藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證詳解演示文稿

藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證()詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（優(yōu)選）藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證()當(dāng)前第2頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)當(dāng)前第3頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證的目的是證明采用的方法適合于相應(yīng)樣品分析的要求。在建立藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證；藥品生產(chǎn)工藝變更、制劑的組分改變或原分析方法進(jìn)行修訂時，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法也需要驗(yàn)證。方法驗(yàn)證過程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品標(biāo)準(zhǔn)起草或修訂說明中。當(dāng)前第4頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證（續(xù)1）需驗(yàn)證的分析項(xiàng)目有：鑒別試驗(yàn)；雜質(zhì)定量或限度檢查；原料藥或制劑中有效成分的含量測定；以及制劑中其他組份（如防腐劑等）的測定。藥品溶出度、釋放度等檢查中，其溶出量等的測試也要做驗(yàn)證。當(dāng)前第5頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證（續(xù)2）驗(yàn)證內(nèi)容有：準(zhǔn)確度；精密度（包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）專屬性檢測限、定量限線性、范圍耐用性等。當(dāng)前第6頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)一、準(zhǔn)確度（Accuracy）準(zhǔn)確度是指用該方法測定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般用回收率(%)表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的“范圍”內(nèi)測試?！胺秶敝傅氖谴_定的測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。用于定量測定的分析方法均需做準(zhǔn)確度驗(yàn)證當(dāng)前第7頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)一、準(zhǔn)確度（續(xù)1）（一）含量測定方法1、原料藥的測定原料藥可用已知純度的對照品或供試品進(jìn)行測定；或用本法測定供試品的結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。計算公式：當(dāng)前第8頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)一、準(zhǔn)確度（續(xù)2）如果該分析方法已經(jīng)測試，并求得其精密度、線性和專屬性，在準(zhǔn)確度可以推算出來的情況下，準(zhǔn)確度可以不用再驗(yàn)證。2、制劑的含量測定主要測試制劑中其他組份及輔料對含量測定方法的影響?？捎煤阎勘粶y物的制劑各組分（包括制劑輔料）進(jìn)行測定。計算公式同原料藥的方法。當(dāng)前第9頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)一、準(zhǔn)確度（續(xù)3）如果不能獲得制劑的全部組分，則可向制劑中加入已知量的被測物進(jìn)行測定，回收率計算公式為：中藥分析回收率測定常采用此法，一般要求在95～105%之間。若有些方法操作步驟繁多，可要求在90～110%。RSD一般在3%以內(nèi)。當(dāng)前第10頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)一、準(zhǔn)確度（續(xù)4）制劑含量測定時要考慮輔料的影響，要盡量除去輔料的空白影響。制劑分析中，要求從自行制定的模擬樣品開始，要求至少高、中、低三個濃度，每個濃度3份樣品，共9個數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。一般儀器分析要求回收率的RSD為2%之內(nèi)，而容量分析要可達(dá)到99.7～100.3%。對于生物樣品分析，要求可以適當(dāng)放寬當(dāng)前第11頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)一、準(zhǔn)確度（續(xù)5）（二）雜質(zhì)含量測定方法多采用色譜法?；厥章实臏y定可通過向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測試。當(dāng)前第12頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)一、準(zhǔn)確度（續(xù)6）（三）數(shù)據(jù)要求在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9個測定結(jié)果進(jìn)行評價。如設(shè)3個不同濃度，每個濃度分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測定。