酶工程酶的生產(chǎn)和純化演示文稿

酶工程酶的生產(chǎn)和純化演示文稿2023/6/121當(dāng)前第1頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)2023/6/122（優(yōu)選）酶工程酶的生產(chǎn)和純化當(dāng)前第2頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)合適的酶源？一級生物？足夠酶產(chǎn)量？細(xì)胞是否穩(wěn)定？易于后處理？成本高低？純化能否成功？篩選新酶源有機(jī)體中轉(zhuǎn)入新基因傳統(tǒng)/基因技術(shù)提高產(chǎn)量改進(jìn)發(fā)酵條件改進(jìn)后處理：減少費(fèi)用和浪費(fèi)；提高純度更具競爭力、更廉價(jià)的目標(biāo)酶當(dāng)前第3頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)Contentsofchapter22.2酶的生產(chǎn)及提高酶產(chǎn)量的措施2.3酶的下游處理GoGoGo2.1酶源當(dāng)前第4頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)2.1酶源當(dāng)前第5頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)動植物組織動植物細(xì)胞野生微生物重組微生物Enzymesource12%88%當(dāng)前第6頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)-淀粉酶(曲霉)葡萄糖淀粉酶(曲霉，根霉)果膠酶/果膠裂合酶(曲霉)乳糖酶(曲霉，克魯維酵母)蔗糖酶/葡聚糖酶(酵母)微生物凝乳酶(毛霉)葡聚糖酶(青霉)/-淀粉酶(芽孢桿菌)青霉素酰胺酶(芽孢桿菌)支鏈淀粉酶(克雷伯菌/芽孢桿菌)木糖異構(gòu)酶(芽孢桿菌/鏈霉菌)天冬酰胺酶(大腸桿菌)DNA連接酶(大腸桿菌)過氧化氫酶(肝臟)胰蛋白酶(胰臟)胰凝乳蛋白酶(胰臟)三脂酰甘油脂肪酶(胰臟)凝乳酶（胃）獼猴桃蛋白酶/-淀粉酶(麥芽)脂肪加氧酶(大豆)-葡聚糖酶(麥芽)無花果蛋白酶工業(yè)酶生產(chǎn)所用的原料細(xì)菌真菌植物動物當(dāng)前第7頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)微生物產(chǎn)酶之優(yōu)點(diǎn)

