結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)進展培訓(xùn)課程課件

主要內(nèi)容

結(jié)核病實驗室常用的診斷技術(shù)和方法結(jié)核病實驗室新的診斷技術(shù)和方法未來實驗室結(jié)核病的診斷模式11、細菌學方法2、免疫學方法3、分子生物學方法22一、目前實驗室常用檢測方法1、細菌學方法（抗酸染色雙目顯微鏡、固體或液體培養(yǎng)）33一、目前實驗室常用檢測方法培養(yǎng)onplatesorinbrothidentificationbybiochemicalorserologicaltestsonpuregrowthfromsinglecolony顯微鏡檢查脫色復(fù)染染色unstainedorstainedwithe.g.Gramstain

2、免疫學方法抗體檢測是結(jié)核病輔助診斷手段，對菌陰肺結(jié)核有一定的參考價值。

1、酶聯(lián)免疫吸附試驗2、免疫膠體金標技術(shù)

44一、目前實驗室常用檢測方法56潛伏結(jié)核感染者的篩查結(jié)核菌素PPD試驗3、分子生物學方法

實時熒光定量PCR技術(shù)：也稱分子信標技術(shù)，是今年發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。是PCR與核酸探針技術(shù)的結(jié)合，將PCR較高的靈敏度和核酸探針的高特異性相結(jié)合。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

77一、目前實驗室常用檢測方法88

二、

新診斷技術(shù)和方法

分類

新方法用途細菌學檢查LED(發(fā)光二極管顯微鏡)涂片檢查

免疫學方法-干擾素釋放實驗潛伏感染者分子生物學LAMP(等溫擴增)涂陰\涂陽LPA(線性探針)

MDR-TB,鑒定Genechip(基因芯片)MDR-TB,鑒定GeneXpert(多色巢式定量PCR)耐RFP,涂陰分子分型技術(shù)指紋圖譜分析

其他DNA測序法突變檢測

HPLC胞壁成分檢測

99

二、

新診斷技術(shù)和方法

1、細菌學檢查

發(fā)光二極管（LED）熒光顯微鏡光源壽命長（30,000h）不需要預(yù)熱不需要暗室可用現(xiàn)有的顯微鏡可使用電池電源與通常熒光顯微鏡的判定一致率98.0%兩種方法觀察結(jié)果Z-N染色鏡檢結(jié)果LED鏡檢結(jié)果

二、

新診斷技術(shù)和方法

中蓋項目LED評估結(jié)果初診患者LED涂陽患者檢出率為14.96%（552/3691），萋尼氏染色明場顯微鏡涂陽患者檢出率12.46%(460/3691)，前者較后者提高2.5個百分點（P=0.000）隨訪患者LED和明場顯微鏡的檢出率分別為7.09%(178/2509)和2.83%（71/2509)，提高4.26個百分點（P=0.000）實時熒光定量PCR技術(shù)：也稱分子信標技術(shù)，是今年發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。以病人為中心的實驗室診斷技術(shù)平臺型(spaceroligonucleotidetyping,Spoligotyping)使用6色激光檢測裝置對靶核酸進行實時檢測。通過系統(tǒng)評估和META分析（和DST比較）：結(jié)核分枝桿菌或涂陽的痰標本結(jié)核分枝桿菌菌株水平鑒定最早采用生化分析、血清學技術(shù)和噬菌體分型等技術(shù)進行分析，但由于這些方法的局限性而未得到廣泛應(yīng)用。單核細胞分離未來實驗室結(jié)核病的診斷模式（3）Genechip(基因芯片)結(jié)核耐藥檢測基因芯片（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)檢測技術(shù)該技術(shù)是近年發(fā)展起來的以PCR為基礎(chǔ)的分型技術(shù)。②抗酸染色涂片陽性標本中蓋項目LED評估結(jié)果?密閉系統(tǒng)(沒有污染的風險）LED涂陽患者檢出率為14.對于進一步推廣建議，大多數(shù)(8/9)認為應(yīng)進一步推廣，但其中有2人認為應(yīng)在日工作量大的實驗室優(yōu)先使用與通常熒光顯微鏡的判定一與通常熒光顯微鏡的判定一①固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌種二、新診斷技術(shù)和方法中蓋項目LED評估結(jié)果讀片時間LED讀片時間120.03±38.88秒，明場顯微鏡206.31±75.86秒（p=0.00）使用接受度調(diào)查對于進一步推廣建議，大多數(shù)(8/9)認為應(yīng)進一步推廣，但其中有2人認為應(yīng)在日工作量大的實驗室優(yōu)先使用1313二、

