腫瘤生物治療(張)

腫瘤生物治療張叔人2001/4/5一.腫瘤生物治療發(fā)展概況早期的腫瘤免疫治療多采用非特異性免疫增強(qiáng)劑。如卡介苗(BCG)和小棒狀桿菌(C.Parvum)菌苗。膀胱癌80年代初期，Rosenburg使用LAK過繼免疫治療晚期癌癥病人取得明顯療效，再次掀起免疫治療的高潮。(TILCIK生物導(dǎo)彈)90年代，比利時(shí)ThierryBoon首先使用T細(xì)胞克隆的方法找到了人類腫瘤抗原。SEREX法發(fā)現(xiàn)了一批腫瘤抗原。DC腫瘤抗原肽#腫瘤基因治療。P53Rb針對(duì)阻止腫瘤血管生成治療腫瘤。近幾年隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在腫瘤抗原、抗原遞呈和T細(xì)胞識(shí)別等方面均有了突破性進(jìn)展，對(duì)于腫瘤的免疫效應(yīng)機(jī)制，以及腫瘤的免疫逃逸機(jī)理有了深入的認(rèn)識(shí)。眾多腫瘤免疫療法如雨后春筍般應(yīng)運(yùn)而生。腫瘤免疫治療和手術(shù)、放療、化療三大常規(guī)療法有明顯的互補(bǔ)性，在控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面展示良好前景。生物治療：使用生物的組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、多糖、基因等生物制劑治療疾病。腫瘤的生物療法的策略：調(diào)節(jié)強(qiáng)化抗腫瘤免疫、祛除免疫抑制、直接殺傷或誘導(dǎo)腫瘤凋亡、促腫瘤分化、阻斷腫瘤營養(yǎng)供應(yīng)、提高腫瘤被殺傷的敏感性。腫瘤的免疫治療

策略：去除免疫抑制、提高免疫原性、增強(qiáng)宿主免疫細(xì)胞的反應(yīng)性以及免疫導(dǎo)向。過繼免疫治療(adoptiveimmunotherapy)：LAK,TIL,CIK(1)淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(LymphokineActivatedKiller)：制備：IL-2; 測定：5iCr釋放法、乳酸脫氫酶(LDH)釋放法NationalBiotherapyStudyGroupinterleukin-2Trials:TumorResponseAccordingtoTypeofCancerResponseDiseaseCRPRMRSDPDTotal(CR+PR)%Melanoma52824587333/18818Lung17318228/5116Breast14113155/3415Renal31011766713/1678Colon01636331/761Other0124475912/12210Total10624924826972/63811CR:completeresponse;PR:partialresponse,MR:mixedorminorresponseSD:stabledisease:PD:progressivedisease.rIL-2：半衰期短，給藥方式：皮內(nèi)、瘤內(nèi)、腔內(nèi)、淋巴管內(nèi)、吸入副作用：寒戰(zhàn)、發(fā)熱、惡心、乏力、心律失常、神經(jīng)異常、毛細(xì)血管滲漏綜合癥(Capillaryleaksyndrome,CLS),肺水腫預(yù)防和處理：地塞米松、消炎痛、安定類、吸氧(2)其他非MHC限制性過繼免疫治療/粘附MNC A-LAK+抗CD3 CD3AKLAK(MNC+IL-2)W+抗CD3+IFN-y+IL-1CIK+MEP(TCR-Vy9、VS2) ybTlMonoethylpospateLAK、CD3AKLAK、CD3AK、CIK細(xì)胞活性及增殖數(shù)量(李殿俊)LU/106cellsCellnum.x106TotalLULAKCD3AKCIK2318268877810415662028TAK：IL-2+抗CD3+Tu-Ag(2)腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(Tumor-infiltratinglymphocyte,TIL)制備：腫瘤組織一消化(透明脂酸酶、膠原酶、DNA酶)一單細(xì)胞-密度梯度分離一富含TIL+IL-2/抗CD3/100Gy自體腫瘤標(biāo)志：CD3+/CD8+fCD3+/CD4+NK、LAK、TIL之間的區(qū)別1.055-1.077-O富含腫瘤細(xì)胞OJ富含TILNKLAKTIL來源 外周血，脾抗原致敏 -產(chǎn)生條件 自然存在選擇性殺瘤能力 +抗瘤譜 窄MHC限制 —體內(nèi)增殖能力 差聚集腫瘤部位 差免疫記憶 -LGL特征 +CD3 —外周血，IL-2++廣弱差+—/+脾 腫瘤區(qū)域+IL-2、Ag、抗CD3+++窄+強(qiáng)強(qiáng)++TIL和LAK體內(nèi)抗腫瘤效力的比較回輸TIL或LAK 早期荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移抑制率％數(shù)量X106 TIL+IL-2LAK+IL-216±816±81~274±124~596±48~101003012±16028±410059±2620097±2腫瘤一一照射滅活裂解+DC——注入淋巴結(jié)區(qū)域腹股溝一一取淋巴結(jié)一一CTL克隆一一擴(kuò)增一一回輸腫瘤疫苗：(1)細(xì)胞瘤苗a.細(xì)菌或病毒佐劑瘤苗：BCGNDVb.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞瘤苗：細(xì)胞因子(IL-2GM-CSF)MHC(classIIIB7)共刺激分子(B7)c.基于DC的瘤苗：負(fù)載多肽導(dǎo)入腫瘤抗原基因d.紅細(xì)胞瘤苗：RBC-唾液酸酶e.細(xì)胞融合瘤苗：腫瘤細(xì)胞+B細(xì)胞/DC(2)亞細(xì)胞瘤苗：exosome(外泌小體)近期發(fā)現(xiàn)DC分泌的exosome屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有多種抗原遞呈分子和T細(xì)胞共刺激分子。腫瘤抗原肽刺激的DC產(chǎn)生的exosome能夠呈遞腫瘤抗原，活化CTL,抑制和根除已建立的小鼠腫瘤，所以

