ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞與類真皮構(gòu)成皮膚類似物的分化

ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞與類真皮構(gòu)成皮膚類似物的分化【摘要】【目的】以ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建皮膚類似物，探討其在皮下的分化潛能。【方法】Hoechst33342標(biāo)記E14-ES細(xì)胞，經(jīng)羊膜誘導(dǎo)4d后，形成表皮干細(xì)胞克隆，并以其作為種子細(xì)胞，取129胎鼠成纖維細(xì)胞與復(fù)合凝膠－明膠海綿復(fù)合，形成皮膚類似物，埋植于129小鼠皮下組織。術(shù)后2周、4周、6周、8周取材，做HE染色觀察，β1整合素、CK15、CK19、CEA、CK18免疫組化熒光雙標(biāo)和免疫組化觀察。【結(jié)果】術(shù)后2周和4周，植塊內(nèi)可見單層立方或柱狀上皮構(gòu)成的管狀和泡狀結(jié)構(gòu)，6周和8周后，可見角化復(fù)層上皮、毛囊樣、汗腺樣、皮脂腺樣等結(jié)構(gòu)，免疫雙標(biāo)結(jié)果顯示，植入2周和4周，帶有藍(lán)色核標(biāo)記的細(xì)胞形成的管狀或泡狀結(jié)構(gòu)呈β1整合素、CK15、CK19、CEA和CK18陽性，6周和8周后，HE染色中汗腺樣結(jié)構(gòu)呈CEA、CK18陽性?！窘Y(jié)論】ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞與類真皮構(gòu)建的皮膚類似物，在同種小鼠皮下有分為角化復(fù)層上皮、汗腺樣、毛囊樣、皮脂腺樣等結(jié)構(gòu)的潛能。

【關(guān)鍵詞】ES細(xì)胞；表皮干細(xì)胞；皮膚附屬結(jié)構(gòu)；定向分化；羊膜

Abstract：【Objective】ToexplorethedifferentiationpotencyofskinanalogreconstructedwithEScell-derivedepidermalstemcellsanddermalanaloginhypodermis.【Methods】E14-EScells,labeledwithHoechst33342,werecoculturedwithhumanamnion.Fourdayslater,epidermalstemcellcloneswereformed.TheskinanalogwasreconstructedwithES-derivedepidermalstemcellsanddermalanalog,whichreconstructedwith129micefetusfibroblastsandcompoundgel-gelatinsponge.Theskinanalogsweretransplantedinto129micehypodermis.Thedifferentiationtissuesofskinanalogweresampledat2w,4w,6w,and8w.SectionswereobservedwithHEstaining,immunohistochemicalanddi-labeledimmunofluorescencemethodstotesttheexpressionofβ1integrin,CK15,CK19,CEA,andCK18.【Results】Sectionsshowedtubularorfollicularlikestructureformedwithsimpleorstratifiedepitheliumat2and4weeks.Keratinizedstratifiedsquamousepithelium,sweatgland-like,sebaceousgland-likeandhairfollicle-likestructureswereobservedat6weekand8weekaftertransplantation.CellslabeledbyHoechst33342,formedtubularorfollicular-likestructure,expressedβ1integrin,CK15,CK19,CEAandCK18positiverespectivelyat2wand4w.Thesweatglands-likestructureexpressedCEAandCK18positiverespectivelyat6wand8w.【Conclusion】SkinanalogsreconstructedwithES-derivedepidermalstemcellsanddermalanalogscandifferentiateintokeratinizedstratifiedsquamousepithelium,sweatgland-like,sebaceousgland-likeandhairfollicle-likestructuresinhypodermis.

Keywords:EScells；epidermalstemcells；skinappendages；committeddifferentiation；amnion

目前組織工程皮膚的種子細(xì)胞多采用角質(zhì)形成細(xì)胞，它只能形成表皮，不能形成皮膚附屬結(jié)構(gòu)。我們先前的研究表明，胚胎干細(xì)胞細(xì)胞經(jīng)人羊膜誘導(dǎo)后，分化為ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞，將其植入裸鼠皮下、腹腔及小鼠腎被囊內(nèi)均具有分化角化復(fù)層上皮、毛囊樣、皮脂腺樣和汗腺樣結(jié)構(gòu)的潛能，表明ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞具有相當(dāng)穩(wěn)定的分化潛能［1－4］，因此以ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞作為組織工程皮膚的種子細(xì)胞具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。在胚胎發(fā)育的過程中，真皮對表皮及其附屬物的發(fā)生、分化具有重要作用，真皮中的細(xì)胞主要是成纖維細(xì)胞，具有分泌細(xì)胞外基質(zhì)和多種生物活性因子的功能，我們用成纖維細(xì)胞和明膠海綿與復(fù)合凝膠組成類真皮，觀察其在皮下對ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞分化的影響，為進(jìn)一步構(gòu)建具有皮膚附屬結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚打下基礎(chǔ)。