應(yīng)報告已知加入量的回收率（%）計算值，或測定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）或可信限。當(dāng)前第13頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)當(dāng)前第14頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)二、精密度（Precision）精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。一般至少用6次結(jié)果進(jìn)行評價精密度。精密度是考察分析方法在不同的時間、操作人員、實(shí)驗(yàn)室等所得結(jié)果的重現(xiàn)性和重復(fù)性。涉及含量測定的項(xiàng)目（含量測定和雜質(zhì)定量）都需要驗(yàn)證精密度。當(dāng)前第15頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)當(dāng)前第16頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)二、精密度（續(xù)1）偏差（d）：測量值與平均值之差標(biāo)準(zhǔn)（偏）差（SD或S）相對標(biāo)準(zhǔn)（偏）差（RSD）當(dāng)前第17頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)二、精密度（續(xù)2）（一）驗(yàn)證內(nèi)容精密度驗(yàn)證包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性1、重復(fù)性：在較短時間間隔內(nèi)，在相同操作條件下，由同一分析人員測定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性，也稱批內(nèi)精密度。測定時，可采用3個不同濃度，每個濃度3份供試品，共9個數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。也可以采用同一個濃度，用6個數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。當(dāng)前第18頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)二、精密度（續(xù)3）2、中間精密度在同一實(shí)驗(yàn)室，由于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部條件的改變，如不同時間、不同分析人員，用不同設(shè)備測定所得結(jié)果的精密度，稱為中間精密度。3、重現(xiàn)性在不同實(shí)驗(yàn)室，由不同分析人員測定結(jié)果的精密度，稱為重復(fù)性。重現(xiàn)性只有當(dāng)方法被法定標(biāo)準(zhǔn)采納時需要做當(dāng)前第19頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)當(dāng)前第20頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)三、專屬性（Specificity）專屬性是指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在情況下，采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性。能反映該方法在有共存物時對供試物準(zhǔn)確而專屬的測定能力，也是用于復(fù)雜樣品分析時相互干擾程度的度量。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測定等均應(yīng)考察專屬性。如果方法的專屬性不夠好，需要采用多個方法進(jìn)行補(bǔ)充。當(dāng)前第21頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)當(dāng)前第22頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)三、專屬性（續(xù)1）（一）鑒別反應(yīng)應(yīng)能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)分。不含被測成分的供試品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，均應(yīng)成負(fù)反應(yīng)。（二）含量測定和雜質(zhì)測定應(yīng)用色譜法時，應(yīng)附代表性圖譜并應(yīng)標(biāo)明諸成分在圖中的位置，以說明專屬性，其中分離度應(yīng)符合要求（>1.5）。當(dāng)前第23頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)三、專屬性（續(xù)2）對于可獲得雜質(zhì)情況下，可通過加入雜質(zhì)的方式，看雜質(zhì)是否可得到有效分離。對于雜質(zhì)不能獲得的情況，可與其他已經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行比較。必要時采用光二極管陣列檢測和質(zhì)譜檢測，進(jìn)行純度檢查。當(dāng)前第24頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)當(dāng)前第25頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)四、檢測限（LimitOfDetection，LOD）檢測限是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量。反映了方法與儀器的靈敏度和噪音的大小，也表明樣品經(jīng)處理后空白值的高低。