雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)

雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)第一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)記錄實(shí)驗(yàn)記錄是在進(jìn)行科學(xué)研究過程中積累資料、經(jīng)驗(yàn)的一項(xiàng)重要工作，每一次實(shí)驗(yàn)過程中都應(yīng)當(dāng)養(yǎng)成良好的習(xí)慣，及時(shí)做好記錄和總結(jié)。要求：⑴真實(shí)性⑵原始性⑶完整性⑷條理性實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)整理和總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括：實(shí)驗(yàn)題目、實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?shí)驗(yàn)日期、操作步驟與條件、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、討論和結(jié)論等項(xiàng)目。第二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

上實(shí)驗(yàn)課時(shí)不遲到，不早退，自覺遵守課堂紀(jì)律，上課時(shí)應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室安靜，不得大聲說笑。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿實(shí)驗(yàn)工作服。實(shí)驗(yàn)課前認(rèn)真預(yù)習(xí)有關(guān)課程，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、要求和注意事?xiàng)，熟悉實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法步驟。實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程，按教師要求，認(rèn)真操作。要細(xì)心觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，認(rèn)真記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，作出結(jié)論，最后寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。要愛護(hù)公物，小心使用儀器和實(shí)驗(yàn)設(shè)備，注意節(jié)約用水、電、藥品和器材。所有固體廢棄物如：廢紙、固體廢棄物、沉淀物等必須棄于垃圾桶中。強(qiáng)酸、強(qiáng)堿必須倒入玻璃器皿中，用水稀釋后倒入水槽。第三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)臺(tái)應(yīng)保持整潔。公用試劑用畢，立即蓋嚴(yán)并還原。實(shí)驗(yàn)完畢，儀器洗凈放好。在實(shí)驗(yàn)過程中必須遵守操作規(guī)程，不得隨意亂動(dòng)亂用。如不會(huì)使用，應(yīng)請(qǐng)教指導(dǎo)教師。凡因亂動(dòng)亂用違反操作規(guī)程而損壞儀器設(shè)備，造成事故者，按有關(guān)規(guī)定進(jìn)行賠償和處理。嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)吃飯、吸煙、扔廢物和隨地吐痰，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)學(xué)生輪流安排值日，實(shí)驗(yàn)結(jié)束離開實(shí)驗(yàn)室之前，關(guān)好窗戶，切斷電源，水源，確保安全。第四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二試劑使用規(guī)則使用試劑前應(yīng)該仔細(xì)辨認(rèn)標(biāo)簽，看清名稱及濃度，是否為本實(shí)驗(yàn)所需。取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，放回原位；未用完的試劑決不可倒回原瓶。取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，應(yīng)該將標(biāo)準(zhǔn)溶液倒入干試管中，再用干凈吸管吸取標(biāo)準(zhǔn)液，以免污染瓶中的標(biāo)準(zhǔn)液體。使用滴管時(shí)，滴管尖端朝下，避免試劑流入橡皮帽內(nèi)。使用有毒試劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿時(shí)，盡可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。第五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二吸量管的使用正確拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指頂住吸量管頂端。取液：用吸耳球吸取液體至刻度上，眼睛看著液面上升；吸完后用食指頂住吸量管上端。調(diào)刻度：吸量管與地面保持垂直，下口與試劑瓶接觸，并成一角度；用食指控制液體下降至最上一刻度處；液體凹面、刻度和視線應(yīng)在一水平面上。放液：吸量管移入準(zhǔn)備接受溶液的容器中，使其出口尖端接觸器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放開食指，使液體自動(dòng)流出。吸量管應(yīng)最后靠壁15秒。