exosome瘤苗極具發(fā)展?jié)摿?。⑶多肽分子瘤苗?腫瘤提取抗原多肽(酸洗脫)，病毒成分(HPV16-E6、E7)合成腫瘤抗原多肽，HSP⑷多糖瘤苗：MUC-1基因瘤苗：CEA-痘苗V、HPV、erbB2/neu基于抗體的免疫治療：(1)激活效應(yīng)細(xì)胞(抗CD3AbfCIK,TIL,抗4-1BB-T)(2)idiotype-抗抗體瘤苗 <\Ag 抗體 抗抗體(3)抗腫瘤相關(guān)抗原抗體，體內(nèi) 1 使用直接產(chǎn)生抗瘤作用。 <尸Trustuzumab(Herceptin)anti-HER2

⑷抗體導(dǎo)向治療對(duì)抗體改造克服HAMA反應(yīng)a.小分子抗體：SinglechainFv(ScFv)1/6Disulfide-stabilizedFv(DsFv)PermutatedFv(pFv)日雙功能抗體(BispecificAb)?雜化雜交瘤技術(shù)輕重鏈無改變X2重鏈不變X4重、輕鏈均變X4?化學(xué)交聯(lián) Fab?基因重組兩套重輕鏈基因c.嵌合抗體(chimericAb)Fcd.人源化抗體(humannizedAb)重構(gòu)抗體，VH,VL區(qū)6個(gè)CDR移植，骨架區(qū)的一些氨基酸同時(shí)移植e.人源抗體：利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的小鼠XenoMouse,產(chǎn)生抗EGFr單抗，在裸鼠模型顯示很強(qiáng)的抑瘤作用。f.T-body:T細(xì)胞表達(dá)的嵌合受體（Fv或ScFv為胞外區(qū)和Fcyreceptor和C鏈較鏈區(qū)重組）。不受MHC限制，殺傷腫瘤或半抗原修飾的腫瘤。毒素Abrin,Ricin,Modeccin,ViscuminAbrin,Ricin,Modeccin,ViscuminPAP,SAP,Lonin,Monoridin,Triuchosanthin植植物毒素,［單鏈毒素：r內(nèi)化毒素素1細(xì)菌毒素：Diptheriatoxin（DT）,Pseudomonas

exotoxin（PE）,膜活性毒素：staphylococcala-hemolysin（aHL）,streptolysinO,- E.colia-hemolysin,pneumolysin,aerolysin,perferins,eqinatoxinsa.毒素改造：PE664E（將結(jié)合細(xì)胞能力的DIa中Lys57,His246,Arg247,和His249誘變?yōu)镚lu,使其失去結(jié)合能力）PE40（缺失DIa,剩40KD）PE38（從PE40的DIb中去除365—380aa）PE38KDEL（將PE38中DIII的C端Arg-Glu-Asp-Leu-Lys用