1材料和方法

材料

細(xì)胞和所用材料129小鼠E14胚胎干細(xì)胞由中山大學(xué)附二院黃紹良教授提供。人羊膜采自中山大學(xué)附一院產(chǎn)房足月妊娠剖腹產(chǎn)的胎膜。Hoechst33342；成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基；ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞維持培養(yǎng)基。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物孕齡～d昆明小鼠；清潔級129小鼠，約20～25g，清潔級SD大鼠，約100g，均雌雄不拘，購自中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

免疫組化試劑Ⅰ抗：小鼠抗人β1整合素單抗，小鼠抗人CK19單抗、兔抗人癌胚抗原多抗、小鼠抗人CK18、小鼠抗人CK15單抗、Ⅱ抗及Avidin結(jié)合的SABC-Cy3試劑盒均購自博士德試劑公司。

真皮材料明膠海綿：由南京金陵制藥廠生產(chǎn)，規(guī)格：6cm×2cm×cm，批號：021211。剪成1cm×1cm×cm大小，孔徑大小約為300～550μm。

自制復(fù)合凝膠將鼠尾膠原、甲殼糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素紫外燈照射下，用mol/L的乙酸攪拌融解2～3h，冰浴條件下加入mL10×DMEM培養(yǎng)基，NaOH調(diào)pH為，終體積為4mL，4℃儲存?zhèn)溆?。鼠尾膠原購自廣州紅十字會醫(yī)院，脫已酰甲殼糖、透明質(zhì)酸、6-硫酸軟骨素均為SIGMA公司產(chǎn)品。

方法

人羊膜的制備及ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化見參考文獻(xiàn)［5］。

ES細(xì)胞的核標(biāo)記選擇生長良好的對數(shù)生長期ES細(xì)胞，將培養(yǎng)液換成標(biāo)記培養(yǎng)液，置體積分?jǐn)?shù)5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)箱1～3h，吸棄標(biāo)記培養(yǎng)液，PBS洗3次，換ES細(xì)胞完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

129胎鼠皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)孕齡17d至出生前的129孕小鼠，處死后，無菌條件下取出胚胎，去除胚胎頭、四肢和內(nèi)臟，剪碎軀干部分組織，加入g/L胰蛋白酶消化1min，用含血清的培養(yǎng)基中止消化，離心，棄上清，用培養(yǎng)基重新懸浮組織，將組織接種入25cm2培養(yǎng)瓶，體積分?jǐn)?shù)5％CO237℃靜置培養(yǎng)，4～6d原代細(xì)胞長滿，消化傳代，3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

皮膚類似物的構(gòu)建將誘導(dǎo)后的ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均按1×105個(gè)/mL與復(fù)合凝膠混勻，滴加入明膠海綿，每塊復(fù)合物體積約1cm×1cm×cm。

皮下移植實(shí)驗(yàn)129小鼠用40g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺上，剃去背部毛，消毒后，沿背部正中線兩側(cè)距脊柱1cm切開皮膚，分離皮下組織，暴露肌層，將構(gòu)建的皮膚類似物埋入皮下，每只動(dòng)物埋兩塊，縫合皮膚，動(dòng)物蘇醒后飼養(yǎng)，共8只動(dòng)物。

組織學(xué)檢查術(shù)后2、4、6、8周取材，每次取2只動(dòng)物，4塊組織，用40g/L多聚甲醛固定6～8h，所得標(biāo)本一半常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片6μm，HE染色；另一半標(biāo)本300g/L蔗糖過夜，冰凍切片，免疫組化染色，免疫組化染色按SABC-Cy3法，行β1整合素、CK19、CK15、CEA和CK18抗體免疫組織化學(xué)顯色，β1整合素濃度為1∶30，余Ⅰ抗?jié)舛染鶠?∶100；Ⅱ抗?jié)舛葹?∶100，SABC-Cy3熒光顯色。

2結(jié)果

體外培養(yǎng)細(xì)胞的觀察

Hoechst33342標(biāo)記ES細(xì)胞1～3h后，于熒光倒置顯微鏡下可見細(xì)胞核被標(biāo)記為藍(lán)色的細(xì)胞克隆，人羊膜上誘導(dǎo)4～5d后，仍可見生長在羊膜表面的細(xì)胞克隆呈藍(lán)色核標(biāo)記。培養(yǎng)的胎鼠皮膚成纖維細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞飽滿。