第六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二吸量管上端標(biāo)有“吹”字。將所量液體全部放出后，還需要吹出殘留于管尖的溶液。此類吸量管為“吹出式”，未標(biāo)“吹”字的吸量管，則不必吹出管尖的殘留液體。(0.5ml以下的都要吹）吸量管尖應(yīng)接觸受器內(nèi)壁，但不應(yīng)插入受器內(nèi)的原有液體之中，以免污染吸量管及試劑。吸取血液、尿、組織樣品、粘稠試劑或有顏色的吸量管，用后應(yīng)及時(shí)用自來水沖洗干凈。如果吸取一般試劑的吸量管可不必馬上沖洗，待實(shí)驗(yàn)完畢后，用自來水沖洗干凈，晾干備用。吸量管的使用注意事項(xiàng)第七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二玻璃器皿的一般清洗方法一般玻璃儀器：如試管、燒杯、錐形瓶等，先用自來水洗刷后，用洗衣粉刷洗，再用自來水反復(fù)沖洗，最后用蒸餾水淋洗2～3次。干燥備用。容量分析儀器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自來水沖洗，待晾干后，再用鉻酸洗液浸泡數(shù)小時(shí)，然后用自來水充分沖洗，最后用蒸餾水淋洗2～3次，干燥備用。比色杯：用畢立即用自來水反復(fù)沖洗。洗不凈時(shí)，用鹽酸或適當(dāng)溶劑沖洗，再用自來水沖洗。避免用堿液或強(qiáng)氧化劑清洗，切忌用試管刷或粗糙布(紙)擦拭。上述所有玻璃器材洗凈(以倒置后器壁不掛水珠為干凈的標(biāo)準(zhǔn))后，根據(jù)需要晾干或烘干。第八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二分光光度法光是一種電磁波，通常用頻率和波長來描述光。人的視覺所能感覺到的光稱為可見光，波長范圍在400～760nm，人的眼睛感覺不到的還有紅外光（波長大于760-5000000nm）、紫外光（波長200-400nm）、X射線等。在可見光區(qū)，不同波長的光呈不同的顏色，但各種有色光之間并沒有嚴(yán)格的界線，而是由一種顏色逐漸過渡到另一種顏色。溶液的顏色與吸收光顏色的關(guān)系一般性實(shí)驗(yàn)-1第九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二Beer-Lambert定律－吸收光譜法基本定律描述物質(zhì)對(duì)單色光吸收強(qiáng)弱與厚度和待測(cè)物濃度的關(guān)系。含義：一束單色光通過溶液時(shí)，光能被吸收的程度與溶液的濃度和液層厚度成正比。A＝KCL或lgI0/I=KCLA為溶液對(duì)光的吸光度，反映了物質(zhì)對(duì)光的吸收程度；C為溶液濃度；L為溶液厚度；I0為照射待測(cè)物質(zhì)的單色光強(qiáng)度，I為透過待測(cè)物質(zhì)光線的光強(qiáng)度，透光度T=I/I0即溶液透過光的強(qiáng)度與入射光的強(qiáng)度之比；K為吸光系數(shù)，是物質(zhì)在單位濃度和單位厚度的條件下對(duì)入射光的吸光度。實(shí)驗(yàn)中溶液厚度不變，則A＝KC第十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二光吸收示意圖I0IbC第十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二吸收光譜和物質(zhì)的定性分析物質(zhì)的吸收光譜與物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。吸收光譜曲線是物質(zhì)的特征曲線。用各種不同波長的光線作為入射光測(cè)定物質(zhì)的吸光度（Absorbance），然后以波長（λ）為橫軸，相應(yīng)的吸光度（A）為縱軸，按結(jié)果作圖，可得到該物質(zhì)的吸收光譜曲線，這種曲線體現(xiàn)了物質(zhì)對(duì)不同波長的光的吸收能力。在一定的溫度、pH值等條件下吸收光譜的曲線形狀是一定的。在吸收光譜中，往往可找到一個(gè)或幾個(gè)吸收最大值，該處的波長稱為最大吸收波長（λmax）。物質(zhì)不同，它們的最大吸收波長也往往不同。第十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二不同濃度的VitB12溶液對(duì)相同波長的光的不同吸收μg/mlAλ＝550nm第十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二原理：根據(jù)物質(zhì)對(duì)于入射光的特征吸收，可應(yīng)用于物質(zhì)溶液的定性檢測(cè)比較吸收光譜曲線：在相同的條件下，吸收光譜曲線不同，表明物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同。比較最大吸收波長：不同物質(zhì)的最大吸收波長不同；化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)最大吸收波長相同，吸收系數(shù)不同。比較吸光度的比值：多用于檢測(cè)物質(zhì)的純度（DNAA260/A280=1.8純度鑒定)物質(zhì)定性分析常用方法第十四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二物質(zhì)的定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用選定的顯色劑顯色。選用合適波長的入射光。測(cè)定時(shí)先以空白溶液調(diào)節(jié)透光率100%，然后分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作圖得到一條通過原點(diǎn)的直線，叫做標(biāo)準(zhǔn)曲線（或稱A-C曲線）。標(biāo)準(zhǔn)管法對(duì)個(gè)別樣品進(jìn)行測(cè)定，且A-C曲線線性良好直接比較測(cè)定結(jié)果。

