第四章抗體制藥演示文稿

第四章抗體制藥演示文稿當(dāng)前第1頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)優(yōu)選第四章抗體制藥當(dāng)前第2頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)第一節(jié)概述第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備第四節(jié)噬菌體抗體庫技術(shù)第五節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)抗體第六節(jié)抗體治療藥物2023/6/113內(nèi)容當(dāng)前第3頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)第一節(jié)概述一、基本概念抗體（antibody，Ab）：指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白IgAb化學(xué)結(jié)構(gòu)上的概念生物學(xué)功能上的概念2023/6/114抗體工程制藥：利用基因工程、細(xì)胞工程和轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物技術(shù)生產(chǎn)抗體藥物的過程。當(dāng)前第4頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2023/6/115當(dāng)前第5頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)免疫球蛋白（抗體）的基本結(jié)構(gòu)1、重鏈和輕鏈重鏈可分為α、δ、ε、γ、μ鏈；輕鏈可分為κ、λ型。抗體的類型由重鏈類型決定，上述重鏈分別對應(yīng)了IgAIgDIgEIgGIgM2、可變區(qū)和恒定區(qū)

重鏈和輕鏈N端第一個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)榭勺儏^(qū)（variableregion,V區(qū))，輕鏈其余的1個(gè)及重鏈的3-4個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)楹愣▍^(qū)；

V區(qū)存在3個(gè)高變區(qū)也稱互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determiningregion,CDR1~3)及4個(gè)骨架區(qū)（frameworkregion,FR1~4).三個(gè)高變區(qū)共同組成Ig的抗原識別部位，形成與抗原決定基互補(bǔ)的表位。

當(dāng)前第6頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2023/6/117當(dāng)前第7頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2023/6/118多克隆抗體：病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，對其產(chǎn)生的抗體也是多種抗體的混合物，稱為多克隆抗體。單克隆抗體：針對一個(gè)抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的、高度特異、均一、來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)的抗體。多抗與單抗當(dāng)前第8頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細(xì)胞多克隆抗體制備過程當(dāng)前第9頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+癌細(xì)胞各抗體分開單克隆抗體制備過程當(dāng)前第10頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)疾病的診斷和治療：診斷:檢測與某些疾病相關(guān)的抗原，輔助臨床診斷。臨床治療：如針對T淋巴細(xì)胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體，對器官移植排斥反應(yīng)有顯著抑制作用，用作免疫抑制劑。作為載體制備導(dǎo)向藥物（Antibodydrugconjugates,ADC）治療腫瘤。2023/6/1111抗體的應(yīng)用當(dāng)前第11頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)需解決的問題：鼠源性單克隆抗體的免疫原性（HAMA）；完整的抗體分子分子量過大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度；延長半衰期。其他2023/6/1112當(dāng)前第12頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)基本消除了單克隆抗體的鼠源性（免疫原性）,鼠源氨基酸只占完整抗體分子的1/80~1/3，只保留同抗原特異性結(jié)合的活性。制備出改形抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等很多類型的抗體或抗體單位。2023/6/1113基因工程技術(shù)為解決問題提供了可能當(dāng)前第13頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)二、抗體工程發(fā)展歷程及趨勢1890年，Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素1937年，Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種（α）球蛋白、乙種（β）球蛋白、丙種（γ）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。1975年，K?hlerandMilstein等首次利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出McAb.在臨床上主要用于診斷和治療。1976年，SusumuTouegava（利根川進(jìn)）揭示了抗體多樣性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。1984年報(bào)道了人—鼠嵌合抗體多克隆抗體單克隆抗體基因工程抗體2023/6/1114當(dāng)前第14頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2023/6/1115整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)

基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術(shù)

