高效液相色譜法改動

高效液相色譜法改動第一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二§20.1

概述§20.2

高效液相色譜法的分類與基本原理

20.2.1

高效液相色譜法的分類

20.2.2

基本原理§20.3

各類高效液相色譜法

20.3.1液－固吸附色譜法

20.3.2液－液分配色譜法

20.3.3化學(xué)鍵合相色譜法

20.3.4其他色譜法第二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二§20.4固定相

20.4.1液－固色譜固定相

20.4.2化學(xué)鍵合相

20.4.3其他固定相§20.5流動相（溶劑系統(tǒng)）

20.5.1分離方程式

20.5.2Snyder溶劑分類

20.5.3正相洗脫與反相洗脫

20.5.4洗脫方式第三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二

20.5.5流動相最優(yōu)化方法簡介§20.6高效液相色譜儀

20.6.1輸液泵

20.6.2

色譜柱與進樣器

20.6.3

檢測器

20.6.4

超高效液相色譜儀§20.7

定性、定量分析方法

20.7.1

定性分析方法

20.7.2

定量分析方法第四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜法概述第五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二

高效液相色譜法

HPLC

（highperformanceliquidchromatograph）高壓輸液泵高效固定相高靈敏度檢測器第六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的比較見表第七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二第八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二第九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜法與GC的比較見表第十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二第十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二第十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二

高效液相色譜法的分類與基本原理第十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二20.2.1高效液相色譜法的分類按固定相的聚集狀態(tài)：LLC和LSC按分離機制：分配、吸附、離子交換（IEC）、空間排阻（SEC）、親合（AC）、手性（CC）、膠束（MC）、電色譜法（EC）。第十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二HPLCLSCLLCNLLC和RLLCBPC（狹）RBPCNBPCISC一般RBPCPICIEC一般IECICAA（氨基酸分析法）SECGPC和GFCAC（親和）MC（膠束）CC（手性）第十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二20.2.2高效液相色譜法的基本原理HPLC的范氏方程：第十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二討論：

渦流擴散項：填料和填充均勻程度高效液相色譜柱的裝填第十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二縱向擴散項第十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二傳質(zhì)阻力項第十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二溫度一般為室溫

選甲醇、乙腈粘度小的溶劑粒徑第二十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二綜上所述，HPLC應(yīng)采用：1)采用小粒徑、窄粒度分布的球形固定相，首選化學(xué)鍵合相，用均漿法裝柱；2）采用低粘度流動相，低流速（1ml/min)；3）柱溫一般以25～35度為宜。太低，則流動相的粘度增加，溫度高易產(chǎn)生氣泡。第二十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二流速分析型HPLC一般流量為1mL/min。第二十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二各類高效液相色譜法第二十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二20.3.1液－固吸附色譜法分離機理

溶質(zhì)分子與流動相分子競爭吸附吸附劑表面吸附活性中心，靠溶質(zhì)分子的分配系數(shù)（容量因子）不同而分離。影響容量因子的因素

溶質(zhì)分子的極性溶劑的極性硅膠的活性第二十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二若以硅膠為固定相：洗脫劑：以烷烴為底劑，加適量極性調(diào)整劑組成的二元或三元流動相。流動相應(yīng)該不含水。第二十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二20.3.2液－液分配色譜法分離機理靠樣品組分溶入固定相與流動相達到“平衡”后分配系數(shù)的差別而分離。正、反相液－液色譜法

注意流出順序。目前，物理涂漬的液－液色譜幾乎已被化學(xué)鍵合相所取代。第二十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二20.3.3化學(xué)鍵合相色譜法

將固定液的官能團鍵合在載體表面，就構(gòu)成化學(xué)鍵合相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜法（bondedphasechromatograph，BPC）第二十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二化學(xué)鍵合相的優(yōu)點均一、穩(wěn)定；不易流失，使用周期長；柱效高；重現(xiàn)性好。第二十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二反相鍵合相色譜法（RBPC或RHPLC）固定相：在載體表面鍵合含弱極性或中等極性的基團，如十八烷基硅烷（C18）（ODS柱）、辛烷基（C8）、甲基（－CH3）、苯基等。第二十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二流動相：以水做主體，加適量的極性調(diào)節(jié)劑增加選擇性如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。出峰順序：

極性強的組分先出柱，極性弱的組分后出柱。分析對象：

分離非極性至中等極性的各種分子型化合物。第三十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二影響保留時間的因素：

溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)：極性越弱，保留時間越長。

流動相的表面張力、介電常數(shù)和pH值：對于二元或多元體系改變?nèi)軇┑呐浔瓤筛淖兞鲃酉嗟谋砻鎻埩徒殡姵?shù)。通常，流動相中有機溶劑含量增加，k變小。例如：在水－甲醇體系中增加甲醇的量，可降低表面力和介電常數(shù)，使容量因子變小。第三十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二正相鍵合相色譜法

固定相：在載體表面鍵合含中等極性或較強極性的基團，如氰基（－CN）、氨基（—NH3）、或二羥基等。

流動相：以非極性或弱極性的溶劑如己烷、庚烷等為主體，加適量的極性調(diào)節(jié)劑增加選擇性如乙醚、氯仿、二氯甲烷等。第三十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二出峰順序：

極性弱的組分先出柱，極性強的組分后出柱。影響保留時間的因素：鍵合相的種類、流動相的強度、試樣的性質(zhì)。流動相的極性增強，洗脫能力增加，保留時間縮短。第三十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二適應(yīng)范圍：

分離溶于有機溶劑的極性至中等極性的分子型化合物。第三十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二反相離子對色譜法（RPIC）第三十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二寫成通式：第三十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二表：反相離子對色譜的離子對試劑序號反離子種類主要應(yīng)用對象1季銨鹽（如四丁基銨磷酸鹽TBA、溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）強酸、弱酸、磺酸染料、羧酸、氫化可的松及其鹽2叔銨（如三辛銨）磺酸鹽、羧酸等3烷基磺酸鹽（如甲基、戊基、己基、庚基、樟腦磺酸鹽）強堿、弱堿、兒茶酚胺、鴉片堿等4高氯酸胺5烷基磺酸鹽（如十二烷基磺酸鹽、正庚烷基磺酸鈉（PICB7)與3類似，選擇性不同第三十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二離子對色譜法的適用對象：

用于有機酸、堿、鹽的分離，以及用離子交換色譜法無法分離的離子型和非離子型化合物的混合物的分離。第三十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二離子抑制色譜法（ionsuppressionchromatograph，ISC）在反相色譜法中，通過向流動相加入少量弱酸（常用乙酸）、弱堿（常用氨水）或緩沖鹽（常用磷酸鹽及乙酸鹽）來調(diào)節(jié)流動相的pH，抑制樣品組分的離解，增加它在固定相中的溶解度，以達到分離有機弱酸、弱堿的目的，這種技術(shù)稱為離子抑制色譜法。第三十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二調(diào)節(jié)pH范圍：2～7.5

pH>8.0

破壞鍵合相與載體的結(jié)合

pH<2.0

腐蝕柱子離子抑制色譜法適用：弱酸堿物質(zhì)

pKa=3～7弱酸；

pKa=7～8弱堿；兩性化合物。第四十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二20.3.4其他色譜法離子色譜法

IonChromatography，簡稱IC

傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個難于解決的問題：

a.需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時間很長；

b.洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測方法。第四十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二

離子色譜的創(chuàng)始人是H.Small。

1975年提出抑制型離子色譜法。第四十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二

以分析F-、Cl-等陰離子為例：交換柱裝OH型陰離子交換樹脂，抑制柱內(nèi)裝H型的強酸性陽離子交換樹脂。流動相是氫氧化鈉或碳酸氫鈉組成的稀溶液。第四十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二手性色譜法（chiralchromatography）

～是利用手性固定相或手性流動相添加劑分離分析手性化合物的對映異構(gòu)體的色譜法。第四十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二環(huán)糊精色譜法（CDC）根據(jù)環(huán)糊精與手性分子的鑲嵌關(guān)系分離異構(gòu)體。膠束色譜法（MC）

該系統(tǒng)具有固定相－流動相－膠束－固定相，3個界面、3個分配系數(shù)，具有較好的選擇性。第四十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二親合色譜法（Affinitychromatograph）

利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。第四十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二固定相第四十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二20.4.1化學(xué)鍵合相色譜法的固定相

鍵合相（bondedphase；BP）：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團鍵合在載體表面所形成的固定相。載體的類型：硅膠又有表面多孔型（即薄殼型）和全多孔微粒型。第四十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二廠商：Porasil、Zorbel4、Lichrosorb系列，上海試劑一廠的堆積硅珠、青島海洋化工廠的YWG系列、天津試劑二廠的DG系列廠商：Zipax、CorasilⅠ和Ⅱ

Vydac、Pellosil以及上海試劑一廠的薄殼玻璃珠。無定形球形全多孔硅膠（廢棄）第四十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二b.其他金屬氧化物制備硅膠載體的好處。硅膠載體的不足：

