRNA前體上5

和3端兩端；（2）由核酸外切酶(RNaseD)逐個(gè)在3切去附加序列，進(jìn)行修剪。（3）3’端添加CCAOH序列（某些tRNA已有，由核苷酰轉(zhuǎn)移酶催化，接受活化AA所需）（4）核苷的特定修飾（修飾酶）：包括堿基甲基化（一般由S-腺苷蛋氨酸（SAM）提供）和假尿苷修飾2、tRNA前體的加工：tRNA前體5′3′5′3′RNaseFRNasePRNasePRNaseD加工5′3′tRNACCA由單順反子構(gòu)成mRNA，一般不需加工，一經(jīng)轉(zhuǎn)錄，即可直接進(jìn)行翻譯。有些原核生物多順反子構(gòu)成的mRNA，須由核酸內(nèi)切酶切成較小的mRNA，然后再進(jìn)行翻譯。3、mRNA前體的加工：5′3′順反子順反子順反子插入順序插入順序先導(dǎo)區(qū)末端順序AGGAGGUSD區(qū)二、真核生物RNA的加工1、真核rRNA前體的加工真核生物核糖體的小亞基含：16-18SrRNA，大亞基含：26-28S、5S、5.8SrRNA（特有）。真核rRNA基因成簇排列在一起，18S、5.8S、28SrRNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，彼此被間隔區(qū)分開，由RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)長的rRNA前體。5SrRNA基因也成簇排列，間隔區(qū)不被轉(zhuǎn)錄，由RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄后經(jīng)適當(dāng)加工，參與構(gòu)成大亞基真核細(xì)胞的rRNA基因稱為高度重復(fù)序列。真核細(xì)胞的rRNA基因的高度重復(fù)序列。真核rRNA前體的加工過程：甲基化(主要在核糖2’-羥基，比原核生物甲基化程度高)剪切(RNA酶Ⅲ等核酸內(nèi)切酶)18s5.8s28s5stRNA18s5.8s28s45S前體18s5.8s28s18s5.8s28s甲基化核酸內(nèi)切酶rRNA2、真核tRNA前體的加工：真核tRNA基因的數(shù)目比原核tRNA的要多的多。真核tRNA基因也成簇排列，被間隔區(qū)分開，tRNA基因由RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄。真核tRNA前體的加工過程與原核相似。但3’端的CCA都是后加的，除堿基修飾外，還有核糖修飾（2’-O-甲基核糖）。mRNA的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是分子量很大的前體，在核內(nèi)加工時(shí)形成大小不等的中間物，稱為核內(nèi)不均一RNA(hnRNA)。其中，約有25%可轉(zhuǎn)變成成熟的mRNA。

hnRNA轉(zhuǎn)變成mRNA的加工過程主要包括：a.5’末端形成帽子結(jié)構(gòu)b.3’末端切斷并加上polyAc.甲基化d.剪接除去內(nèi)含子對應(yīng)的序列，拼接外顯子3、真核mRNA的前體加工（1）5’端加帽子：5’帽子在轉(zhuǎn)錄前已經(jīng)形成。5’帽子起識(shí)別和保護(hù)功能有三種類型的帽子：CAPO型，CAPⅠ型，CAPⅡ型。pppN1pN2p5’ppN1pN2ppi5’+GpppN1pN2p5’+ppim7GpppN1pN2P5’CAPO型帽子（2）3’端加尾加尾信號(hào)：在靠近3’端區(qū)有一段非常保守的序列AAUAAA

，作為加尾信號(hào)。早在核內(nèi)完成由RNAaseⅢ在3’端加尾信號(hào)后11～30位置切斷，然后由多聚腺苷酸聚合酶催化，加上20～200AAAAAAA…（polyA）。polyA的功能a.防止核酸外切酶對mRNA信息序列的降解，起緩沖作用。b.與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)。（3）、內(nèi)部甲基化某些真核mRNA內(nèi)部有甲基化的位點(diǎn)，主要是在N6-甲基腺嘌呤（m6A）。在hnRNA中已經(jīng)存在?？赡軐η绑w的加工起識(shí)別作用。5′