噬菌體抗體庫技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達(dá)技術(shù)當(dāng)前第15頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)商業(yè)化的抗體藥物2023/6/1116當(dāng)前第16頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2023/6/11FDA批準(zhǔn)的抗體藥物全抗體37個(gè)（至2014.10月）抗體片段3個(gè)ADC3個(gè)（1個(gè)已撤市）雙特異抗體2個(gè)Fc融合蛋白7個(gè)鼠源嵌合人源化人源ADC1986OKT31994ReoPro1997RituxanZenapax1998SimulectSynagisRemicadeHerceptinEnbrel2000Mylotarg2001Campath2002ZevalinHumira2003XolairBexxar2004AvastinErbitux2006LucentisVectibix2007Soliris2008Cimzia2009StelaraSinponi2010ActemraNumax2011BenlystaYervoyAdcetris2012PerjetaEylea2013KadcylaGazyva2014CyramzaSylvantEntyvioKeytruda當(dāng)前第17頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2014年全球生物藥品銷售額前10名NO.DrugCompanySale(billion$)IndicationTarget1Humira(adalimumab)AbbVie&Eisai12.54RATNF2RemicadeJ&J9.24RA、Crohn’sTNF3RituxanBiogen-IDEC8.678Non-Hopkin’sLymphomaCD204EnbrelAmgen8.538RA、牛皮癬TNF4Lantus(insulinglargine)Sanofi7.279I/II型糖尿病/6AvastinRoche/Genentech6.957結(jié)腸癌，NSCLCVEGF7HerceptinRoche/Genentech6.793乳腺癌，胃癌HER28NeulastaAmgen4.39白細(xì)胞減少癥/9LucentisRoche/Genentech,Novartis4.27AMDVEGF10EpogenAmgen3.35貧血及癌癥化療引起貧血/當(dāng)前第18頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2013年14個(gè)抗體藥物銷售過10億美元2023/6/1119110.265.687.7683.867567.51當(dāng)前第19頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)生物藥物專利懸崖Pharmaceuticals2012,5,1393-1408生物技術(shù)藥物研發(fā)熱浪涌向中國當(dāng)前第20頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)重磅化藥銷售Pharmaceuticals2012,5,1393-1408當(dāng)前第21頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)第二節(jié)單克隆抗體及其制備2023/6/1122一、抗體分子的結(jié)構(gòu)與功能二、單克隆抗體的制備當(dāng)前第22頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)

(1)Fab段2個(gè)抗原結(jié)合片段

fragmentwithantigenbinding

(2)Fc段1個(gè)可結(jié)晶片段

fragmentcrystallized

Porter木瓜蛋白酶

(1)F(ab’)2段1個(gè)

結(jié)合顆粒性抗原出現(xiàn)凝集反應(yīng)

(2)Fc’段1個(gè)

無生物學(xué)活性Nisonoff胃蛋白酶1、酶解片段一、抗體分子的結(jié)構(gòu)與功能當(dāng)前第23頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)

（1）、輕鏈（lightchain，L鏈）

214個(gè)氨基酸殘基，24KD。分為：κ與λ

2個(gè)亞型。（2）、重鏈（heavychain，H鏈）

450-550個(gè)氨基酸殘基，55-75KD。分為5類，μ、γ、α、δ、ε鏈。

IgM，IgG，IgA，IgD，IgE。

2、重鏈和輕鏈當(dāng)前第24頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)3、可變區(qū)和恒定區(qū)（1）可變區(qū)（Variableregion，V區(qū)）

L鏈N端1/2處（VL）110個(gè)aa;

H鏈N端1/5-1/4處（VH）118個(gè)aa。HVR1，HVR2，HVR3又分別稱為CDR1，CDR2，CDR3

骨架區(qū)（frameworkregion,FR）高變區(qū)（hypervariableregion,HVR）

互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determiningregion,CDR），

（2）恒定區(qū)（constantregion，C區(qū)）

L鏈C端1/2處，105個(gè)aa;H鏈C端3/4-4/5處，331-431個(gè)aa。

在同一種屬動(dòng)物中是比較恒定的,是制備第二抗體進(jìn)行標(biāo)記的重要基礎(chǔ)。當(dāng)前第25頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)4、功能區(qū)鏈內(nèi)二硫鍵折疊成球形區(qū)稱為功能區(qū)，約由110個(gè)aa組成。（1）L鏈：2個(gè)，VL，CL各1（2）H鏈：

IgG，IgA，IgD：4個(gè)（V區(qū)1個(gè)，C區(qū)3個(gè)）

IgM，IgE：5個(gè)（V區(qū)1個(gè)，C區(qū)4個(gè)）

（3）功能區(qū)的作用：（a）VL和VH：結(jié)合抗原決定簇（FV區(qū)）（b）CL和CH：具有同種異型的遺傳標(biāo)記（c）CH2：結(jié)合補(bǔ)體（d）CH3：結(jié)合Fc受體