微生物種類繁多產(chǎn)酶種類齊全生長周期短繁殖快不受季節(jié)氣候限制培養(yǎng)基來源豐富產(chǎn)酶成本低易變異，用遺傳技術(shù)培育高產(chǎn)理想菌株培養(yǎng)簡便易行易管理、工廠化生產(chǎn)當(dāng)前第8頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)安全無毒，非致病菌周期短，產(chǎn)量高遺傳性能穩(wěn)定，不易退化易于酶分離純化易培養(yǎng)，廉價(jià)易得產(chǎn)酶菌種的要求新產(chǎn)酶菌種需毒理和動物實(shí)驗(yàn)，食品和醫(yī)藥酶需經(jīng)有關(guān)部門批準(zhǔn)。當(dāng)前第9頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)一般產(chǎn)胞內(nèi)酶主要的酶品種谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、青霉素?；傅然蚬こ滩僮髅福合拗菩詢?nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等大腸桿菌（E.coli）當(dāng)前第10頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)能產(chǎn)生多種胞外酶主要酶品種淀粉酶類：如-淀粉酶（胞外）蛋白酶類：如中性蛋白酶（胞外）磷酸酶類：堿性磷酸酶（細(xì)胞間質(zhì)）、5’-核苷酸酶等枯草桿菌（B.subtilis）當(dāng)前第11頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)鏈霉菌（Streptomyces）主要酶品種葡萄糖異構(gòu)酶、青霉素酰化酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、堿性/中性蛋白酶等含有豐富的16-羥化酶，用于甾體轉(zhuǎn)化當(dāng)前第12頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)黑曲霉（Aspergillusniger）可生產(chǎn)多種酶（胞內(nèi)酶或胞外酶）主要酶品種糖化酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纖維素酶等當(dāng)前第13頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)廣泛應(yīng)用于釀造和食品行業(yè)主要酶品種糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶、氨基?；浮⒘姿岫ッ?、核酸酶等米曲霉（Aspergillusoryzae）當(dāng)前第14頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)菌落成熟后產(chǎn)紅色色素，顏色較深腐生真菌，能耐受pH3.5和10%酒精，尤嗜乳酸主要酶品種-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、麥芽糖酶、酯酶等紅曲霉屬（Monascus）當(dāng)前第15頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)腐生真菌，存在于空氣中及腐爛的物質(zhì)表面主要菌種和酶的種類產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum）葡萄糖氧化酶、纖維素酶、果膠酶、青霉素酰化酶等橘青霉（Penicilliumcitrinum）脂肪酶、葡萄糖氧化酶、5’-磷酸二酯酶、核酸酶等青霉屬（Penicillium）當(dāng)前第16頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)青霉屬（Penicillium）當(dāng)前第17頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)主要酶種類纖維素酶亦用于生產(chǎn)17-羥化酶，用于甾體轉(zhuǎn)化木霉（Trichoderma）綠色木霉(T.viride)的菌落哈茨木霉(T.harzianum)的顯微形態(tài)當(dāng)前第18頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)主要產(chǎn)酶品種糖化酶、蔗糖酶、堿性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等具有11-羥化酶，用于甾體藥物轉(zhuǎn)化根霉（Rhizopus）當(dāng)前第19頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)能糖化淀粉，能分解大豆蛋白，多用來做豆腐乳、豆豉主要產(chǎn)酶品種蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等毛霉（Mucor）當(dāng)前第20頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，細(xì)胞呈圓形、卵形、橢圓形，在麥芽汁培養(yǎng)基上菌落白色有光澤主要產(chǎn)酶品種醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、轉(zhuǎn)化酶等啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）當(dāng)前第21頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)細(xì)胞呈圓形、卵形或長形，出芽成假菌絲，在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落乳白色或奶油色主要產(chǎn)酶品種脂肪酶、尿酸酶、轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶、17-羥化酶、具烷類代謝的酶系等假絲酵母屬（Candida）當(dāng)前第22頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)美國食品加工酶及菌種數(shù)目中國食品加工酶及菌種數(shù)目當(dāng)前第23頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)Howto

Screen

NewEnzymes？采樣產(chǎn)酶菌種篩選產(chǎn)酶菌種改良富集培養(yǎng)，菌種分離當(dāng)前第24頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)為獲得降解某種物質(zhì)的產(chǎn)酶菌種，通常在該物質(zhì)較豐富的地方尋找。a.采樣當(dāng)前第25頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)木質(zhì)素酶or纖維素酶

尿酸酶污染物降解酶

當(dāng)前第26頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)嗜熱酶thermophilicenzyme