Lys-Asp-Glu-Leu,KDEL替代，提高IT跨膜效率）Reiter證明：ScFv-PE38KDEL較ScFv-PE38對(duì)直腸癌多種細(xì)胞系細(xì)胞毒活性高3-5倍，體內(nèi)高2倍。b.雜合毒素：植物和細(xì)菌毒素雜交 100-1000倍c.基因重組毒素：融合蛋白，必須存在和天然毒素一樣的蛋白水解位點(diǎn)，使毒素和載體內(nèi)化時(shí)解離，便于進(jìn)入胞質(zhì)，發(fā)揮殺傷效應(yīng)。d.膜活性毒素：不需內(nèi)化，殺傷力大，毒副作用大，需改造。靶向治療腫瘤相關(guān)的靶抗原已用于能向脂疔臨床試驗(yàn)的單抗針對(duì)腫擢相關(guān)性抗原分類抗原腫瘤類型淋巴期/白血病分化抗原T細(xì)胞白血病/淋巴痛CD19,CM0.CD21.CD22,CD37R細(xì)胞搟巴瘤何杰金氏淋巴痛CWCD45急性鋤蒯胞樣白血病GAMPAlH-UCDwSa)急性淋巴瘤（T和B細(xì)胞）HLA-DRB細(xì)胞淋巴推實(shí)體痛細(xì)胞表面抗原抗獨(dú)特型R細(xì)胞淋巴描精量白CEMTAG72,EpCAM,MUCL表皮如胞腫臉（乳脂E,結(jié)顫，肺）葉酸結(jié)合量白卵黑腫瘤A33結(jié)腸直腸癌L25U腎癌糖脂神經(jīng)節(jié)背腦｛GD2,CD3）神經(jīng)外胚層腫癌糖類表皮細(xì)胞腫瘤（乳腺，結(jié)腸,肺）CA-125窕巢腫瘤胞肉抗原鐵暹白何杰金氏淋巴痛，肝細(xì)胞增生長因子受體EGFK肺，乳腺,頭部和頸部腫痛P185?乳髀，嬸巢腫陷【3受體T和R細(xì)胞瘤胞外基質(zhì)抗原FAP-a表皮細(xì)胞腫瘤（乳腺，結(jié)隔，肺）肌曜蛋白多形性成膠質(zhì)細(xì)胞褶金屬蛋白醒表皮細(xì)胞腫瘤 I

抗體靶向治療的臨床研究?淋巴瘤Kaminski:1996⑶上抗CD20鼠源，頑固性非何杰金氏淋巴瘤75%患者有效，分化低的＞分化高的，化療不敏感的也取得較好療效。KnoxaY(釔)-抗CD20對(duì)非何杰金氏淋巴瘤有效率72%(治愈率33%)。90丫-抗個(gè)體基因型治療B細(xì)胞淋巴瘤有效率近33%?白血病人源化抗CD33單抗M195治療急性髓樣白血病和急性早幼粒細(xì)胞白血病。131I-M195和白消安或環(huán)磷酰胺合用于骨髓移植(BMT),除去排異反應(yīng)的T細(xì)胞。ml—抗CD54(ICAM-1)急性髓樣白血病或急性單核細(xì)胞增多型白血病的BMT,和傳統(tǒng)全身輻射除去T細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞毒性小。?結(jié)直腸癌鼠源抗表皮粘附分子單抗17-1A,對(duì)Duke,C期結(jié)腸癌死亡率和復(fù)發(fā)率分別降低了30%和27%,主要和低分化腫瘤結(jié)合，ADCC,80%產(chǎn)生HAMA,但未影響療效。人源化改造。放免治療：ml-抗A33,和骨髓也有相當(dāng)數(shù)量的結(jié)合，5/23有一定的療效。125I和靶向抗體偶聯(lián)物易為腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞。125I-抗A33,21例患者，10例顯效，而骨髓細(xì)胞很少和125I標(biāo)記抗體作用，被射線損傷機(jī)會(huì)少。近來證明：放射偶聯(lián)物離細(xì)胞核越近，細(xì)胞毒越強(qiáng)，并成指數(shù)增加。

免疫毒素：LeY-Ab和PE化學(xué)偶聯(lián)，I期研究，5/38例好轉(zhuǎn)，正常組織表達(dá)同樣靶抗原，但未受損。但是，由于毒素的免疫原性強(qiáng)，再次使用應(yīng)有效果。?乳腺癌?腎癌131I標(biāo)記鼠源G250，由于HAMA反應(yīng)，二次使用則失效。131I-G250人鼠嵌合型，腫瘤富集濃度＞0.1%(每克組織達(dá)到的注射計(jì)量，一般水平為0.001%-0.01%),16例中的2例有輕微HACA反應(yīng)。ADCC干擾素治療腫瘤腫瘤 療效4干擾素治療腫瘤腫瘤 療效毛細(xì)胞白血病慢性白血病淋巴瘤Kaposi氏肉瘤急性白血病多發(fā)性骨髓瘤神經(jīng)膠質(zhì)瘤腎細(xì)胞癌黑色素瘤卵巢癌乳腺癌60-90%緩解50%PR37%PR+CR26%PR24%PR20%PR+CR17%PR+CR16%PR+CR10%PR+CR局部使用好10%PR10%PR(1)干擾素(interferon,IFN)I型干擾素:細(xì)菌、病毒-毛細(xì)胞白血病慢性白血病淋巴瘤Kaposi氏肉瘤急性白血病多發(fā)性骨髓瘤神經(jīng)膠質(zhì)瘤腎細(xì)胞癌黑色素瘤卵巢癌乳腺癌60-90%緩解50%PR37%PR+CR26%PR24%PR20%PR+CR17%PR+CR16%PR+CR10%PR+CR局部使用好10%PR10%PRII型干擾素:IFN-y成熟分子143aa的糖蛋白，同源雙體形式存在，活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。它可上調(diào)多種細(xì)胞MHCI類分子、II類分子表達(dá)，上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)。促轉(zhuǎn)移？