單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞，B細(xì)胞，

NK細(xì)胞

當(dāng)前第26頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)5、抗體基因結(jié)構(gòu)2023/6/1127人類編碼Ig的基因分別位于不同的染色體重鏈（Heavychain)基因：位于14號染色體；輕鏈基因：κ鏈基因位于2號染色體；λ鏈基因位于22號染色體。每條肽鏈的編碼基因可分為V區(qū)和C區(qū)兩大部分。V區(qū)的基因是由不同的基因片段拼接而成的重鏈V區(qū)：由V、D、J片段拼接；輕鏈V區(qū)：由V、J拼接。C區(qū)拼接決定了抗體的類別（

μ、γ、α、δ、ε）當(dāng)前第27頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)胚系重鏈的基因結(jié)構(gòu)：(a)鼠(b)人當(dāng)前第28頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)重鏈的VDJ重組2023/6/1129當(dāng)前第29頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)輕鏈基因胚系及重排后結(jié)構(gòu)當(dāng)前第30頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)抗體類別轉(zhuǎn)換2023/6/1131當(dāng)前第31頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)V區(qū)功能：識別并特異性結(jié)合抗原C區(qū)功能：激活補(bǔ)體系統(tǒng)：抗體與抗原結(jié)合形成復(fù)合物可通過啟動(dòng)C1q激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑及補(bǔ)體旁路途徑；介導(dǎo)免疫細(xì)胞活性：抗體的調(diào)理作用；ADCC作用；介導(dǎo)超敏反應(yīng)。穿過胎盤和黏膜：IgG是唯一能從母體通過胎盤屏障轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒體內(nèi)的抗體；IgA合成的主要作用部位在黏膜，是黏膜局部抗感染的主要物質(zhì)。2023/6/11325、抗體的功能當(dāng)前第32頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2023/6/1133當(dāng)前第33頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)抗體功能（C區(qū)）-ADCC2023/6/1134當(dāng)前第34頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)抗體功能（C區(qū)）-CDC2023/6/1135IgG4、IgA、IgE當(dāng)前第35頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)二、單克隆抗體及其制備2023/6/1136抗原與動(dòng)物免疫細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)篩選陽性克隆與克隆化雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的純化當(dāng)前第36頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)單克隆抗體制備原理37當(dāng)前第37頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)單克隆抗體制備的基本技術(shù)1、抗原與動(dòng)物免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原；制備特定抗原的單克隆抗體，要制備用于免疫的適當(dāng)抗原，再用抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫。可以用化學(xué)合成：地高辛多數(shù)抗原物為混合物用整個(gè)腫瘤細(xì)胞做為免疫原，經(jīng)過篩選、克隆化，制備出僅存在于腫瘤細(xì)胞而不存在于正常細(xì)胞上的表面標(biāo)志分子的單克隆抗體。免疫動(dòng)物：BALB/c小鼠或Lou大鼠；目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠。免疫方法：體內(nèi)免疫和體外免疫(體外致敏淋巴細(xì)胞)。

當(dāng)前第38頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)體內(nèi)免疫法：

適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多時(shí)應(yīng)用，一般用8～12周齡雌性鼠。

顆粒性抗原（細(xì)胞抗原）的免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔107個(gè)細(xì)胞進(jìn)行初次免疫，間隔1～3周，追加免疫1～2次?？扇苄钥乖喊?0～100μg抗原/小鼠與福氏完全佐劑和滅活的分枝桿菌等量混合后注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原。刺激B細(xì)胞分裂。當(dāng)前第39頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)

基本方法：脾細(xì)胞（1*108）與骨髓瘤細(xì)胞（2*107~3*107）混合，在PEG作用下誘導(dǎo)融合(2min)，用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。骨髓瘤細(xì)胞：SP2/0、P3.653，為缺陷性。PEG:分子量4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑；常用濃度為40%~50%，相對分子質(zhì)量4000為佳。為了提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO，以提高細(xì)胞接觸的緊密性，增加融合率。但必須嚴(yán)格限制接觸時(shí)間。作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合當(dāng)前第40頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)細(xì)胞融合的步驟：將免疫脾細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞以2：1～10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)200rpm離心7—10分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細(xì)胞鋪展成薄層在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%的PEG0.5ml，隨后靜置60秒再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入5－10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用再靜置10分鐘。當(dāng)前第41頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)可生產(chǎn)有用抗體的

淋巴細(xì)胞

若與

癌細(xì)胞融合，則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細(xì)胞株。癌細(xì)胞可培養(yǎng)生長漿細(xì)胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長產(chǎn)生專一性抗體一個(gè)Bcell只產(chǎn)生一種抗體當(dāng)前第42頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)細(xì)胞融合液中如何去除脾-瘤以外的融和細(xì)胞？