嗜冷酶psychrophilicenzyme

嗜酸/嗜堿酶acidphilic/alkaliphilicenzyme

嗜鹽酶halophilicenzyme

極端酶當(dāng)前第27頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)b.產(chǎn)酶菌種篩選對分離出的菌種做產(chǎn)酶能力檢測，選出理想產(chǎn)酶菌株，包括初篩和復(fù)篩兩個(gè)階段。初篩：挑出產(chǎn)目的酶的菌株，方法快速、簡便，多采用平板培養(yǎng)透明圈法。復(fù)篩：篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合要求的菌株，方法更準(zhǔn)確，培養(yǎng)方式更符合工業(yè)生產(chǎn)，搖瓶/固體培養(yǎng)。當(dāng)前第28頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)以淀粉為碳源，在含KI-I2的淀粉培養(yǎng)基上，菌落周圍因分泌出的-淀粉酶將淀粉水解而導(dǎo)致藍(lán)色消失，生成“水解圈”。例：-淀粉酶生產(chǎn)菌的篩選當(dāng)前第29頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)在培養(yǎng)基中添加酪蛋白，經(jīng)蛋白酶的水解，培養(yǎng)基相應(yīng)位置變?yōu)槌吻宓摹八馊Α?。例：蛋白酶生產(chǎn)菌的篩選當(dāng)前第30頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)c.產(chǎn)酶菌種改良原菌株細(xì)胞或孢子懸浮液制備誘變劑處理中間培養(yǎng)初篩復(fù)篩突變株分離生產(chǎn)性實(shí)驗(yàn)誘變育種目的基因獲取基因表達(dá)載體構(gòu)建目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因檢測與鑒定基因工程育種當(dāng)前第31頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)23145案例：纖維素酶高產(chǎn)菌誘變育種出發(fā)菌株選擇菌懸液的制備斜面培養(yǎng)基30℃2-4d;斜面孢子搖瓶振20min;過濾稀釋至105-107個(gè)/mL菌懸液出發(fā)菌株黑曲霉LH24纖維素酶活力平均12030U/g紫外線誘變處理5mL菌懸液紫外燈30W距30cm,照射1min，打開培養(yǎng)皿照射5min，暗冷藏1-2h誘變菌液于培養(yǎng)基平板,篩出生長良好菌株發(fā)酵,得9株高產(chǎn)株,產(chǎn)酶量14000U/g初篩復(fù)篩初篩菌株接種到培養(yǎng)液,3h后測酶活復(fù)篩，得3株產(chǎn)酶量>16000U/g

4當(dāng)前第32頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)案例：高產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的基因工程育種12345按nanA基因設(shè)計(jì)合成引物;PCR擴(kuò)增nanA基因酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒;連接轉(zhuǎn)化培養(yǎng);凝膠電泳重組質(zhì)粒構(gòu)建PCR擴(kuò)增基因基因誘導(dǎo)表達(dá)將陽性克隆培養(yǎng);接種于LB培養(yǎng)基;誘導(dǎo)表達(dá)離心收集菌體;取上清SDS–PAGE電泳;酶表達(dá)量凝膠電泳分析NPL活力測定酶促反應(yīng);580nm測吸光度;工程菌酶活提高當(dāng)前第33頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)d.富集培養(yǎng)，菌種分離菌種分離：自然條件下各類微生物混雜，須分離獲得純種。通常采用平板劃線法和反復(fù)稀釋法。

富集培養(yǎng)：通常樣品中所需菌很少，需使所需菌大量生長，不需菌少或不生長，以利于篩選?？煽刂茰囟?、pH，或用底物作營養(yǎng)成分，使所需菌快速生長。當(dāng)前第34頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)2.2酶的生產(chǎn)及提高酶產(chǎn)量的措施當(dāng)前第35頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)HOW

AREINDUSTRIALENZYMESMADE？當(dāng)前第36頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)SeedfermenterAirpetridishflaskFood&NutrientsCellRomovalCellstoCompostingConcentrationPurificaitonModificationpreservativesBlendingDrying

HeatLiquids

PowdersShiptocustomersAirLargefermenterRefinningProductionDownstream當(dāng)前第37頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)案例：枯草桿菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶菌種斜面搖瓶培養(yǎng)種子罐發(fā)酵罐發(fā)酵液低溫離心超濾濃縮低溫沉淀離心真空抽干粉碎成品碳源：麥芽糖,木糖,蔗糖(1.5-4%)或麥芽汁+酵母膏(0.1-2%)氮源：大豆蛋白胨、豆餅粉(2-5%質(zhì)量比)或豆?jié){無機(jī)鹽：