大體觀察

術(shù)后2周時(shí)，皮下埋植物體積較植入時(shí)無顯著變化，呈白色，有結(jié)締組織包繞，4周后增生的組織塊體積增大明顯，6周增大達(dá)高峰。

HE染色

2周時(shí)植入的類真皮材料已降解吸收，2～4周多見單層立方或柱狀上皮圍成的管狀和泡狀結(jié)構(gòu)，少見復(fù)層上皮圍成的管腔樣結(jié)構(gòu)，上皮細(xì)胞排列緊密，核染色情況及核與胞漿的比例與正常細(xì)胞相似，未見異常增生。6～8周植塊中，除上述結(jié)構(gòu)外，還可見復(fù)層角化上皮和角化珠、汗腺樣、毛囊樣、皮脂腺樣等結(jié)構(gòu)，與正常小鼠皮下組織的結(jié)構(gòu)有明顯不同。

2．4免疫組化和免疫熒光雙標(biāo)

2周組織塊中，可見單層或復(fù)層管狀或泡狀結(jié)構(gòu)分別呈核熒光和β1整合素、CK15、CK19雙標(biāo)陽性，6周后核熒光衰減，但HE染色中汗腺樣結(jié)構(gòu)呈CEA和CK18陽性。

3討論

我們以往的研究［1-5］表明，利用人羊膜與胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)，可將其定向誘導(dǎo)為表皮干細(xì)胞，表皮干細(xì)胞在裸鼠皮下、腹腔及同種129小鼠腎被囊內(nèi)具有相同的分化時(shí)程，即在4周前主要分化為單層立方或柱狀上皮構(gòu)成的管狀和泡狀結(jié)構(gòu)，4周后才分化發(fā)育為角化復(fù)層上皮、汗腺樣、毛囊樣和皮脂腺樣等結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示外環(huán)境的改變對ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞的固有分化發(fā)育過程影響不大，ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞作為組織工程皮膚的種子細(xì)胞具有重要的研究應(yīng)用價(jià)值。皮膚由表皮和真皮構(gòu)成，表皮來源于體表外胚層，而真皮由中胚層間充質(zhì)分化形成，至于其后發(fā)育形成的皮膚附屬結(jié)構(gòu)，如汗腺、毛囊和皮脂腺等，都是由表皮的生發(fā)層向深層真皮生長、分化而形成的，可見在皮膚及其附屬結(jié)構(gòu)的發(fā)育形成過程中，真皮間充質(zhì)及其中的成纖維細(xì)胞有著重要作用，在真皮替代物中引入成纖維細(xì)胞對于組織工程皮膚的構(gòu)建具有重要意義［6,7］,在真皮支架中加入成纖維細(xì)胞使真皮層具有細(xì)胞活性，更加接近生理狀態(tài)，并能以活體形式對移植環(huán)境作出反應(yīng)；使真皮基質(zhì)結(jié)構(gòu)在成纖維細(xì)胞的作用下有序化；通過成纖維細(xì)胞的分泌補(bǔ)充真皮替代物中缺失的細(xì)胞因子和對真皮替代物作表面修飾，提高真皮替代物誘導(dǎo)創(chuàng)周血管內(nèi)皮細(xì)胞向其內(nèi)移行的能力，加速血管化速度,提高其促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長、分化和基底膜形成的能力。

我們所構(gòu)成的皮膚類似物中包含有膠原、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、甲殼素等，其中膠原、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸是正常細(xì)胞外基質(zhì)的成分，純膠原在體內(nèi)被酶解的時(shí)間很短，加入甲殼糖后降解速度下降，這是因?yàn)榉肿娱g發(fā)生交聯(lián)作用，甲殼糖和膠原復(fù)合后，可以限制膠原酶對膠原的識別以及減少膠原酶的直接接觸［8］，透明質(zhì)酸有利于細(xì)胞的吸附、生長、增殖【9】，硫酸糖胺多糖有助于皮膚附屬結(jié)構(gòu)的發(fā)生［10］，同時(shí)我們在真皮支架中引入了成纖維細(xì)胞，將復(fù)合物埋植在129小鼠皮下，可見ES細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞分化角化復(fù)層上皮、汗腺樣、毛囊樣、皮脂腺樣結(jié)構(gòu)。有研究表明成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)和各種細(xì)胞因子或生長因子，包括Ⅰ、Ⅲ型膠原及纖粘連蛋白、層粘連蛋白、FGF、VEGF等，對真皮的重建，種子細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化、血管長入及基膜的形成等方面都可能產(chǎn)生重要作用。本研究為將來構(gòu)建具有生理功能的人工皮膚奠定了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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