解決方法：選擇性培養(yǎng)基(HAT）

當(dāng)前第43頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞HAT是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。當(dāng)前第44頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)m核酸補(bǔ)救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶胸腺嘧啶核苷激酶葉酸拮抗物當(dāng)前第45頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2023/6/1146當(dāng)前第46頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)選擇性培養(yǎng)方法：將融合的細(xì)胞懸浮于HAT的培養(yǎng)液，加入到96孔板內(nèi)每2~3天換液一次。換液時(shí)吸去1/2~2/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液。7天內(nèi):用HAT培養(yǎng)液，殺死瘤-瘤融合細(xì)胞后，第7~14天:改用HT培養(yǎng)液，14天以后:用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液。從融合后8~9天就可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測，篩選出產(chǎn)生抗體的陽性克隆。當(dāng)前第47頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)大量細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中死亡，單個(gè)或少數(shù)雜交瘤細(xì)胞不易存活？解決辦法：飼養(yǎng)細(xì)胞小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞最適的條件下,105個(gè)脾細(xì)胞形成1個(gè)雜交瘤細(xì)胞，大量瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中相繼死亡，單個(gè)或少數(shù)的雜交瘤細(xì)胞多半不能存活，加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖。當(dāng)前第48頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)原因:飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放某些生長刺激因子能滿足雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還能清除死亡細(xì)胞，故應(yīng)用較多。當(dāng)前第49頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)三、篩選陽性克隆與克隆化（1）篩選陽性克隆：產(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細(xì)胞:占所有脾細(xì)胞的5%微量、快速、特異、敏感、簡便，并一次能檢測大批標(biāo)本的方法。檢測方法：免疫酶技術(shù)；免疫熒光技術(shù)；放射免疫技術(shù)；FACS2023/6/1150當(dāng)前第50頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)ELISA當(dāng)前第51頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)1、精制破傷風(fēng)毒素抗原（）吸附（約10g/ml，4℃，3h）洗滌2、加雜交瘤培養(yǎng)上清液（）（4℃，1h）3、加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體（）（4℃，1h）洗滌洗滌4、加酶作用底物，呈色孔為陽性克隆孔ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選2023/6/1152當(dāng)前第52頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)（2）克隆化——有限稀釋法和軟瓊脂法應(yīng)盡早克隆化:含不分泌細(xì)胞,多株分泌細(xì)胞,染色體易丟失克隆化：單個(gè)細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過程。其中每個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特征和功能完全相同。一般3次克隆化，才能達(dá)到100%孔內(nèi)均為抗體陽性細(xì)胞克隆。常用的克隆化方法有：有限稀釋法、軟瓊脂法、流式細(xì)胞法。2023/6/1153當(dāng)前第53頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)有限稀釋法：通過適當(dāng)?shù)南♂屵_(dá)到分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的目的：雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使每個(gè)孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。例：取出陽性孔內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個(gè)細(xì)胞；如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml，其機(jī)率將為每孔內(nèi)落入一個(gè)細(xì)胞；加入一定數(shù)量的飼養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)過8~12天后，可觀察到有集落生長的孔；據(jù)檢測的陽性結(jié)果再次進(jìn)行克隆化。2023/6/1154當(dāng)前第54頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)軟瓊脂法：培養(yǎng)液中加入0.5%左右的瓊脂糖凝膠細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊，用毛細(xì)吸管將小球吸出團(tuán)塊打碎后移入96孔板繼續(xù)培養(yǎng)可吸出大量克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，因初代細(xì)胞很不易增殖，所以該法容易成功。2023/6/1155當(dāng)前第55頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)

四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定（一）雜交瘤細(xì)胞鑒定：鼠脾細(xì)胞染色體數(shù):40，端著絲粒;小鼠骨髓瘤細(xì)胞染色體:SP2/0細(xì)胞為62~68，NS-1為54~64，中部和亞中部著絲點(diǎn);雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目:親本細(xì)胞數(shù)目總和，多數(shù)為端著絲粒，少數(shù)標(biāo)志染色體;染色體數(shù)目多且較集中的雜交瘤細(xì)胞分泌高效價(jià)的抗體；

當(dāng)前第56頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)Ig類型、亞類測定：雙擴(kuò)法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應(yīng)效價(jià)測定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示