新診斷技術(shù)和方法

單核細胞分離TB抗原刺激，IFN-

釋放與標記的二抗結(jié)合

酶作用標記物－顯色每一斑點代表釋放IFN-的一個細胞YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYIFN-抗原一抗捕獲IFN-

2、免疫學方法：-干擾素釋放實驗BCG進化過程1515二、

新診斷技術(shù)和方法分子生物學LAMP(等溫擴增)LPA(線性探針)Genechip(基因芯片)GeneXpert(多色巢式定量PCR)分子分型技術(shù)1616二、

新診斷技術(shù)和方法（1）環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)：Eiken,Japan?可同時檢測患者是否感染結(jié)核

所用儀器設(shè)備極其簡單63℃擴增（避免非特異性擴增多對引物（提高特異性和速度）：靶基因6個不同區(qū)域，設(shè)計4種引物?對涂陰培陽病人具有非常高的敏感性和特異性?密閉系統(tǒng)(沒有污染的風險）?快速，兩小時內(nèi)即可得到檢測結(jié)果，?肉眼觀察

1717二、

新診斷技術(shù)和方法（1）環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)臨床標本（咯痰等）DNA提取基因擴增基因檢出標本處理Extractionsolution1and210min,100℃1min,2000gSupernatant，captureDNAReconstitutereactionmix40min,67℃LAMPamplification＋－PCR

LAMP?需要使用PCR擴增儀?設(shè)計特異性的兩條引物?擴增效率:107?不需要使用PCR擴增儀?多對引物保證擴增的特異性?擴增效率:1010二、

新診斷技術(shù)和方法（1）環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)181919二、

新診斷技術(shù)和方法3、分子生物學（2）

線性探針檢測技術(shù)（LPA）可進行結(jié)核桿菌復(fù)合群的鑒定可用于MDR-TB高危人群的篩查對利福平的抗藥性(通過檢測rpoB基因的最常見突變)對異煙肼的抗藥性(通過檢測katG基因和inhA基因的最常見突變)檢測的樣本可以是純培養(yǎng)物或是涂片陽性的痰標本內(nèi)部控制保證了結(jié)果的正確可以獲得商品化的試劑盒約五小時內(nèi)即可得到檢測結(jié)果需要配備生物安全柜的生物安全二級實驗室需要至少三間房子Whopolicystatement，June20082020二、

新診斷技術(shù)和方法3、分子生物學（2）

線性探針檢測技術(shù)（LPA）耐藥分子診斷的基本原理利福平/異煙肼耐藥性的產(chǎn)生與結(jié)核分枝桿菌特定基因某些位點的突變相關(guān)?？菇Y(jié)核藥基因基因功能耐藥百分比利福平rpoB編碼DNA依賴RNA聚合酶，參與mRNA轉(zhuǎn)錄過程>90%異煙肼katG編碼過氧化氫-過氧化物酶，參與INH體內(nèi)的轉(zhuǎn)化40-100%高水平耐藥inhA編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依賴的enoyl-ACP還原酶，參與脂酸的合成appr25%低水平耐藥2121