(2)Interleukin,IL白細(xì)胞介素糖蛋白18種IL 主要生物學(xué)活性促T細(xì)胞分化，增殖、CTL,NK活性t促T細(xì)胞分化，增殖、CTL,NK,LAK活性t多能干細(xì)胞、T細(xì)胞增殖促B細(xì)胞增殖，產(chǎn)生Ig,DC促B細(xì)胞分化促T、B、干細(xì)胞增殖，Igt,巨核細(xì)胞分化促T、B細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)LAK趨化中性、嗜堿性粒細(xì)胞、T細(xì)胞T細(xì)胞生長，協(xié)同IL-3刺激肥大細(xì)胞抑制TH1,促胸腺和肥大細(xì)胞增殖促Ig分泌，促血小板形成協(xié)同IL-2促進(jìn)CTL、NK、LAK分化促B細(xì)胞增殖促B細(xì)胞增殖CTL,NK,LAK活性t促進(jìn)CD4+細(xì)胞增殖，抑制病毒復(fù)制(HIV)促IL-6、IL-8、PGE2、MCP-1、G-CSF tNK、TtIL-12：

35KD、40KD異二聚體，激發(fā)NK、LAK、T細(xì)胞增值、分化；向腫瘤趨化；誘導(dǎo)IFN-y產(chǎn)生；促巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO；抑制腫瘤血管生成；有利于TH1細(xì)胞分化。臨床研究：I期美國遺傳研究所主持安全性和耐受性II期另一研究組，腎癌17人中15人出現(xiàn)嚴(yán)重副作用。胃腸道出血，肝毒性和貧血，2人死亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：第一次單計(jì)量注射兩周后再多次給藥可預(yù)防毒性反應(yīng)。SC代替iv，減少用藥次數(shù)，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)。改進(jìn)：IL-12基因一自體纖維母細(xì)胞一擴(kuò)增—注入體內(nèi)（或和滅活的瘤細(xì)胞混合，作為瘤苗）CD4+,CD8+細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)大量并指狀細(xì)胞。對(duì)晚期腫瘤有效。（3）腫瘤壞死因子TNF：分為兩種，TNF-a又稱為惡質(zhì)素；TNF-p又稱為淋巴毒素。兩者都是同源三聚體。炎癥因子，和敗血癥休克、發(fā)熱、多器官衰竭、惡病質(zhì)有關(guān)。體內(nèi)外均能殺死某些類型的瘤細(xì)胞，或抑制其增殖，激活免疫細(xì)胞攻擊腫瘤，增強(qiáng)IL-2依賴的胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)IL-2、CSF、IFN-y等淋巴因子產(chǎn)生，干擾腫瘤血液供應(yīng)。它的許多功能和IL-1相同。另一方面，腫瘤壞死因子又可促腫瘤有絲分裂、腫瘤擴(kuò)散、血管生成和惡液質(zhì)。毒性大，基因重組突變型（4）血細(xì)胞生成因子G-CSF、GM-CSF、TPO、EPO、IL-6、SCF其他生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑：BCG、OK432、香菇多糖、中草藥（黃芪、女貞子

對(duì)抗免疫抑制：PGE2TnM;Ts-CYC或低劑量輻射；反義RNA(TGF-p,IGF,IL-10)配體導(dǎo)向治療：IL-2/IL-2R、EGF/EGFR三、抗血管生成腫瘤長至1-2mm3無新血管行成供應(yīng)營養(yǎng)，則不能生長。策略Fourstrategies(todesignanti-angiogenesisagents)⑴Blocktheabilityoftheendothelialcellstobreakdownthesurroundingmatrix.(2)Inhibitnormalendothelialcellsdirectly.(3)Blockfactorsthatstimulateangiogenesis.(4)Blocktheactionofintegrin,amoleculeontheendothelialcellsurface.1阻斷內(nèi)皮細(xì)胞降解周圍基質(zhì)的能力2直接抑制正常內(nèi)皮細(xì)胞3阻斷刺激血管生成的因子4阻斷整合素的作用(內(nèi)皮細(xì)胞表面的分子)活化內(nèi)皮細(xì)胞生長、運(yùn)動(dòng)的因子activeendothelialcellgrowthandmovementvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)fibroblastgrowthfactor(FGF)angiogeninepidermalgrowthfactor(EGF)scatterfactor(SF)