表位測定：競爭抑制法親和性測定：測定親和常數(shù)K雜交瘤細(xì)胞染色體：秋水仙素裂解法McAb靶抗原分子量：常用westernblot（二）抗體性狀鑒定當(dāng)前第57頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)五、單克隆抗體的制備（1）體外培養(yǎng)法：可獲得10g/ml的抗體；多采用RPMI1640培養(yǎng)液，添加10%~20%胎?；蛐∨Ｑ濉＃?）動(dòng)物體內(nèi)誘生法：可獲得5~20mg/ml的抗體。目前多采用2023/6/1158當(dāng)前第58頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)體內(nèi)誘生法：因?yàn)殡s交瘤細(xì)胞的兩種親本細(xì)胞均來自BALB/c小鼠，所以應(yīng)選用BALB/c小鼠來制備單克隆抗體?？捎谧⑷爰?xì)胞的幾周前，預(yù)先將具有刺激性的有機(jī)溶劑降植烷（pristane）注入腹腔內(nèi)，以破壞腹腔內(nèi)膜，建立雜交瘤易于增殖的環(huán)境。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體量較多且效價(jià)亦高，還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細(xì)胞株2023/6/1159當(dāng)前第59頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)小結(jié)當(dāng)前第60頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第61頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)六、單克隆抗體的純化動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體具體純化方法及過程1、澄清和沉淀處理離心1000g×5min：去除殘留的小顆粒物質(zhì)（小鼠腹水中含有紅細(xì)胞、細(xì)胞碎塊、纖維蛋白凝塊及脂質(zhì)等）；0.2m的微孔濾膜過濾：除掉污染的細(xì)菌、支原體和脂質(zhì)；用飽和硫酸銨沉淀抗體：50%飽和硫酸銨能回收90%以上的單克隆抗體。2023/6/1162當(dāng)前第62頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)1.名詞解釋：抗體；免疫球蛋白；多克隆抗體；單克隆抗體2.單克隆抗體有哪些不足？如何改造？3.大量制備單克隆抗體的方法主要有哪些？4.制備單克隆抗體的一般流程是什么？（如何制備雜交瘤細(xì)胞？）思考題2023/6/1163當(dāng)前第63頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)第三節(jié)基因工程抗體基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)

根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。目的：保留天然抗體的特異性和主要生物活性，去除或減少無關(guān)結(jié)構(gòu)及鼠源單抗不足；賦予抗體分子新的生物活性。原理：抗體同抗原結(jié)合的功能決定于抗體分子的可變區(qū)（V），同種性免疫源性則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)（C）。當(dāng)前第64頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)內(nèi)容1、人-鼠嵌合抗體（ChimericAntibody）2、人源化改型抗體（HumanizedAntibody）3、單鏈抗體4、單域抗體與分子識別單位5、雙功能抗體6、抗體融合蛋白2023/6/1165當(dāng)前第65頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)基因工程抗體的類型人-鼠嵌合抗體改型抗體（人源化抗體）FabFv單鏈抗體單域抗體最小識別單位抗體融合蛋白2023/6/1166單域抗體最小識別單位單鏈抗體小分子抗體當(dāng)前第66頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)1人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)

人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。當(dāng)前第67頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈嵌合載體L鏈嵌合載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞啟動(dòng)子人-鼠嵌合抗體基因工程改造策略構(gòu)建嵌合抗體過程：鼠源單抗的可變區(qū)基因連到包含有人抗體恒定區(qū)基因并構(gòu)建到表達(dá)所需的其它元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等)的表達(dá)載體上，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞)中表達(dá)。當(dāng)前第68頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細(xì)胞人-鼠嵌合基因工程抗體當(dāng)前第69頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2人源化改型抗體(Reshapingantibody)鼠單克隆抗體V區(qū)的人源化

盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時(shí)它仍可能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術(shù)。

CDR移植:即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體（humanizedantibody)。當(dāng)前第70頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)

經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變

結(jié)合半抗原及全抗原(如細(xì)胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報(bào)道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的28種治療性單抗中多數(shù)是人源化抗體）當(dāng)前第71頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)

人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個(gè)可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補(bǔ)的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體。當(dāng)前第72頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)

定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物，用定點(diǎn)突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達(dá)出改型抗體。研究表明，在構(gòu)建改形抗體時(shí)，簡單地進(jìn)行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時(shí)還必需包括對影響抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框架序列（FR）進(jìn)行操作。當(dāng)前第73頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)單鏈抗體(singlechainFv,scFv)P154:由一段彈性連接肽（linker）把可變區(qū)重鏈（VH）與輕鏈（VL）相連而成，具有親代抗體全部抗原結(jié)合特異性的最小功能結(jié)構(gòu)單位。連接肽的長度在10-15個(gè)氨基酸左右，具有一定彈性和蛋白酶抗性，常用的連接肽是(GGGGS)3它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點(diǎn)。