DNA提取標本①固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌種②抗酸染色涂片陽性標本方法①超聲波裂解②GenoLyse試劑盒0.5～1

h2222

PCR擴增①不同標本,擴增參數(shù)不同培養(yǎng)菌種：擴增20個循環(huán)涂陽標本：擴增30個循環(huán)②引物：生物素標記③多重PCR擴增2.5～3h培養(yǎng)菌種：擴增20個循環(huán)光源壽命長（30,000h）型(spaceroligonucleotidetyping,Spoligotyping)中蓋項目LED評估結(jié)果集樣本準備、擴增和實時檢測于一體。①固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌種（3）Genechip(基因芯片)抗體檢測是結(jié)核病輔助診斷手段，對菌陰肺結(jié)核有直接重復(fù)片段及寡核苷酸多態(tài)性分型：MIRU為40-100bp的DNA元件，通常以串聯(lián)重復(fù)形式散步于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因中。63℃擴增（避免非特異性擴增線性探針分析不能替代目前傳統(tǒng)的培養(yǎng)和藥敏試驗，涂陰標本和XDR-TB的證實都需要進行傳統(tǒng)的培養(yǎng)。LED和明場顯微鏡的檢出率分別為7.二、新診斷技術(shù)和方法未來實驗室的診斷模式?多對引物保證擴增的特異性二、新診斷技術(shù)和方法基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測分離株或者痰樣本中結(jié)核桿菌多藥耐藥（利福平、異煙肼）。雜交通過系統(tǒng)評估和META分析（和DST比較）：結(jié)核分枝桿菌或涂陽的痰標本2323

雜交采用反向雜交法:PCR擴增產(chǎn)物→變性（DNA成單鏈）→與線性探針雜交→洗滌→顯色→判斷結(jié)果1～2h2424

結(jié)果判讀0.5h

中蓋項目線性探針檢測利福平評價

利福平線性探針傳統(tǒng)藥敏合計一致率靈敏度特異性PPVNPV耐藥敏感合計耐藥1354117693.6%75.0%96.5%76.7%96.2%敏感451127172合HOPOLICYSTATEMENT27JUNE2008通過系統(tǒng)評估和META分析（和DST比較）：結(jié)核分枝桿菌或涂陽的痰標本RIP：敏感性≥97%，特異性≥99%

中蓋項目線性探針檢測異煙肼評價

異煙肼線性探針傳統(tǒng)藥敏總計一致率靈敏度特異性PPVNPV耐藥敏感合計耐藥1493017993.2%71.0%97.4%83.2%94.8%敏感6111081169合計21011381348WHOPOLICYSTATEMENT27JUNE2008通過系統(tǒng)評估和META分析（和DST比較）：結(jié)核分枝桿菌或涂陽的痰標本INH：敏感性≥90%，特異性≥99%

中蓋項目線性探針檢測MDR評價

MDR線性探針傳統(tǒng)合計一致率靈敏度特異性PPVNPVMDR非-MDR合計MDR792810795.0%66.4%97.7%73.8%96.8%非-MDR4012011241合計11912291348WHOPOLICYSTATEMENT27JUNE2008通過系統(tǒng)評估和META分析（和DST比較）：結(jié)核分枝桿菌或涂陽的痰標本MDR-TB檢測準確性：99%。WHOPOLICYSTATEMENT

27JUNE2008countylevel.線性探針分析不能替代目前傳統(tǒng)的培養(yǎng)和藥敏試驗，涂陰標本和XDR-TB的證實都需要進行傳統(tǒng)的培養(yǎng)。28基因芯片基因芯片指采用光導(dǎo)原位合成或微量點樣等方法，將核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。二、

新診斷技術(shù)和方法（3）Genechip(基因芯片)29檢測過程雜交反應(yīng)雜交清洗清洗干燥掃描檢測數(shù)據(jù)分析檢測分析PCR擴增DNA提取樣品制備二、

新診斷技術(shù)和方法（3）Genechip(基因芯片)30芯片結(jié)果圖例芯片雜交質(zhì)控芯片制備質(zhì)控芯片制備質(zhì)控芯片雜交質(zhì)控靶基因擴增質(zhì)控陰性對照質(zhì)控空白對照質(zhì)控二、