placentalgrowthfactor(PlGF)interleukin-8(IL-8)tumornecrosisfactoralpha(TNF-a)天然抗血管因子naturallyoccurringinhibitorsofangiogenesisI.Angiostatin2.endostatin3.Interferons(IFN).plateletfactor4(PF4).thrombospondin(凝血栓蛋白).transforminggrowthfactorbeta(TGF-p).16Kdfragmentofprolactin8.tissueinhibitorofmetalloproteinase-1,-2,and-3(TIMP-1,TIMP-2andTIMP-3)Angiostatin血管抑素：1994年O’Reily研究轉(zhuǎn)移癌抑制機(jī)制時(shí)從Lewis肺癌鼠血清和尿中提取38Kda蛋白，親肝素和賴氨酸，抑制血管內(nèi)皮生長和新的血管形成。是纖溶酶原的酶解產(chǎn)物。endostandin內(nèi)皮抑素：1997年從血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)，20kDa，膠原XVIII的酶解產(chǎn)物，原核表達(dá)無天然折疊，可溶性差，體外無活性。皮內(nèi)注射出現(xiàn)活性。?抗腫瘤作用：手術(shù)、放療、化療、免疫治療各有其局限性，腫瘤

生長嚴(yán)格依賴血管形成。腫瘤長至l-2mm3無新血管行成供應(yīng)營養(yǎng)，則不能生長。通過抑制血管形成對(duì)各種實(shí)體瘤均有效。血管內(nèi)皮細(xì)胞為新生血管前體，很少發(fā)生變異，治療效果穩(wěn)定不易產(chǎn)生耐藥性。對(duì)正常靜止的血管內(nèi)皮細(xì)胞無抑制作用。O'Reily稱其為休眠療法（dormancytherapy）o真核表達(dá)的血管抑制素有種屬差異。小鼠實(shí)驗(yàn)中達(dá)同樣抗腫瘤效果，人血管抑制素用量100mg/kg.d,小鼠血管抑制素為6mg/kg.d?基因重組內(nèi)皮抑素皮下注射已長至小鼠體重3%的多種腫瘤都縮小至鏡下可見水平。凋亡率是對(duì)照組的7倍之多。接種、 3%endostandin endostandinT#!,/'& f[/5]//!q/。），/ 2-6個(gè)周期9）/?andostandin+Angiostatinf腫瘤不復(fù)發(fā)非實(shí)體瘤白血病血管形成在骨髓，血管形成抑制劑同樣有效。優(yōu)越性；幾乎對(duì)所有的原發(fā)和轉(zhuǎn)移瘤都有效。不產(chǎn)生耐藥性。無毒副作用。 給藥途徑方便（SC）問題： 長期使用對(duì)人類能否產(chǎn)生副作用。 對(duì)自發(fā)性人類腫瘤的療效是否和小鼠實(shí)驗(yàn)效果相同。四基因治療.策略：基因置換、基因修正、基因修飾、基因失活內(nèi)容：直接攻擊腫瘤（誘導(dǎo)凋亡和直接殺傷）、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、對(duì)抗腫瘤血管生成、修飾保護(hù)正常細(xì)胞

2.載體：retrovirus(RV)、adenovirus(AdV)、adeno-asociatedvirus(AAV)、herpessimpexvirus(HSV)、Epstein-Barrvirus(EBV)、vacciniavirus(VV)、其他真核表達(dá)質(zhì)粒各種病毒載體的特點(diǎn)RVAdVAAVHSV類型雙鏈RNA雙鏈DNA單鏈DNA雙鏈DNA整合和細(xì)胞染色體隨機(jī)整合不整合定點(diǎn)19號(hào)短臂可整合產(chǎn)生感染病毒條件缺陷病毒穿梭載體復(fù)制：輔助缺陷病毒包裝細(xì)胞缺陷病毒病毒AdV,VV包裝細(xì)胞PA317(gag包裝細(xì)胞HSV或（早期病毒Pol,env)293(E1)UV,Y-射線基因IE3）外源基因裝載容量8kb35kb4.9kb>30kb感染細(xì)胞譜廣譜，分裂期廣譜廣譜，輔助病毒神經(jīng)和上皮類細(xì)胞制備效價(jià)（PFU/ml）106-107101210121011-1012感染效率較低高高高安全性有風(fēng)險(xiǎn)安全*安全有風(fēng)險(xiǎn)3.基因?qū)敕椒ǎ翰《靖腥尽⒅|(zhì)體（圖）、電穿孔、基因槍（圖）、裸基因注射、基因縫線等基因縫線:湯健縫線直接涂抹DNA或通過polylysine偶聯(lián)到縫線上血管、骨骼肌、心肌比單純注射表達(dá)率高5-10倍。尿激酶基因縫線一微小動(dòng)脈縫合一防止吻合口血栓形成和狹窄?；蜥槪河胮olylysine將基因粘附在不銹鋼針上（75-100州DNA）f刺入肌肉（0.2V,1mA,直流脈沖，DNA為負(fù)極無關(guān)電極為正）一電針30分鐘-第3天表達(dá)f14天達(dá)高峰一持續(xù)一個(gè)月。針刺捻轉(zhuǎn)為電針效率的1/3-1/5?；蚯蚰液椭Ъ埽和庠椿颍ǚ戳xN-ras）在冠狀動(dòng)脈中表達(dá)，抑