3單鏈抗體（ScFv）Fv由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定,在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到單鏈抗體。當(dāng)前第74頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)分子小，保持完整抗原結(jié)合位點(diǎn)，易進(jìn)入組織；易于進(jìn)行分子改造，融合毒素、酶、藥物等構(gòu)成雙功能抗體。免疫原性低；可在大腸桿菌中表達(dá)；缺乏Fc段，不與非靶細(xì)胞（Fc受體陽性細(xì)胞）結(jié)合，易進(jìn)入組織，偶聯(lián)成像可用于診斷；體內(nèi)半衰期短易從血循環(huán)中清除；親和力和穩(wěn)定性較完成抗體低；因只能與抗原結(jié)合，不能激活補(bǔ)體激活細(xì)胞免疫（CDC）及抗體依賴細(xì)胞毒效應(yīng)（ADCC）。2023/6/1175單鏈抗體（ScFv）特點(diǎn)當(dāng)前第75頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)

單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時(shí)可用完全人工合成法;

從雜交瘤細(xì)胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因VH,VL，將二者連接成ScFv基因，再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上。ScFv的基因構(gòu)建當(dāng)前第76頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)

單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌，有2種方式:

一是表達(dá)為包涵或非包涵體的不溶蛋白。但需進(jìn)行變性復(fù)性，使其形成正確的立體結(jié)構(gòu)，恢復(fù)抗體活性;

二是分泌型表達(dá)，將細(xì)菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細(xì)菌體外，進(jìn)行折疊后成為有活性的分子。重組ScFv的表達(dá)當(dāng)前第77頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)雙價(jià)及多價(jià)ScFv2023/6/1178連接肽（linker）較短時(shí)，同一ScFv分子內(nèi)VH與VL不能相互配對，分子間的VH，VL功能區(qū)配對成一個(gè)二價(jià)的二聚體，也可構(gòu)成三聚體或多聚體。當(dāng)前第78頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)

抗體的VH、VL約為完整分子的1/12,只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。

4、單域抗體和分子識別單位VH分子識別單位：約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個(gè)CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。當(dāng)前第79頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)即雙特異性抗體(bispecificantibody,BSAb)是指能同時(shí)識別2種抗原的抗體。5、雙（多）功能抗體當(dāng)前第80頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)

Hollinger等將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗Ｂ抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達(dá)質(zhì)粒中,構(gòu)建成雙鏈抗體的表達(dá)質(zhì)粒,目前報(bào)道的表達(dá)質(zhì)粒均為雙順反子。表達(dá)后,VLAVHB與VHAVLB交叉連結(jié),形成雙特異性抗體。當(dāng)前第81頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)雙功能抗體實(shí)例

能結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞又能結(jié)合高細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞,將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細(xì)胞表面引發(fā)分子結(jié)合,激活效應(yīng)細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的殺傷和裂解。與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識別腫瘤細(xì)胞外,還能將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細(xì)胞再導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞處,從而使效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性增強(qiáng),發(fā)揮免疫導(dǎo)向作用,這是腫瘤治療的新突破。當(dāng)前第82頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)Catumaxomab2023/6/1183當(dāng)前第83頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)多功能抗體