LOD是一種限度檢查效能指標(biāo)，無須準(zhǔn)確定量，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可藥品的鑒別試驗(yàn)和雜質(zhì)檢查方法均應(yīng)驗(yàn)證LOD當(dāng)前第26頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)四、檢測限（續(xù)1）（一）常用方法1、目視法用含已知濃度被測物的試樣進(jìn)行分析，目視確定能被可靠地檢測出的被測物最低濃度或量。該法通常為儀器分析法中LOD的確定。2、信噪比法用已知濃度的樣品信號與空白樣品的信號進(jìn)行比較。一般以信噪比S/N=3時確定LOD。當(dāng)前第27頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)當(dāng)前第28頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)五、定量限（limitofquantitation，LOQ）LOQ是指樣品中被測物能被定量測定最低量，其測定結(jié)果應(yīng)該具有一定的準(zhǔn)確度和精密度。LOQ的方法與LOD相似，只是信噪比一般要大得多，其S/N=10。也可用儀器所測空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的10倍為估計值，再經(jīng)試驗(yàn)確定。當(dāng)前第29頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)六、線性（Linearity）線性系指在設(shè)計的“范圍”內(nèi)，測試結(jié)果（響應(yīng)值）與樣品中被測物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。應(yīng)在規(guī)定的“范圍”內(nèi)測定線性關(guān)系?？捎靡毁A備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列供試樣品的方法進(jìn)行測定，至少制備5個濃度的樣品。以測得的響應(yīng)值作為Y，藥物濃度為X，先作圖；然后用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析。必要時，將響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)字換算后再計算。當(dāng)前第30頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)當(dāng)前第31頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)六、線性（續(xù)1）一般要求回歸方程的相關(guān)系數(shù)越接近于1，表明線性關(guān)系越好。但對于生物樣品來說，要求會低些。數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖。當(dāng)前第32頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)當(dāng)前第33頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)七、范圍（Range）范圍系指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定。對范圍也有不同要求：對原料藥和制劑，范圍為80～120%；制劑含量均勻度為70～130%，也可以根據(jù)劑型特點(diǎn)適當(dāng)選擇。如果規(guī)定了限度范圍，一般為上限的+20%到下限的-20%。當(dāng)前第34頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)七、范圍（續(xù)1）首先給定濃度范圍，即樣品濃度（或質(zhì)量）取值的最大和最小值，也是分析時樣品濃度（質(zhì)量）的上限和下限；線性指的是在給定范圍內(nèi)樣品測定信號與其濃度之間成正比的程度。一般以作圖的方式或者回歸方程的形式表示。線性與范圍一般不分開。當(dāng)前第35頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)八、耐用性（Robust）耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為使方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。開始研究分析方法時，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則應(yīng)在方法中寫明。指的是對于影響條件變化時的適應(yīng)程度，應(yīng)盡可能的寬松，有一定的緩沖能力。當(dāng)前第36頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)八、耐用性（續(xù)1）典型的變動因素有：被測溶液的穩(wěn)定性，樣品提取次數(shù)、時間等。液相色譜法中典型的變動因素有：流動相的組成和pH值，不同廠牌或不同批號的同類型色譜柱，柱溫，流速等。經(jīng)試驗(yàn)，應(yīng)說明小的變動能否通過設(shè)計的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，以確保方法有效。當(dāng)前第37頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)方法學(xué)驗(yàn)證的選擇精密度準(zhǔn)確度檢測限定量限專屬性線性范圍耐用性鑒別試驗(yàn)：

雜質(zhì)含量測定：

溶出度和藥物釋放度：

生物樣品含量測定：

雜質(zhì)限度檢查：原料藥主要成分含量測定：

制劑中主要成分含量測定：