KH2PO4

(0.1%),K2HPO4

(0.3%),MgSO4

(0.05%),

CaCl2

(0.02%)發(fā)酵罐：通氣量/min1:0.5~1:1(V/V),攪拌200-400r/min，罐溫36.5-37.5℃,罐壓當(dāng)前第38頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)WhatFactorsAffectEnzymeProduction？當(dāng)前第39頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)CulturemediumpHTemperatureDissolvedO2

etc.Fermentationprocess

Biosynthesisprocess

當(dāng)前第40頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)2.2.1酶生物合成的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯中的生物調(diào)節(jié)RNA的生物合成——轉(zhuǎn)錄中的生物調(diào)節(jié)（基因調(diào)節(jié)）當(dāng)前第41頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)當(dāng)前第42頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)a.大腸桿菌生產(chǎn)——半乳糖苷酶，-半乳糖苷酶，硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶E.Coligrwonin

glucosemedium，E.Coli

grwonin

lactosemedium，

b.大腸桿菌生產(chǎn)——色氨酸合成酶E.Coligrwonin

glucosemedium，E.Coli

grwonin

glucosemediumadding

tryptophan，Why？

c.大腸桿菌生長E.Coligrwonin

glucoseandlactosemedium———“biphasicgrowth”葡萄糖耗盡后才利用乳糖，兩個(gè)對數(shù)生長期當(dāng)前第43頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA

阻遏蛋白（有活性）基因關(guān)閉啟動子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa

阻遏蛋白（無活性）基因表達(dá)mRNAa.酶的誘導(dǎo)：乳糖操縱子乳糖酶的誘導(dǎo)

乳糖

阻遏蛋白（有活性）-Galactosidase，permease，acetylase當(dāng)前第44頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物trp代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使構(gòu)象變化，與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)b.酶的反饋?zhàn)瓒簦荷彼岵倏v子當(dāng)前第45頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)c.酶的分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達(dá)CAP基因結(jié)構(gòu)基因TCAPOCAP結(jié)合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系cAMPcAMP：環(huán)腺苷酸；CAP：環(huán)腺苷酸受體蛋白或降解物基因活化蛋白降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)當(dāng)前第46頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)酶的誘導(dǎo)和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑A.有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑當(dāng)前第47頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)調(diào)控方式阻遏蛋白添加物與操縱基因結(jié)合阻遏效應(yīng)舉例酶的誘導(dǎo)有活性－＋不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯誘導(dǎo)物－轉(zhuǎn)錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶的阻遏無活性－阻遏物＋不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對比當(dāng)前第48頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)3水解4蛋白質(zhì)水解2阻遏作用1Addinducer2Controlrepression3ReducemRNAhydrolysis1誘導(dǎo)活化5形成包含體6缺少輔因子4Reduceproteasesorincreasechaperon5ReduceproteinsynthesisbyT6Increasecofactorsynthesis當(dāng)前第49頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)2.2.2酶發(fā)酵過程的控制

2.2.2.3.發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響2.2.2.2.發(fā)酵產(chǎn)酶動力學(xué)2.2.2.1.酶生物合成的模式GoGoGo當(dāng)前第50頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)2.2.2.1.酶生物合成的模式微生物細(xì)胞生長曲線（四階段）0-A調(diào)整期（延遲期）A-B生長期（對數(shù)生長期）B-C平衡期C-D衰退期總細(xì)胞濃度活細(xì)胞濃度當(dāng)前第51頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)時(shí)間細(xì)胞/酶濃度時(shí)間細(xì)胞/酶濃度時(shí)間細(xì)胞/酶濃度時(shí)間細(xì)胞/酶濃度同步合成型延續(xù)合成型中期合成型滯后合成型酶的生物合成模式