“帽子”PolyA

3′

順反子m7G-5′ppp-N-3′pAAAAAAA-OH（4）mRNA的切割拼接4、RNA的拼接（內(nèi)含子的去除）多數(shù)真核基因是斷裂基因，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過拼接，去除內(nèi)含子，使編碼區(qū)（外顯子）成為連續(xù)序列。內(nèi)含子結(jié)構(gòu)多樣，拼接機(jī)制多樣：有些內(nèi)含子可以催化自身的拼接（核酶）,有些內(nèi)含子需要在有關(guān)酶的作用下才能拼接。反式拼接構(gòu)成拼接體完成拼接(1)、tRNA的拼接

酵母tRNA約有400個(gè)基因，有內(nèi)含子的基因約占1/10，內(nèi)含子長度14-46bp，沒有保守性。切除內(nèi)含子的酶識(shí)別的是tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而不是什么保守序列。拼接過程：第一步切除內(nèi)含子，不需ATP；第二步RNA連接酶將兩個(gè)tRNA半分子連接，需要ATP。外顯子外顯子內(nèi)含子HOHOP3’2’P3’2’PAPPP3’2’OHP3’2’PATPADP激酶連接酶(2)、四膜蟲rRNA的拼接某些四膜蟲26SrRNA基因中有一個(gè)內(nèi)含子，其拼接只需一價(jià)和二價(jià)陽離子及鳥苷酸或鳥苷存在即可自發(fā)進(jìn)行。其實(shí)質(zhì)是磷酸酯的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，鳥苷酸起輔助因子的作用，提供游離3’羥基。發(fā)現(xiàn)核酶：具有催化活性的RNA

線性rRNA具有許多反向互補(bǔ)序列，可形成局部雙螺旋。

外顯子1內(nèi)含子A64G73G100T100A62A68G84T63………6Py74-84NC65A100G100N外顯子2真核生物所有編碼蛋白質(zhì)的核結(jié)構(gòu)基因，其內(nèi)含子的左端均為GT，右端均為AG。此規(guī)律稱GT-AG規(guī)律（對于mRNA就是GU-AG規(guī)律，此規(guī)律不適合于線粒體、葉綠體的內(nèi)含子，也不適合于tRNA和某些rRNA的核結(jié)構(gòu)基因）(3)、真核生物mRNA前體的拼接拼接過程：拼接體形成：U系列snRNA通常都與多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖核蛋白顆粒（RNP），其5’端序列與內(nèi)含子拼接處互補(bǔ)，參與拼接過程先在內(nèi)含子的左端切開，產(chǎn)生的5’末端與3’端上游的A形成5’,2’-磷酸二酯鍵，構(gòu)成套索結(jié)構(gòu)，釋放外顯子1。外顯子1的3’-OH親核攻擊外顯子2的5’-P，兩個(gè)外顯子連接起來形成磷酸二酯鍵，釋放套索。拼接體形成第三節(jié)、RNA的復(fù)制與逆轉(zhuǎn)錄許多病毒和噬菌體以RNA為遺傳物質(zhì)，稱為RNA病毒病毒RNA復(fù)制酶具有很高的模板專一性，只識(shí)別病毒自身的RNA。它以病毒RNA為模板，合成與模板性質(zhì)相同的RNA一、噬菌體QβRNA的復(fù)制5RNA-533RNA+釋放釋放353355RNA+RNA+RNA-RNA-及

RNA+的合成方向均為5‘3’正鏈RNA病毒（mRNA）：如噬菌體Q及灰質(zhì)炎病毒。負(fù)鏈RNA病毒(帶復(fù)制酶)：如狂犬病毒。雙鏈RNA病毒（帶復(fù)制酶）：如呼腸孤病毒。反轉(zhuǎn)錄RNA病毒：如白血病病毒和肉瘤病毒。2、病毒RNA復(fù)制的主要方式

3、RNA的反轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄）：概念：以RNA為模板，4種dNTP為底物，逆轉(zhuǎn)錄E催化，合成與模板互補(bǔ)的DNA(cDNA)的過程。這與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息從DNA到RNA的方向相反，故稱～。逆轉(zhuǎn)錄酶：

性質(zhì)：