當(dāng)前第84頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)6、抗體融合蛋白將抗體片段（V區(qū)或C區(qū)）連接到與抗體無關(guān)的其他蛋白上，創(chuàng)造出抗體相關(guān)分子，稱為抗體融合蛋白（antibodyfusionprotein）。分類：Fv抗體融合蛋白：抗體的Fv與其他生物活性蛋白結(jié)合，主要用于導(dǎo)向治療領(lǐng)域。Fc抗體融合蛋白：抗體Fc段與某些有黏附或結(jié)合功能的蛋白質(zhì)融合而獲得的融合蛋白。2023/6/1185當(dāng)前第85頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)Fv-抗體融合蛋白抗體與毒素、酶、細(xì)胞因子等生物活性分子融合達(dá)到特異殺傷腫瘤細(xì)胞目的?？贵w與毒素偶聯(lián)：綠膿桿菌外毒素、蓖麻毒素（II期）；抗體與酶蛋白融合：也稱為抗體酶（abenzyme），前體藥物療法（ADEPT）；抗體與細(xì)胞因子融合：IL-2，免疫介導(dǎo)療法；2023/6/1186當(dāng)前第86頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)Fc-抗體融合蛋白具有與特定蛋白（ProteinA,ProteinG）結(jié)合的特點(diǎn)，便于檢測與純化；Fc介導(dǎo)的抗體效應(yīng)功能，如：ADCC、CDC及免疫調(diào)理作用；延長蛋白在血液中的半衰期；實(shí)例：CD4-Fc;CTLA4-Fc;TNFaR-Fc;VEGFR-Fc(VEGF-TRAP)2023/6/1187當(dāng)前第87頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2023/6/1188當(dāng)前第88頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)思考題一、名詞解釋1、可變區(qū)2、恒定區(qū)3、互補(bǔ)決定區(qū)4、功能區(qū)5、人—鼠嵌合抗體6、改形抗體7、Fab抗體8、Fv抗體9、單鏈抗體（scFv）10、單域抗體11、雙特異單鏈抗體（bisFvs）二、簡答1、簡述抗體的結(jié)構(gòu)與功能、抗體多樣性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。2、基因工程抗體有哪些類型？其特性有何不同？3、抗體融合蛋白有哪些類型，特征和設(shè)計(jì)策略是什么？試舉例說明。4、多價(jià)抗體特點(diǎn)？2023/6/1189當(dāng)前第89頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)

第四節(jié)噬菌體抗體庫技術(shù)抗體研究的三個(gè)階段：①以1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素為代表，其特點(diǎn)是用抗原免疫動(dòng)物來獲得多克隆抗體；②以1975年K?hler創(chuàng)建雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體為代表；③以1994年Winter以基因工程方法制備抗體為代表?？贵w研究領(lǐng)域的一次技術(shù)革命，完全用基因工程技術(shù)制備人源化抗體，還能利用基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)技術(shù)，通過細(xì)菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)抗體。在此基礎(chǔ)上發(fā)展成抗體工程。Winter創(chuàng)建了噬菌體抗體庫（Repertoireofantibodiesdisplayedonphages）技術(shù),克服了人體不能隨意免疫的缺點(diǎn)，用人外周血制備抗體文庫，從而獲得人源性基因工程抗體。當(dāng)前第90頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)將蛋白分子或多肽基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中，使噬菌體表面表達(dá)該異源分子，稱為噬菌體展示。將B細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆，插入絲狀噬菌體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化工程菌進(jìn)行表達(dá)，在噬菌體表面形成噬菌體抗體的群體，即為噬菌體抗體庫（surfacedisplayantibodylibrary）。噬菌體展示抗體庫技術(shù)當(dāng)前第91頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)用PCR擴(kuò)增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因（獲取目的基因）克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面（載體構(gòu)建）用抗原抗體反應(yīng)篩選出表達(dá)所需要抗體的克隆并擴(kuò)增。（淘篩和鑒定）使抗體基因以分泌的方式表達(dá)，篩選可溶性的抗體片段。抗體庫：組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機(jī)組合人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經(jīng)免疫的正常人一、基本原理和程序當(dāng)前第92頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)噬菌體抗體庫當(dāng)前第93頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)絲狀噬菌體基因基因編碼產(chǎn)物功能gIpI噬菌體裝配gIIpII噬菌體基因組復(fù)制gIIpIII尾端外殼蛋白，與F因子結(jié)合gIVpIV噬菌體裝配gVpV噬菌體基因組復(fù)制gVIpVI外殼蛋白，末端“塞子”gVIIpViI外殼蛋白，高度疏水，組裝起始信號gVIIIpVIII主要外殼蛋白gIXpIX外殼蛋白，高度疏水，末端“塞子”gXpXgIII啟動(dòng)子激活蛋白當(dāng)前第94頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第95頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第96頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點(diǎn)外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導(dǎo)系列的緊靠下游隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段當(dāng)前第97頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫。使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的質(zhì)周腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)前第98頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)1、獲取目的基因：提取RNA，經(jīng)RT-PCR獲取抗體某一特定基因區(qū)段。