在堿性介質(zhì)中（pH>8）不穩(wěn)定；在孔隙中大分子擴散困難，降低柱效；硅膠表面上的剩余硅羥基對分離有影響。目前研制的基質(zhì)有：氧化鋁、氧化鋯、氧化釷和氧化鈦。第五十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二主要掌握正相和反相鍵合相：鍵合的基團的極性及適用情況。

第五十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二表：反相HPLC常用的化學(xué)鍵合相類型牌號名稱官能團粒度/μm形狀說明長鏈YWG-C18H37C18硅烷10非球形PartisilODSC18硅烷5，10非球形5％CZprbaxODSC18硅烷6球形15％C短鏈LiChrosorbRP-8C8硅烷5，10非球形13％～14％CYWGC6H6苯基硅烷10非球形7％CLiChrosorbRP-2二甲基硅烷5，10非球形5％C第五十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二鍵合相的性質(zhì)和特點

含碳量：指鍵合在硅膠表面上的烷基所含碳的質(zhì)量分數(shù)，隨鏈長增長，從3％～22％。

覆蓋度：指硅膠被鍵合后，在硅膠中的有效羥基與硅烷試劑反應(yīng)的程度，在鍵合后有時還用短鏈的硅烷試劑與剩余和新產(chǎn)生的羥基反應(yīng)，使羥基全部被”帽蓋“（即封尾）而不起作用。第五十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二

鍵合相的特點：使用過程中不流失；化學(xué)穩(wěn)定性好；適于梯度洗脫；載樣量大。第五十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二流動相（溶劑系統(tǒng)）第五十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二HPLC對流動相的要求：不與固定相反應(yīng)；對試樣有適宜的溶解度，k在1～10之內(nèi)，最好在2～5之間；與檢測器相適應(yīng)；純度高，粘度小。使用前濾過，脫氣。第五十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二20.5.1分離方程式

討論：α主要受溶劑種類的影響；在溶劑組成確定后，k主要由溶劑的配比所左右。第五十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二20.5.2Snyder溶劑分類

Snyder選擇了3個參考物質(zhì)，用于檢驗溶劑的3種分子間作用力，分別用Xe、Xd、Xn表述。

表：參考物與被檢溶劑間的作用力參考物乙醇（質(zhì)子給予體）二氧六環(huán)（質(zhì)子受體）硝基甲烷（強偶極）被檢溶劑的作用力類型質(zhì)子受體作用力(Xe)質(zhì)子給予體作用力(Xd)強偶極作用力(Xn)第五十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二

描述溶劑極性用Snyder提出的溶劑極性參數(shù)P'來衡量。表：常用溶劑的極性參數(shù)和選擇性參數(shù)溶劑P'XeXdXn正戊烷0.0---乙醚2.80.530.130.34二氯甲烷3.10.290.180.53氯仿4.10.250.410.33甲醇5.10.480.220.31第五十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二

可將81種色譜溶劑，按Xe、Xd、Xn在三角形坐標圖上的相鄰關(guān)系分為8類。

選擇不同組別的溶劑，分子作用力不同，容易使α改變，利于分離。第六十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二20.5.3正相洗脫與反相洗脫

溶劑洗脫強度指流動相中溶劑的洗脫能力,它不僅與流動相，而且與固定相的極性有關(guān)。在正相色譜中,“溶劑洗脫強度”與溶劑極性成正比；而在反相色譜中，溶劑極性越大,洗脫能力越小。第六十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二

反相鍵合相色譜法的溶劑強度用另一強度因子S表示。表：反相色譜常用溶劑的強度因子S水甲醇乙腈丙酮二噁烷乙醇異丙醇四氫呋喃03.03.23.43.53.64.24.5第六十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二混合液設(shè)計統(tǒng)計技術(shù)：根據(jù)溶劑選擇性分組，選具有顯著選擇性差異的溶劑。反相：水為底劑，甲醇、乙腈和四氫呋喃為選擇性溶劑。正相：已烷或戊烷為底劑，乙醚、氯仿和二氯甲烷為選擇性溶劑。第六十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二混合溶劑的強度

第六十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二20.5.4洗脫方式等度洗脫：

在一個分析周期內(nèi)流動相組成保持恒定，適合于組分數(shù)目較少、性質(zhì)差別不大的試樣。第六十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二梯度洗脫（程序洗脫）在一個分析周期內(nèi)程序程序控制改變流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，可使一個復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異很大的組分，能在各自適宜的分離條件（容量因子k適宜）下分離。梯度洗脫能縮短分析時間、提高分離度、改善峰形、提高檢測靈敏度。第六十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀第六十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二總圖第六十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二第六十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二高壓泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性第七十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期二梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第七十一頁，共七十九頁，編輯于2023年