當(dāng)前第38頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)第四節(jié)生物樣品分析方法的基本要求生物樣品的前處理非常重要，除少數(shù)情況下樣品經(jīng)簡單處理后進(jìn)行測定外，大部分情況下都需要對樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，即進(jìn)行分離、純化和富集等，必要時還需要對待測組分進(jìn)行衍生化處理，以滿足分析目的和定量分析方法的各種要求。當(dāng)前第39頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)一、常用樣品的種類、采集和貯藏生物樣品包括各種體液和組織，最常見的是血液樣品，其次是唾液和尿液，在做組織分布時組織樣品也很常用。（一）血樣（二）唾液（三）尿液當(dāng)前第40頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（一）血樣（Blood）血樣包括血漿、血清和全血。血藥濃度主要指血漿或血清中的藥物濃度，而不是全血中的藥物濃度。一般認(rèn)為，當(dāng)藥物在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)平衡時，血漿中的藥物濃度能夠反映藥物在體內(nèi)靶器官的濃度（但可反映多少呢？），因而常把血漿藥物濃度作為體內(nèi)藥物濃度的測定指標(biāo)。當(dāng)前第41頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（一）血樣（續(xù)1）血樣的采集：對于患者來說，通常采用靜脈取血方式；對于動物來說，可以采用更靈活的方式，如靜脈、動脈、心臟等。一般不能取太多血樣的制備：全血：取全血后，加入凝血劑（肝素、枸櫞酸鈉等）防止凝結(jié)，不進(jìn)行離心操作。當(dāng)前第42頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)當(dāng)前第43頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（一）血樣（續(xù)2）血漿（Plasma）的制備：將加了抗凝劑的全血混勻后，以2500～3000RPM離心5～10min，使得血漿與血細(xì)胞分離，其中的淡黃色上清液即為血漿。血清（Serum）的制備：將采集的血樣在室溫下放置0.5～1hr，帶血液凝固后，用玻璃棒輕輕剝離雪餅，然后以2000～3000RPM離心5～10min，分取上層的淡黃色液體即為血清。當(dāng)前第44頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)當(dāng)前第45頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（一）血樣（續(xù)3）血漿與血清相比，它們的藥物濃度測定值基本相同，但是血漿分離的比較快，而且制取的量約為全血的50%~60%（血清只為全血的20%~40%），多數(shù)研究者用血漿進(jìn)行分析測定。若血漿中含有的抗凝劑對藥物濃度測定有影響時，則應(yīng)使用血清樣品。血樣主要用于藥物動力學(xué)、生物利用度等研究及臨床治療藥物濃度監(jiān)測等需要知道相對確切藥物濃度的分析中。當(dāng)前第46頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（一）血樣（續(xù)4）血樣采取后，應(yīng)及時分離血漿和血清，否則血細(xì)胞破裂而發(fā)生溶血，導(dǎo)致藥物與各種蛋白等結(jié)合，致使無法測定。如果可以，最好及時分析血樣。若不能立即測定，需要放置試管中密塞保存。短期（一周內(nèi)）可放在冰箱中保存（4度左右），長期保存需在-20或-80度冷等保存。全血不宜低溫冷凍保存。當(dāng)前第47頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（二）唾液唾液的分泌量相對較大，而且其獲取較血液容易得多，而且有些藥物的唾液濃度與血漿濃度密切相關(guān)，所以有時也采用唾液進(jìn)行測定。唾液的采集應(yīng)在安靜狀態(tài)下，漱口15min后采集。采集后去掉泡沫部分，然后在3000RPM離心10min，取上清液使用。唾液采集后，應(yīng)在4度以下保存。在解凍時，需要充分?jǐn)噭蚝笫褂茫苊鉂舛炔痪鶆?。?dāng)前第48頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)當(dāng)前第49頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（三）尿液藥物的清除主要通過尿液排出。尿液中可存在藥物的原形、代謝物和綴合物等，濃度高，量大，采集方便。但尿液中藥物濃度變化較大。所以，其應(yīng)用的目的與血樣有區(qū)別，主要在藥物劑量回收、腎清除率、生物利用度以及藥物代謝等方面的研究。尿的主要成分是水、尿素和各種鹽類等。不宜長期放置，而且需要加入防腐劑保存。當(dāng)前第50頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)當(dāng)前第51頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（三）尿液（續(xù)1）尿液濃度與血漿濃度沒有明顯的相關(guān)性。受到腎功能的影響比較大。一般收集采用自然排尿的方式，包括時尿、晨尿等幾種形式。測量每次收集的尿液體積，分別或集中收集（集中收集應(yīng)測量總體積），加防腐劑后保存。當(dāng)前第52頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)二、生物樣品分析前處理技術(shù)生物樣品的前處理，需要考慮到如下幾方面：生物樣品的種類；被測物的性質(zhì)、存在形式和濃度范圍；所采用的測定方法。當(dāng)前第53頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)二、生物樣品分析前處理技術(shù)（續(xù)1）1、生物樣品的種類生物樣品的種類不同，需要進(jìn)行處理的過程也有差異。