新診斷技術(shù)和方法（3）Genechip(基因芯片)313232二、

新診斷技術(shù)和方法（3）Genechip(基因芯片)結(jié)核耐藥檢測基因芯片結(jié)核耐藥檢測芯片獲北京市自主創(chuàng)新產(chǎn)品證書獲國家醫(yī)療器械證書和歐盟CE認證樣品制備儀雜交儀通

量：兩個一線抗結(jié)核藥速

度：

6小時（比傳統(tǒng)藥敏試驗法快50-100倍）靈敏度：103CFU/反應(yīng)特異性：對照設(shè)計嚴謹；自動判讀基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測分離株或者痰樣本中結(jié)核桿菌多藥耐藥（利福平、異煙肼）。軟件判讀激光共焦掃描儀InternationalJournalofTuberculosisandLungDisease,13:914-920,2009（IF=2.3）是一種半定量巢式實時PCR的檢測方法，能檢測桿菌和利福平耐藥性。擴增出ropB基因含有81bp的核心區(qū)序列，探針能夠區(qū)分野生型基因序列與突變型基因序列。集樣本準備、擴增和實時檢測于一體。盒子中含有凍干的試劑，緩沖液和洗滌液。使用6色激光檢測裝置對靶核酸進行實時檢測。二、

新診斷技術(shù)和方法（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)檢測技術(shù)33?標本類型：臨床痰標本，或濃縮處理后的標本（涂陽或涂陰培陽），不能用于用于治療隨訪的病人。?對涂陰培陽病人具有非常高的敏感性和特異性?可同時檢測患者是否結(jié)核以及是否對利福平耐藥?兩小時內(nèi)即可得到檢測結(jié)果，所用儀器設(shè)備簡單?不需要生物安全柜，滿足涂片試驗條件的實驗室?二、

新診斷技術(shù)和方法（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)檢測技術(shù)34?利福平耐藥陰性預(yù)測值：

在結(jié)核病利福平耐藥流行低或高的地區(qū)，NPV大于99%.即陰性結(jié)果能排除RIP耐藥?利福平耐藥陽性預(yù)測值：RIP耐藥流行＞15%，PPV＞90%RIP耐藥流行5%～10%，PPV：71%～84%RIP耐藥流行＜5%，PPV：＜70%，在這種情況下，RIP耐藥的結(jié)果需要傳統(tǒng)的DST證實。二、

新診斷技術(shù)和方法（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)檢測技術(shù)35基于核酸擴增的一步法利福平耐藥檢測XpertTMMTB/Rif技術(shù)平臺利福平的耐藥性分析

喹諾酮類藥物耐藥性

HIV病毒載量分析自動化得標本處理和檢測，可以在2小時內(nèi)出結(jié)果二、

新診斷技術(shù)和方法（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)檢測技術(shù)可用于MDR-TB高危人群的篩查LED和明場顯微鏡的檢出率分別為7.使用6色激光檢測裝置對靶核酸進行實時檢測。unstainedorstainedwithe.不同結(jié)核菌株IS6110的數(shù)目和位置不同。中蓋項目線性探針檢測異煙肼評價（1）插入序列6110限制性片段長度多態(tài)性分析：IS61101、細菌學方法（抗酸染色雙目顯微鏡、固體或液體培養(yǎng)）Genechip(基因芯片)?多對引物保證擴增的特異性RIP耐藥流行＞15%，PPV＞90%集樣本準備、擴增和實時檢測于一體。由若干個保守的長為36bp的直接重復(fù)序列組成，并被非重復(fù)序列即間隔區(qū)分開。多對引物（提高特異性和速度）：靶基因6個不同區(qū)域，設(shè)計4種引物1、細菌學方法（抗酸染色雙目顯微鏡、固體或液體培養(yǎng)）中蓋項目線性探針檢測MDR評價光源壽命長（30,000h）（2）線性探針檢測技術(shù)（LPA）未來實驗室結(jié)核病的診斷模式（3）Genechip(基因芯片)3737結(jié)核分枝桿菌菌株水平鑒定最早采用生化分析、血清學技術(shù)和噬菌體分型等技術(shù)進行分析，但由于這些方法的局限性而未得到廣泛應(yīng)用?；诤怂峄A(chǔ)上的分子流行病學研究技術(shù)是對結(jié)核病等感染性疾病進行檢測的一個強有力的手段，可以進行結(jié)核菌傳播的研究，結(jié)核病實驗室交叉污染的研究，判斷結(jié)核再感染或復(fù)發(fā)以及國際間傳播的研究。二、