制損傷造成的血管內(nèi)膜下增生和狹窄血管外基因轉(zhuǎn)移：a 外科切開蘸有基因的濾紙貼于血管外膜b可溶性纖維蛋白+DNA——血管周圍注射一一凝血酶+組織凝血因子一一網(wǎng)狀不溶性纖維蛋白/DNA復(fù)合物一一＞14天纖溶酶作用降解.腫瘤基因治療的靶向性和組織特異性表達(dá)（1）病毒：RV：IL-2替代其envN端部分IL-2-Env.淋巴細(xì)胞膠聯(lián)EGF、Ab 有待評(píng)價(jià)AdV：Ad5-纖維蛋白的糖基，經(jīng)化學(xué)修飾和一種血清類粘蛋白（ASOR）和多聚賴氨酸連接物共價(jià)連接f和ASOR+細(xì)胞結(jié)合HSV：具有嗜神經(jīng)性，改造成只感染分裂相膠質(zhì)瘤細(xì)胞，而腦內(nèi)正常細(xì)胞不受影響。EBV：EBNA-1是EBV復(fù)制所需唯一的反式激活因子。存在于所有的EBV轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中。pFR-tk-Zta質(zhì)粒中溶細(xì)胞性復(fù)制周期反式蛋白Zta是依賴EBV激活。（HBV-嗜肝性）（2）脂質(zhì)體：特異性配基（抗體、凝集素、病毒表面的糖蛋白）EGFp-LysDNA（3）受體介導(dǎo)：EGFp-LysDNA轉(zhuǎn)鐵蛋白-多聚賴氨酸/DNAfK562EGF-多聚賴氨酸/DNAfK562（5）腫瘤組織特異性表達(dá)：

組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、反式作用因子調(diào)控表達(dá)。AFP啟動(dòng)子/增強(qiáng)子-TK.目的基因及其使用（1）抗癌基因：P53（50%人類腫瘤伴P53基因突變），、RB、WT-1MD安德森癌癥研究中心，直接瘤內(nèi)注射P53-rAdV（106-10nPFU/3次/wx2/月x7個(gè)月），安全和效果，以及3天前注射順鉑80mg/m2。雖然每例患者均出現(xiàn)抗AdV抗體，但不影響轉(zhuǎn)染效率和治療效果。33例復(fù)發(fā)性頭頸癌，2PR，1CR。WildtypeP53產(chǎn)物也可用作腫瘤疫苗。（2）免疫細(xì)胞因子基因：IFN、IL、GM-CSF、TNF（3）抗血管生成因子；angiostatin、endostatin（4）轉(zhuǎn)化預(yù)施藥物的酶類:virus-directedenzymeprodrugtherapy（4）轉(zhuǎn)化預(yù)施藥物的酶類:virus-directedenzymeprodrugtherapy無毒 胞嘧啶脫氨酶（CD） 有毒5-氟胞嘧啶（5—FC）‘"一 ''5-氟尿嘧啶（5-FU）AFP調(diào)控-胸腺嘧啶核苷激酶（TK）6—甲氧基嘌呤阿拉伯糖（araM） 腺嘌呤阿拉伯糖苷三磷酸（araATP）（5）膜抗原：MHC、B7、異種MHCclassI>同種MHCclassIAllovectin（HLA-B7/p2m,質(zhì)粒DNA陽離子脂質(zhì)體）瘤內(nèi)注射，9例放化療無效的頭頸鱗癌，4例PR,1例活17個(gè)月。.反義核酸：作用機(jī)制： 和靶基因正義RNA形成復(fù)合物而被核酶剪切降解；結(jié)合到靶基因的mRNA和5’非編碼區(qū)，抑制RNA和40S核糖體