血漿和血清需要去除蛋白質(zhì)的干擾，使得藥物才蛋白質(zhì)結(jié)合物中釋放出來；唾液樣品相對簡單，離心去除粘蛋白即可；尿液常用酸或酶水解使得藥物從綴合物中分離出來。當(dāng)前第54頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)二、生物樣品分析前處理技術(shù)（續(xù)2）2、被測藥物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以及存在形式和濃度范圍等都對前處理有直接影響。藥物的酸堿性與溶解性涉及到藥物的萃取手段是否具有揮發(fā)性等可以考慮GC的分析；光譜特性和官能團(tuán)性質(zhì)涉及是否需要衍生化；濃度的高低也需要處理方法要求的高低等。當(dāng)前第55頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)二、生物樣品分析前處理技術(shù)（續(xù)3）3、采用的測定方法不同，對于樣品前處理的要求也不同。HPLC方法對于去除蛋白是必須要求的；樣品濃度的高低也決定去除蛋白的方法也不相同；GC對于是否需要制備衍生物有要求；光譜分析法則需要為純物質(zhì)，所以要求更高；放射免疫法的專屬性很高，對于樣品的處理也相對簡單得多。當(dāng)前第56頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（一）蛋白質(zhì)的去除目的：使得藥物從結(jié)合型變成游離型，便于分析；減少后續(xù)處理過程中萃取時的乳化現(xiàn)象；保護(hù)儀器性能，避免造成損失，延長壽命。常用方法：加入與水混溶的有機(jī)溶劑；加入中性鹽；加入強(qiáng)酸；加入含鋅鹽或銅鹽沉淀劑；酶解法。當(dāng)前第57頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（一）蛋白質(zhì)的去除（續(xù)1）1、加入與水相混溶的有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑的加入可以使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)部及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，從而使得藥物得以釋放出來。常用的有機(jī)溶劑有：乙腈、甲醇、丙酮和四氫呋喃等。常用的比例為：血漿/有機(jī)溶劑=1：1～1：3，可以去掉90%以上蛋白質(zhì)。用乙腈做沉淀劑效果較甲醇更好些。而離心時的速度需要達(dá)到10000RPM及其以上。當(dāng)前第58頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（一）蛋白質(zhì)的去除（續(xù)2）2、加入中性鹽：加入中性鹽，使得鹽濃度增加，蛋白質(zhì)脫水而沉淀。常用的中性鹽有：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽和枸櫞酸鈉等。常用比例為：血漿/飽和硫酸銨=1：2混合后，高速離心，可去除90%以上蛋白質(zhì)。常與有機(jī)溶劑萃取法聯(lián)用，以提高效率。當(dāng)前第59頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（一）蛋白質(zhì)的去除（續(xù)3）3、加入強(qiáng)酸：當(dāng)溶液的pH低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)為陽離子狀態(tài)，可與酸根陰離子結(jié)合而形成沉淀析出。常用的強(qiáng)酸有10%的三氯乙酸（或三氟乙酸）等，比例為血漿/強(qiáng)酸=1：0.6左右混合，高速離心后，可去除90%以上蛋白質(zhì)。當(dāng)前第60頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（一）蛋白質(zhì)的去除（續(xù)4）4、加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑：當(dāng)pH高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)分子中帶負(fù)電荷的羧酸與金屬陽離子形成不溶性沉淀常用的沉淀劑有：CuSO4和ZnSO4等，混合的比例為血漿/沉淀劑=1：2，然后高速離心。當(dāng)前第61頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（一）蛋白質(zhì)的去除（續(xù)5）5、酶解法：在測定某些與蛋白質(zhì)結(jié)合牢固、且對算不穩(wěn)定的藥物時，常加入一些酶而使得蛋白質(zhì)分解，將藥物釋放出來。常用的是枯草菌溶素。但也可以根據(jù)藥物的不同選擇合適的分解酶。該法操作簡單，效果較好。但很多酶的價格很高，且不易獲得是其缺點(diǎn)。當(dāng)前第62頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（二）綴合物的水解藥物進(jìn)入體內(nèi)后，被免疫系統(tǒng)當(dāng)作異物而代謝掉，其中一些含有羥基、羧基、氨基和巰基的藥物，可與內(nèi)源性的葡萄糖醛酸或葡萄糖酸酐等結(jié)合，形成極性大的無活性的綴合物。在測定尿液中藥物的總量時，需要用適當(dāng)?shù)姆椒ㄋ?，然后再進(jìn)行測定。其中酸水解法簡便、快速，但專一性差、藥物易分解；酶水解法專一性較強(qiáng)、藥物無分解；但時間長、費(fèi)用大，對于遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物，可采用酶水解法。