A標(biāo)

=K標(biāo)c標(biāo)b標(biāo)

A測(cè)

=K測(cè)

c測(cè)

b測(cè)

c測(cè)

=A測(cè)

/A標(biāo)

×c標(biāo)第十五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二分光光度計(jì)的基本構(gòu)造儀器中光源經(jīng)過單色器中的單色原件（如棱鏡），所得到的單色光（入射光）進(jìn)入樣品室，透出的光被受光器（光電池或光電色）產(chǎn)生光電流，放大后在測(cè)量儀上顯示出吸光度（A）或透光度（T）。光源單色器樣品室受光器測(cè)量器第十六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二722分光光度計(jì)使用方法接通電源，打開儀器電源開關(guān)，打開樣品室蓋，預(yù)熱10min;將空白液或?qū)φ找杭皽y(cè)定液分別裝入比色杯3/4體積并用擦鏡紙擦凈外壁，放入樣品室內(nèi),空白液一般放于最外格，樣品比色杯放入位置與試管位置對(duì)應(yīng);調(diào)好波長;調(diào)節(jié)按鈕開蓋時(shí)，調(diào)T

參數(shù)

調(diào)為100

合上蓋，調(diào)A參數(shù)調(diào)為0;逐步拉出樣品室拉桿（聽到“咔”一聲），讀取吸光度值(A）;讀數(shù)完打開樣品室蓋，再將讀數(shù)寫入記錄本。

第十七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二722分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)樣品室蓋應(yīng)輕開輕放；比色皿拿其磨砂面，液體裝入約3/4高度，并用擦鏡紙擦凈外壁，每次用完后自來水沖洗干凈，倒置于濾紙上；倒取試劑時(shí)不能在儀器表面上方操作，儀器上請(qǐng)勿放任何物品；每調(diào)換一次波長，都應(yīng)將空白溶液的吸光度調(diào)至“0”。第十八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夂驼莆针p縮脲測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。第十九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)在強(qiáng)堿性溶液中與稀硫酸銅溶液作用產(chǎn)生顏色反應(yīng)，生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)，蛋白質(zhì)在堿性溶液中，能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用來測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。在一定的濃度范圍內(nèi)，顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。因此可用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。實(shí)驗(yàn)原理第二十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二紫紅色銅雙縮脲復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)第二十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二在分光光度法中，許多不吸收光的無色物質(zhì)可以用顯色反應(yīng)變成有色物質(zhì)，使之能進(jìn)行比色測(cè)定，并能提高測(cè)定的靈敏度和選擇性。在比色分析或分光光度分析中，將待測(cè)組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)叫做顯色反應(yīng)，與待測(cè)組分反應(yīng)生成有色化合物的試劑叫顯色劑。在實(shí)際分析中，同一待測(cè)組分可與多種顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，生成不同的有色物質(zhì)。為了保證測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確度，在分析時(shí)常需對(duì)顯色反應(yīng)進(jìn)行選擇，選擇原則如下：

1.選擇性好，干擾少或干擾易消除；

2.靈敏度要高；

3.生成有色化合物的組成恒定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；

4.生成的有色化合物與顯色劑之間的顏色須有明顯的差別，最大吸收波長之差大于60nm。顯色劑與顯色反應(yīng)第二十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二管號(hào)試劑0123456牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（ml）2mg/ml—0.61.21.82.43.00待測(cè)蛋白液（ml）——————3.0蒸餾水（ml）32.41.81.20.600蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）00.40.81.21.62.0未知實(shí)驗(yàn)步驟1.按下圖表所示加入相應(yīng)的試劑