新診斷技術(shù)和方法（5）分子分型技術(shù)3838

簡單介紹以下三種分型技術(shù)：（1）插入序列6110限制性片段長度多態(tài)性分析：IS6110（2）直接重復(fù)片段及寡核苷酸多態(tài)性分型：間隔寡核苷酸分

型(spaceroligonucleotidetyping,Spoligotyping)（3）分枝桿菌分散重復(fù)單元-可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列：(mycobacterialinterspersedrepetitiveunits-variablenumbertandemrepeats,MIRU-VNTR)二、

新診斷技術(shù)和方法3、分子生物學（5）分子分型技術(shù)3939插入序列6110限制性片段長度多態(tài)性分析：

IS6110是一個只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因組中的插入序列，長度為1355bp，具有高度的保守性，屬于IS3家族。不同結(jié)核菌株IS6110的數(shù)目和位置不同。在IS6110序列中，限制性內(nèi)切酶PvuII的酶切位點只有一個，經(jīng)酶切后產(chǎn)生大小兩個不同的片段，再與只針對酶切位點右側(cè)的245bp探針雜交，則雜交后產(chǎn)生的條帶數(shù)即為菌株IS6110拷貝數(shù)。二、

新診斷技術(shù)和方法（5）分子分型技術(shù)4040插入序列6110限制性片段長度多態(tài)性分析：IS6110這種方法存在一定的缺陷：①對于基因組中IS6110低拷貝<6或缺陷的分辨能力有限；②需要大量的基因組DNA，操作步驟繁瑣且工作量大；③各實驗室所采用的IS6110-RFLP分型方法的標準不統(tǒng)一，不同實驗室的IS6110-RFLP分型結(jié)果難于進行比對。二、

新診斷技術(shù)和方法（5）分子分型技術(shù)4141直接重復(fù)片段及寡核苷酸多態(tài)性分型：

基于直接重復(fù)區(qū)（RD區(qū)）的多態(tài)性。DR區(qū)只出現(xiàn)于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中。由若干個保守的長為36bp的直接重復(fù)序列組成，并被非重復(fù)序列即間隔區(qū)分開。每隔間隔區(qū)序列長為34-41bp。通常間隔區(qū)的順序在所有菌株都是相同的，但可能發(fā)生某一間隔區(qū)的插入或缺失，因此利用Spoligotyping就可以對結(jié)核分支桿菌進行株水平的鑒定。

可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和M.bovis以及M.bovisBCG二、

新診斷技術(shù)和方法（5）分子分型技術(shù)4242直接重復(fù)片段及寡核苷酸多態(tài)性分型：Spoligotyping①該方法對菌株的分辨能力明顯弱于IS6110一RFLP方法，特別是不能有效分辨北京家族菌株，而在我國目前流行的結(jié)核菌株中，大約50%屬于北京家族；②同時與其他方法相比有高估菌株間流行病學聯(lián)系的傾向。二、

新診斷技術(shù)和方法3、分子生物學4343可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列：MIRU-VNTR該技術(shù)是近年發(fā)展起來的以PCR為基礎(chǔ)的分型技術(shù)。MIRU為40-100bp的DNA元件，通常以串聯(lián)重復(fù)形式散步于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因中。H37Rv基因組中含41個MIRU區(qū)，其中有12個區(qū)具有多態(tài)性，其拷貝數(shù)在不同菌株之間12個區(qū)拷貝數(shù)在不同菌株之間存在差異。MIRU技術(shù)利用不同菌株之間這12個區(qū)拷貝數(shù)的差異達到鑒定菌株的目的。二、