亞單位的結(jié)合； 結(jié)合到靶基因前mRNA上，影響前mRNA的有效拼接； 結(jié)合到已經(jīng)拼接的mRNA上，影響其從胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿；影響細(xì)胞內(nèi)RNA產(chǎn)生和降解的一系列程序； 針對(duì)靶基因5’非編碼區(qū)調(diào)控序列（啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子）阻止靶基因轉(zhuǎn)錄。癌基因作靶基因：c-myc,細(xì)胞分裂進(jìn)入S期所必需的。腫瘤廠伴有表達(dá)失控。22號(hào)染色體bcr和9號(hào)染色體c-abl交互易位-bcr-abl一致癌（慢性粒細(xì)胞白血病的治療和骨髓凈化）Bcl-2,腫瘤過渡表達(dá)Bcl-2抑制正常的凋亡途徑。Ha-ras,膀胱癌Ha-ras第12號(hào)密碼子突變（GfT），針對(duì)突變其他：從c-jun、c-myb、N-ras、c-fos、c-sis、c-erbB2、生長因子及其受體基因作靶基因：腫瘤長生某些生長因子及其受體高表達(dá)，（自分泌和旁分泌）促進(jìn)腫瘤生長IGF-1R，其反義核酸抑制腫瘤增殖比抗IGF-1R抗體有效bFGF，神經(jīng)膠質(zhì)瘤高表達(dá)TGF-a/EGF-R，促細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增殖VEGF細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)物質(zhì)的基因PKA/Ria，腫瘤高表達(dá)（結(jié)腸癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳癌、胃癌）細(xì)胞周期調(diào)控物質(zhì)的基因細(xì)胞周期蛋白cyclinD1-細(xì)胞增殖“油門”、“加速器”：其反義核酸抑制細(xì)胞G1向S期轉(zhuǎn)換，從而抑制腫瘤生長，惡性表型逆轉(zhuǎn)。

?酶類基因作靶點(diǎn)參和DNA合成和復(fù)制的酶：胸甘酸激酶、胸甘酸合成酶、核糖核酸還原酶、二氫葉酸還原酶;DNA聚合酶、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶H-a亞基。許多化療藥物以此為靶點(diǎn)。?其他：多藥耐藥基因mdrl、CD44（粘附分子，腫瘤轉(zhuǎn)移）?理想反義核酸治療靶基因的條件：a.腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，而不是部分作用。b.只在腫瘤表達(dá)，正常組織不表達(dá)。（近期，端粒酶，除生殖腺細(xì)胞以外，正常組織均為陰性。）7.基因治療的問題和發(fā)展方向:7.基因治療的問題和發(fā)展方向:（1）構(gòu)建更為安全的病毒載體（3）腫瘤特異性表達(dá)（5）載體的可控性（7）新的目的基因五、增殖病毒治療腫瘤（2）腫瘤特異性導(dǎo)向（4）高效載體系統(tǒng)（6）多基因轉(zhuǎn)導(dǎo)協(xié)同效應(yīng)（8）和其他治療手段有機(jī)結(jié)合1.根據(jù)病毒在腫瘤內(nèi)特異性增殖機(jī)制分三大類:選擇進(jìn)入細(xì)胞：有些病毒具有組織親和性—改變結(jié)合蛋白-和特定腫瘤組織結(jié)合。尚無重大進(jìn)展。選擇性轉(zhuǎn)錄病毒增殖必須基因：腫瘤特異性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子插入病毒增殖必須基因的上游。JohnsHopkins大學(xué)治療前列腺癌I期 PG-P（前列腺素特異性啟動(dòng)子）E1AAdV

E1APPG-PE1AI IIIIIIIIIIIL 」 I另：人腺血管舒緩啟動(dòng)子控制E1B,該病毒殺傷前列腺癌細(xì)胞比殺傷正常細(xì)胞高10000倍。二軍大EB病毒潛伏感染細(xì)胞特異性激活的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子控制AdV的E1A、E1B——?dú)鸈BV感染的細(xì)胞和瘤細(xì)胞。（鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌）將病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制所必須，而在腫瘤細(xì)胞中非必須的病毒基因選擇性缺失AdVf正常細(xì)胞一激活P53-APOfAdV復(fù)制終止、E1B55kd/、、AdV增殖復(fù)制f細(xì)胞溶解f再感染AdVf腫瘤：P53突變或缺失/AdV缺失E1B55kdf正常細(xì)胞f激活P53fAPOfAdV復(fù)制終止腫瘤細(xì)胞fAdV增殖復(fù)制f細(xì)胞溶解f再感染f消滅腫瘤美國ONYX生化制藥公司：缺失E1B55kd的AdV命名為ONYX-015。對(duì)5株正常細(xì)胞無明顯殺傷。最近數(shù)個(gè)研究小組的結(jié)果認(rèn)為：ONYX-015作用機(jī)制和P53突變無關(guān)。I期臨床：5例復(fù)發(fā)新頭頸鱗癌（1次/4亞）瘤內(nèi)注射，3例PR；9例（1次/日,x5,4x109-5x10ioPFU）5例多療程，6例腫瘤壞死（30-90%）3例PR,3例MRII期臨床:常規(guī)治療無效的頭頸部腫瘤ONYX-015+化療PR63%,CR27%明顯優(yōu)于單純化療組（1999.9.開始III期）