2、抗體庫技術(shù)的載體：普遍使用噬菌粒（phagemid）載體。

3、淘篩（panning）：用固相化抗原對表達(dá)產(chǎn)物的載體進(jìn)行淘篩，淘汰非目的克隆，使目的克隆大量擴(kuò)增。

4、表達(dá)與鑒定：目的克隆經(jīng)過鑒定后，再導(dǎo)入感受態(tài)菌珠，進(jìn)行可溶性表達(dá)，其產(chǎn)物用Westernblot分析確定后，就完成了全過程。噬菌體抗體庫技術(shù)的基本方法小結(jié)當(dāng)前第99頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)二、噬菌體抗體庫技術(shù)的特點(diǎn)1、模擬天然全套抗體庫抗體文庫可以達(dá)到或超過1011庫容，所以能包含B細(xì)胞全部克隆。建庫的外源基因來自人體外周血、骨髓或脾臟的淋巴細(xì)胞提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA擴(kuò)增，這是人體多克隆細(xì)胞的總mRNA。使用的通用引物采自多個(gè)人體，具有人的種屬普遍性?？贵w的VH和VL基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性。當(dāng)前第100頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2、避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)由于抗體庫的大容量和極高的篩選效率，使得可以調(diào)出任意抗體基因，用基因工程方法制備抗體，因而能避免使用人工免疫動(dòng)物和細(xì)胞融合技術(shù)。3、可獲得高親和力的人源抗體在噬菌體抗體庫技術(shù)中，VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程，所用的抗體基因又來自人體，因此，所產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的人源化抗體。當(dāng)前第101頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來;可繞過雜交瘤技術(shù)，不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù);抗體基因篩選的范圍廣;技術(shù)穩(wěn)定、可靠、生產(chǎn)周期短;可規(guī)?；a(chǎn);適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機(jī)多肽等的生產(chǎn)。該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):當(dāng)前第102頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)

噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。它簡單易行，篩選容量大，效率高，繞過了細(xì)胞融合及免疫等步驟，而且在表型一基因型的統(tǒng)一和識別一增殖過程上模擬了B細(xì)胞的成熟過程，從而在實(shí)際應(yīng)用上具有很大意義。使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達(dá)106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。當(dāng)前第103頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)

第六節(jié)抗體治療藥物

自第一個(gè)抗體藥物批準(zhǔn)上市以來，已被成功用于治療腫瘤、自身免疫疾病等多種“疑難雜癥”，截止2012年6月，美國FDA批準(zhǔn)28種抗體藥物，抗腫瘤占53.8%，免疫性疾病：19.2%、器官移植11.5%、感染性疾病7.7%、心血管疾病3.8%、其他3.8%。當(dāng)前第104頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)商業(yè)化的抗體藥物2023/6/111055個(gè)靶標(biāo)的抗體仿制藥開發(fā)是熱點(diǎn):CD20，HER2，EGFR,VEGF,TNF-alpha當(dāng)前第105頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2023/6/11106VEGFTargetAnti-VEGFStrategy當(dāng)前第106頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)HER2signalingpathwayandAnti-HER2Strategy當(dāng)前第107頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)108CombinationstrategiestopotentiatecellularresponseandovercomeresistanceNancyE.Hynes

andHeidiA.Lane.ERBBreceptorsandcancer:thecomplexityoftargetedinhibitors.NatRevCancer.2005;5:341-354.當(dāng)前第108頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2013年全球生物藥品銷售額前10名NO.DrugCompanySale(billion$)IndicationTarget1Humira(adalimumab)AbbVie&Eisai11.00RATNF2EnbrelAmgen8.76RA、牛皮癬TNF3RemicadeJ&J8.37RA、Crohn’sTNF4Lantus(insulinglargine)Sanofi7.95I/II型糖尿病/5RituxanBiogen-IDEC7.91Non-Hopkin’sLymphomaCD206AvastinRoche/Genentech6.97結(jié)腸癌，NSCLCVEGF7HerceptinRoche/Genentech6.91乳腺癌，胃癌HER28NeulastaAmgen4.39白細(xì)胞減少癥/9LucentisRoche/Genentech,Novartis4.27AMDVEGF10EpogenAmgen3.35貧血及癌癥化療引起貧血/當(dāng)前第109頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)2013年14個(gè)抗體藥物銷售過10億美元2023/6/11110110.265.687.7683.867567.51當(dāng)前第110頁\共有116頁\編于星期六\18點(diǎn)抗體藥物分類抗體或抗體片段（小分子抗體藥物）抗體融合蛋白抗體偶聯(lián)物或免疫偶聯(lián)物2023/6/11111抗體與放射性同位素偶聯(lián)抗體與抗癌化學(xué)藥物偶聯(lián)抗體與免疫毒素偶聯(lián)當(dāng)前第1