新診斷技術(shù)和方法3、分子生物學4444可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列：MIRU-VNTR該方法操作簡單,分辨率高,結(jié)果容易分析,具有很高的可重復(fù)性,在實驗室內(nèi)和實驗室間具有非常好的可比性,并能提供數(shù)字化的分型信息,適宜于進行大量樣本和網(wǎng)絡(luò)化分析。二、

新診斷技術(shù)和方法3、分子生物學（5）分子分型技術(shù)4545DNA測序法被認為是檢測變異的“金標準”，可檢測出待檢基因上的所有突變位置和突變情況。已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐藥基因的檢測。

缺陷：專業(yè)設(shè)備，專業(yè)技術(shù)，限制其廣泛應(yīng)用。

二、

新診斷技術(shù)和方法

4、其他（1）DNA測序法4646在應(yīng)用某項新技術(shù)時，需要考慮的一般性問題：——是否有足夠的經(jīng)過培訓(xùn)的人員——有效的實驗室質(zhì)量管理體制——能否得到備用設(shè)備和耗材——技術(shù)支持的可獲得程度——工作環(huán)境的條件

等等

二、

新診斷技術(shù)和方法

PCR擴增countylevel.與通常熒光顯微鏡的判定一可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和M.二、新診斷技術(shù)和方法約五小時內(nèi)即可得到檢測結(jié)果46%(460/3691)，前者較后者提高2.LED涂陽患者檢出率為14.基于直接重復(fù)區(qū)（RD區(qū)）的多態(tài)性。二、新診斷技術(shù)和方法二、新診斷技術(shù)和方法HPLC胞壁成分檢測未來實驗室結(jié)核病的診斷模式結(jié)核病實驗室未來檢測模式與通常熒光顯微鏡的判定一WHOPOLICYSTATEMENT27JUNE2008?多對引物保證擴增的特異性通過系統(tǒng)評估和META分析（和DST比較）：結(jié)核分枝桿菌或涂陽的痰標本①對于基因組中IS6110低拷貝<6或缺陷的分辨能力有限；結(jié)核分枝桿菌菌株水平鑒定最早采用生化分析、血清學技術(shù)和噬菌體分型等技術(shù)進行分析，但由于這些方法的局限性而未得到廣泛應(yīng)用。實時熒光定量PCR技術(shù)：也稱分子信標技術(shù)，是今年發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)?？贵w檢測是結(jié)核病輔助診斷手段，對菌陰肺結(jié)核有未來實驗室的診斷模式

需要8-10周時間需要4天時間患者標本分子方法傳統(tǒng)方法菌種鑒定藥敏試驗涂片培養(yǎng)菌種鑒定和藥敏試驗結(jié)核病實驗室未來檢測模式可疑結(jié)核病患者的標本涂片陽性或二者均陽性二者均陰性培養(yǎng)陽性基因分型復(fù)發(fā)再感染或流行規(guī)律研究快速藥敏試驗利福平耐藥利福平敏感耐藥風險評估臨床治療方案耐藥風險評估臨床治療方案快速菌種鑒定涂片未來實驗室的診斷模式以病人為中心的實驗室診斷技術(shù)平臺固體培養(yǎng)監(jiān)測

應(yīng)急處置

網(wǎng)絡(luò)建設(shè)主要篩查耐藥診斷治療主動發(fā)現(xiàn)被動的病人發(fā)現(xiàn)診斷治療地市縣區(qū)HIV/TB雙重感染MDRTB/TB-MM省級萋尼熒光涂片檢查推薦耐藥可疑者iLEDLAMP等手動分子診斷HIV/TB雙重感染分子診斷MDRTB/TB-MM固體培養(yǎng)分子診斷LPA等應(yīng)急處置TB疫情監(jiān)測傳統(tǒng)方法/新診斷技術(shù)確定治療方案50TheEndThankyou！1、細菌學方法（抗酸染色雙目顯微鏡、固體或液體培養(yǎng)）5151一、目前實驗室常用檢測方法培養(yǎng)onplatesorinbrothidentificationbybiochemicalorserologicaltestsonpuregrowthfromsinglecolony顯微鏡檢查脫色復(fù)染染色unstainedorstainedwithe.g.Gramstain