—根據(jù)酶產(chǎn)生與細(xì)胞生長的關(guān)系細(xì)胞濃度酶濃度當(dāng)前第52頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)酶的生物合成與細(xì)胞生長同步進(jìn)行（生長偶聯(lián)型）大部分組成酶和部分誘導(dǎo)酶屬于此類。酶對應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定時(shí)間細(xì)胞/酶濃度A.同步合成型組成酶：細(xì)胞中一直存在的酶，其合成僅受遺傳物質(zhì)控制。在細(xì)胞中的量比較恒定，環(huán)境因素影響不大。誘導(dǎo)酶：在環(huán)境中有誘導(dǎo)物存在時(shí)而產(chǎn)生的酶，其合成取決于基因控制和環(huán)境影響。在細(xì)胞中含量變化很大。細(xì)胞濃度酶濃度當(dāng)前第53頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)例：米曲霉在含有單寧或沒食子酸的培養(yǎng)基中生產(chǎn)單寧酶[tanaseEC3.1.1.20]細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細(xì)胞濃度活細(xì)胞濃度胞外酶濃度胞內(nèi)酶濃度當(dāng)前第54頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)酶合成隨細(xì)胞生長而開始，細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶能延續(xù)合成一段時(shí)間。屬此類的酶可以是組成酶，也可以是誘導(dǎo)酶。酶所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性好。時(shí)間細(xì)胞/酶濃度B.延續(xù)合成型細(xì)胞濃度酶濃度當(dāng)前第55頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)例：黑曲霉在以半乳糖醛酸或純果膠為單一碳源的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)產(chǎn)生聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，）細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導(dǎo)物細(xì)胞濃度酶濃度當(dāng)前第56頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)酶合成在細(xì)胞生長一段時(shí)間后才開始，細(xì)胞進(jìn)入平衡期后酶的合成隨之停止酶合成受產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒艋蚍纸獯x物阻遏作用酶所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性較差時(shí)間細(xì)胞/酶濃度C.中期合成型細(xì)胞濃度酶濃度當(dāng)前第57頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)例：枯草桿菌堿性磷酸酶[EC3.1.3.1]受其水解產(chǎn)物磷酸的反饋?zhàn)瓒糇饔眉?xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細(xì)胞濃度酶濃度當(dāng)前第58頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)當(dāng)細(xì)胞生長一段時(shí)間或進(jìn)入平衡期后，才開始合成并大量積累酶。許多水解酶屬于此類。阻遏物延緩了酶的合成。此類酶mRNA穩(wěn)定性好。時(shí)間細(xì)胞/酶濃度D.滯后合成型細(xì)胞濃度酶濃度當(dāng)前第59頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)例：黑曲霉生產(chǎn)羧基蛋白酶[EC3.4.23.6]細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細(xì)胞濃度酶濃度當(dāng)前第60頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)酶的生物合成模式總結(jié)關(guān)鍵因素酶對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性培養(yǎng)基中是否存在阻遏物延續(xù)合成型是最理想的合成模式通過基因工程、代謝工程、細(xì)胞工程等手段，篩選優(yōu)良菌株，使合成模式接近延續(xù)合成型mRNA穩(wěn)定性阻遏物當(dāng)前第61頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)2.2.2.2.發(fā)酵產(chǎn)酶動力學(xué)產(chǎn)酶動力學(xué)主要研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境因素對產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律。宏觀產(chǎn)酶動力學(xué)：從整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)著眼，研究群體細(xì)胞的產(chǎn)酶速率微觀產(chǎn)酶動力學(xué)：從細(xì)胞內(nèi)部著眼，研究細(xì)胞中酶合成速率當(dāng)前第62頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)宏觀產(chǎn)酶動力學(xué)表明，產(chǎn)酶速率與細(xì)胞比生長速率

、細(xì)胞濃度以及細(xì)胞產(chǎn)酶模式有關(guān)。式中X——細(xì)胞濃度(g/L)

——細(xì)胞比生長速率(h-1) ——生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)(IU/g) ——非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率(IU/(gh))E——酶濃度(IU/L)t——時(shí)間(h)產(chǎn)酶動力學(xué)方程：當(dāng)前第63頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)生長偶聯(lián)型（同步/中期合成型）部分生長偶聯(lián)型(滯后合成型)非生長偶聯(lián)型(延續(xù)合成型)