Georgetown大學(xué)將HSV復(fù)制必須的基因核糖核酸還原酶活T脫氧核糖核甘酶（MSV-TK）失活，只能在含有上述酶豐富的、分裂迅速的細(xì)胞內(nèi)增殖，在正常CNS細(xì)胞不能增殖（治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤）。為安全剔除的致腦炎病毒基因，稱G207,幾乎對(duì)所有實(shí)體瘤有效。2.其他幾種特異性殺傷腫瘤病毒?呼吸道腸道過濾性病毒（reovirus）一感染后早期病毒基因轉(zhuǎn)錄一激活雙鏈RNA激活蛋白激酶（PKR）一抑制病毒其他基因轉(zhuǎn)錄一抑制病毒有效復(fù)制。癌fRas激活-抑制PKRf病毒有效復(fù)制一殺瘤加拿大Calgary大學(xué)用該病毒治療Ras高表達(dá)人膠質(zhì)瘤SCID小鼠模型，65%-80%腫瘤明顯縮小或消退。對(duì)乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌同樣有效。將進(jìn)入臨床。?NDV,自主小病毒.增殖病毒關(guān)注的幾個(gè)研究方向增殖病毒攜帶目的基因：IL-2、HSV-tk.CD（胞喀咤脫氨酶），增強(qiáng)抗腫瘤作用。減少病毒的免疫原性：更換不同血清型的AdV；IL-12、IFN-y抑制中和抗體產(chǎn)生。尋找腫瘤特異性增強(qiáng)子、啟動(dòng)子，控制病毒增殖必須基因，產(chǎn)生新型腫瘤特異性增殖病毒。. 選擇增殖病毒時(shí)，病毒應(yīng)有以下特征：必須能在腫瘤內(nèi)選擇性增殖，并溶解瘤細(xì)胞；

病毒所導(dǎo)致的人類疾病必須是輕微的，已熟知的。如有致病性需有有效抗病毒治療方法；該病毒增殖和治病的基因均已清楚；具有遺傳穩(wěn)定性極少能恢復(fù)為野生型病毒；不整合到人的基因組；容易產(chǎn)生高滴度的病毒，易于生產(chǎn)純化；體內(nèi)能感染多種組織及細(xì)胞；有理想的動(dòng)物模型進(jìn)行臨床前毒性研究。六.抗端粒酶治療腫瘤.端粒、端粒酶和腫瘤的關(guān)系（1）端粒和端粒酶?三四十年代，染色體末端存在一種維持染色體穩(wěn)定和完整的特殊結(jié)構(gòu)一一端粒（telomere）,它能防止染色體DNA降解、末端融合、缺失和非正常重組。?八十年代，端粒結(jié)構(gòu)：端粒DNA-端粒結(jié)構(gòu)蛋白。人和脊椎動(dòng)物端粒DNA均為（TTAGGG）nDNA5'3'3’?一,RNA5'

端粒DNA?1985年，四膜蟲中發(fā)現(xiàn)端粒酶（telomerase）。1998年，耶魯大學(xué)Morin從人宮頸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)人端粒酶。端粒酶：是一種核糖核蛋白，由蛋白質(zhì)和和端立互補(bǔ)的RNA組成，它能以自身RNA為膜板合成端粒DNA，本質(zhì)上屬你轉(zhuǎn)錄酶。端粒酶RNA蛋白質(zhì) ] -I端粒TNA尖毛蟲屬（2）腫瘤的“端粒-端粒酶”假說1991年，Harley提出“端粒-端粒酶”假說。他認(rèn)為：端?？赡苁羌?xì)胞有絲分裂的計(jì)時(shí)鐘（mitoticclock）。細(xì)胞在有絲分裂中，端粒DNA不斷丟失，使端?？s短?？s短到一定程度時(shí)可能觸發(fā)某種信號(hào)，退出細(xì)胞周期而老化，死亡。此階段端粒酶被激活，恢復(fù)端粒的功能，使細(xì)胞逃避死亡而獲得永生化（腫瘤）。（3）端粒酶和