52潛伏結(jié)核感染者的篩查結(jié)核菌素PPD試驗5353

二、

新診斷技術(shù)和方法

1、細菌學檢查

發(fā)光二極管（LED）熒光顯微鏡光源壽命長（30,000h）不需要預(yù)熱不需要暗室可用現(xiàn)有的顯微鏡可使用電池電源與通常熒光顯微鏡的判定一致率98.0%中蓋項目LED評估結(jié)果初診患者LED涂陽患者檢出率為14.96%（552/3691），萋尼氏染色明場顯微鏡涂陽患者檢出率12.46%(460/3691)，前者較后者提高2.5個百分點（P=0.000）隨訪患者LED和明場顯微鏡的檢出率分別為7.09%(178/2509)和2.83%（71/2509)，提高4.26個百分點（P=0.000）5555二、

新診斷技術(shù)和方法（1）環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)：Eiken,Japan?可同時檢測患者是否感染結(jié)核

所用儀器設(shè)備極其簡單63℃擴增（避免非特異性擴增多對引物（提高特異性和速度）：靶基因6個不同區(qū)域，設(shè)計4種引物?對涂陰培陽病人具有非常高的敏感性和特異性?密閉系統(tǒng)(沒有污染的風險）?快速，兩小時內(nèi)即可得到檢測結(jié)果，?肉眼觀察

PCR

LAMP?需要使用PCR擴增儀?設(shè)計特異性的兩條引物?擴增效率:107?不需要使用PCR擴增儀?多對引物保證擴增的特異性?擴增效率:1010二、

新診斷技術(shù)和方法（1）環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)56二、新診斷技術(shù)和方法83%（71/2509)，提高4.利福平/異煙肼耐藥性的產(chǎn)生與結(jié)核分枝桿菌特定基因某些位點（3）Genechip(基因芯片)結(jié)核耐藥檢測芯片獲北京市自主創(chuàng)新產(chǎn)品證書（3）Genechip(基因芯片)結(jié)核耐藥檢測基因芯片結(jié)核病實驗室常用的診斷技術(shù)和方法一、目前實驗室常用檢測方法基于核酸基礎(chǔ)上的分子流行病學研究技術(shù)是對結(jié)核病等感染性疾病進行檢測的一個強有力的手段，可以進行結(jié)核菌傳播的研究，結(jié)核病實驗室交叉污染的研究，判斷結(jié)核再感染或復(fù)發(fā)以及國際間傳播的研究。二、新診斷技術(shù)和方法二、新診斷技術(shù)和方法Genechip(基因芯片)MDR-TB檢測準確性：99%。26個百分點（P=0.1、細菌學方法（抗酸染色雙目顯微鏡、固體或液體培養(yǎng)）onplatesorinbrothMIRU技術(shù)利用不同菌株之間這12個區(qū)拷貝數(shù)的差異達到鑒定菌株的目的。46%(460/3691)，前者較后者提高2.RIP耐藥流行＜5%，PPV：＜70%，在這種情況下，RIP耐藥的結(jié)果需要傳統(tǒng)的DST證實。LED和明場顯微鏡的檢出率分別為7.Genechip(基因芯片)MDR-TB,鑒定結(jié)核分枝桿菌菌株水平鑒定最早采用生化分析、血清學技術(shù)和噬菌體分型等技術(shù)進行分析，但由于這些方法的局限性而未得到廣泛應(yīng)用。5757

DNA提取標本①固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌種②抗酸染色涂