當(dāng)前第64頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)2.2.2.3.發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響A.細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)B.培養(yǎng)基C.pH值D.溫度E.溶解氧當(dāng)前第65頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)A.細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)菌種保藏：短期保藏、長期保藏菌種活化：使用前接種于新鮮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)以恢復(fù)細(xì)胞生命活動能力擴(kuò)大培養(yǎng)：為保證發(fā)酵時(shí)有足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞，活化細(xì)胞要經(jīng)一級至數(shù)級擴(kuò)大培養(yǎng)一般培養(yǎng)到細(xì)胞處于對數(shù)生長期為宜采用孢子接種，則應(yīng)培養(yǎng)至孢子成熟期當(dāng)前第66頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)培養(yǎng)基的組成碳源、氮源、水、無機(jī)鹽、生長因子……根據(jù)微生物種類和生長條件確定培養(yǎng)基，同種細(xì)胞用于不同的酶生產(chǎn)，培養(yǎng)基成分不一樣生長、增殖、發(fā)酵、產(chǎn)酶等各階段所需有區(qū)別種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基不一樣盡量減少培養(yǎng)基中對產(chǎn)酶的阻遏作用的物質(zhì)B.培養(yǎng)基的影響當(dāng)前第67頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)pH值對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響影響酶解離、電荷分布、構(gòu)象和酶活、膜通透性、底物和產(chǎn)物的性質(zhì)改變酶之間的產(chǎn)量比例產(chǎn)酶最適pH值：通常接近酶反應(yīng)最適pH值，但一般不同于細(xì)胞生長的最適pH值pH的變化：隨細(xì)胞生長培養(yǎng)基pH會發(fā)生變化pH的調(diào)控：培養(yǎng)基組分、比例、緩沖液、酸堿、補(bǔ)料C.pH值的調(diào)節(jié)和控制當(dāng)前第68頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)產(chǎn)酶溫度產(chǎn)酶溫度往往低于生長溫度較低溫度mRNA穩(wěn)定性較高，延續(xù)酶的合成溫度過低微生物代謝減慢，延長發(fā)酵周期溫度的變化因細(xì)胞新陳代謝和熱量擴(kuò)散，溫度不斷變化溫度的調(diào)節(jié)熱水升溫冷水降溫D.溫度的調(diào)節(jié)和控制當(dāng)前第69頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)KO2

——

耗氧速率，指單位時(shí)間內(nèi)單位體積培養(yǎng)液中細(xì)胞的耗氧量，(mmolO2)·h-·L-1QO2

——

細(xì)胞呼吸強(qiáng)度，指單位細(xì)胞量在單位時(shí)間內(nèi)的耗氧量，(mmolO2)·h-1·(gDC)-1Ccell

——

細(xì)胞濃度，單位體積培養(yǎng)液中細(xì)胞質(zhì)量，(gDC)·L-1E.溶解氧的調(diào)節(jié)控制

Kd

——溶氧速率（溶氧系數(shù)），單位體積發(fā)酵液在單位時(shí)間溶解氧的量，(mmolO2)·h-1·L-1當(dāng)Kd=KO2時(shí)，培養(yǎng)液中溶氧量保持恒定當(dāng)前第70頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)溶氧量的調(diào)節(jié)方法通氣量：增大通氣量提高KdO2

分壓：提高O2

分壓，可增加O2

溶解度，提高Kd氣液接觸時(shí)間：延長接觸時(shí)間，可增加O2

溶解量氣液接觸面積：增大接觸面積能提高Kd培養(yǎng)液黏度：黏度大易產(chǎn)生泡沫，影響O2溶解當(dāng)前第71頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)HowtoImproveEnzymeOutput？當(dāng)前第72頁\共有83頁\編于星期一\15點(diǎn)2.2.3.1.添加誘導(dǎo)物對于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵過程中的某個(gè)適宜的時(shí)機(jī)，添加適宜的誘導(dǎo)物，可以顯著提高酶的產(chǎn)量。例如，乳糖誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導(dǎo)蔗糖酶的生物合成等。誘導(dǎo)物一般可以分為3類酶的作用底物酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物作用底物的類似物2.2