當(dāng)前第63頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（三）有機(jī)破壞生物樣品中的金屬原子常與蛋白質(zhì)結(jié)合，難以用有機(jī)溶劑萃取，測定時多采取有機(jī)破壞的方法進(jìn)行，如使用硝酸-高氯酸作為消解劑，將有機(jī)部分破壞掉，使得金屬原子被轉(zhuǎn)變成高價態(tài)的離子部分。當(dāng)前第64頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（四）分離、純化和富集樣品的濃度高低對于前處理的影響很大。如果樣品濃度較高（ug/ml及其以上），所采用的方法靈敏度可達(dá)到要求，那么樣品在簡單處理（如沉淀蛋白或綴合物水解）后即可直接進(jìn)行測定。在很多情況下，生物樣品中藥物的濃度很低（ng/ml及其以下），很多儀器條件（如UV檢測）的靈敏度不夠，此時需要將樣品進(jìn)行分離、純化和富集，以達(dá)到分析的要求。當(dāng)前第65頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)（四）分離、純化和富集（續(xù)1）萃取法是應(yīng)用最多的分離、純化方法。目的是從大量樣品中提取出所需要的微量組分，然后通過溶劑的蒸發(fā)而使得樣品得到富集。萃取方法包括：液液萃取法：經(jīng)典方法；液固萃取法；發(fā)展迅速方法。當(dāng)前第66頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)1、液液萃取法（LLE）液液萃取法（Liquid-Liquidextraction，LLE）適用于極性相對較小的藥物，由于這些藥物在有機(jī)溶劑中的溶解度（遠(yuǎn)遠(yuǎn)）大于在水相中的溶解度，而水相中的大多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)極性較大，根據(jù)相似相溶原理，可以用有機(jī)溶劑將小極性藥物從水相中萃取出來，同時可以除去大部分的干擾物質(zhì)，包括大量蛋白質(zhì)等。該方法是傳統(tǒng)方法，仍在大量使用。當(dāng)前第67頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)1、液液萃取法（續(xù)1）LLE需要考慮有機(jī)溶劑的特性、有機(jī)溶劑相和水相的體積，以及水相的pH值等。所選用的有機(jī)溶劑，要求對被測組分的溶解度大（能提取完全），沸點(diǎn)低（易于蒸發(fā)或揮發(fā)除去），與水不相混溶（容易分離）、無毒（苯類溶劑不要用）、化學(xué)穩(wěn)定（不易燃、不爆炸）、不易乳化（影響萃取效果）等。最常用的是乙醚和三氯甲烷（先難以購買，可用二氯甲烷替代）。當(dāng)前第68頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)1、液液萃取法（續(xù)2）所用的有機(jī)溶劑要適量，一般有機(jī)相與水相（液體樣品）的容積比為1：1或2：1，也可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行確定。如果有機(jī)溶劑體積過大，后續(xù)的揮發(fā)時間較長；體積過小，則可能提取不完全，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。當(dāng)前第69頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)1、液液萃取法（續(xù)3）溶液的pH值對與LLE的影響非常大。多數(shù)藥物是親脂性的堿性藥物，內(nèi)源性物質(zhì)多為酸性，所以在堿性條件下提取藥物，可以使得藥物呈原型狀態(tài)而被易于提取出來，而內(nèi)源性物質(zhì)則留在水相中。可用適當(dāng)堿性溶液（如碳酸氫鈉-氫氧化鈉的混合液作為堿化試劑）一般情況下，有機(jī)溶劑的萃取只萃取一次。當(dāng)前第70頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)1、液液萃取法（續(xù)4）LLE的優(yōu)點(diǎn)是選擇性好，操作簡單，成本低。大多數(shù)的藥物都可以與內(nèi)源性物質(zhì)得以分離，對結(jié)果的干擾較小。但該法不適合于極性大的藥物的分離和純化。當(dāng)前第71頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)2、液固萃取法（LSE）液固萃取法（Liquid-Solidextraction，LSE）是近年來發(fā)展非常迅速的方法，主要采用柱色譜分離方法，將具有吸附、分配和離子交換性質(zhì)的固定相作成萃取小柱，將生物樣品通過此小柱，可以用適當(dāng)溶劑將干擾物洗脫掉，將藥物保留在固定相上，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵撓聛磉M(jìn)行分析。當(dāng)前第72頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)2、液固萃取法（續(xù)1）LSE的特點(diǎn)：引入雜質(zhì)較少，樣品洗脫后可直接分析；消除在LLE中常見的乳化現(xiàn)象；萃取效率高，可用少量樣品進(jìn)行分析；最后洗脫多為以水為主的溶劑，安全性高；樣品處理速度快，對揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性藥物更合適；缺點(diǎn)是價格高，有時重復(fù)性差。當(dāng)前第73頁\共有80頁\編于星期日\14點(diǎn)3、被測組分的富集樣品的萃取是一個去除雜質(zhì)的純化過程，但因?yàn)榇藭r有機(jī)溶劑的體積較大導(dǎo)致藥物的濃度較低，一般情況下不能直接用于分析。還需要進(jìn)一步的富集。富集的方法一般為：最后一次萃取的溶劑為小體積，使得藥物的濃度可達(dá)到分析方法的靈敏度；或者將有機(jī)溶劑揮發(fā)，然后再用小體積的合適的溶劑（如流動相）復(fù)溶解后再分析。當(dāng)前第74頁\共有8