嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌與金屬β

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌與金屬β內(nèi)酰胺酶【摘要】嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌耐藥性強(qiáng)，產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶是嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌對(duì)包括亞胺培南在內(nèi)的廣譜頭孢菌素耐藥的主要原因，金屬酶作用機(jī)制復(fù)雜，沒(méi)有相應(yīng)的抑制劑投入，已成為抗感染治療很棘手的問(wèn)題。本文就嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌所產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶種類、特性、作用機(jī)制和抑制劑等方面研究作一簡(jiǎn)要概述。

【關(guān)鍵詞】嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌耐藥性金屬內(nèi)酰胺酶

Stenotrophomonasmaltophiliaandmetalloβlactamase

ABSTRACTStenotrophomonasmaltophiliawasmultiresistant.Productionofmetalloβlactamaseisoneoftheresistancemechanismoftocephemsandcarbapenems.Themechanismsofmetalloβlactamasewerecomplicatedandnocorrespondinginhibitorhasbeenused,whichhasbecomeadifficultprobleminthetreatmentofinfectionsdiseaes.Thekinds,characteristics,mechanismandinhibitorsofmetalloβlactamaseproducedfromwerereviewed.

KEYWORDSStenotrophomonasmaltophilia;Drugresistance;Metalloβlactamase

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是一種引起醫(yī)院內(nèi)感染的常見(jiàn)條件致病菌。近年隨著廣譜抗生素，尤其是碳青霉烯類抗生素的廣泛應(yīng)用，該菌的感染率不斷增加。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的外膜滲透性低，抗菌藥物不能有效達(dá)到相關(guān)部位。另外，該菌產(chǎn)生青霉素酶、頭孢菌素酶和含鋅離子的金屬β內(nèi)酰胺酶(MBL)，可水解多種抗菌藥，導(dǎo)致藥物失活。產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶是嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌對(duì)包括亞胺培南在內(nèi)的廣譜頭孢菌素耐藥的主要原因，現(xiàn)缺乏有效的抑制劑，已成為臨床抗感染治療中很棘手的問(wèn)題。因此MBL的研究越來(lái)越受到重視。

1金屬β內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生和

金屬β內(nèi)酰胺酶(簡(jiǎn)稱金屬酶)是一種依賴Zn2+的超廣譜β內(nèi)酰胺酶，可水解幾乎所有的β內(nèi)酰胺酶類抗生素，包括碳青霉烯類，而且水解活性不能被傳統(tǒng)意義上的β內(nèi)酰胺酶抑制劑(如克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦等)抑制［1］。金屬酶家族的基因相互之間的一級(jí)結(jié)構(gòu)有低水平的相似性(大多數(shù)情況下少于40%或少于11%的氨基酸一致)，但三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)高水平的相似性，故擁有四個(gè)同樣的主要特性：①能夠水解碳青霉烯類抗生素；②對(duì)單環(huán)類藥物敏感；③對(duì)螯合劑(如EDTA)敏感；④對(duì)鋅離子有依賴性。

第一個(gè)被報(bào)道的金屬酶Ⅱ是從蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)中發(fā)現(xiàn)的，其活性依賴于鋅離子。20世紀(jì)80年代初期，日本從嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌中鑒定出第二種鋅依賴青霉素L1酶，隨后又從嗜水氣單胞菌中脆弱擬桿菌、居泉沙雷菌和戈氏軍團(tuán)菌中鑒定出水解亞胺培南的金屬酶。這些菌的MBL基因絕大多數(shù)位于染色體上，限制了此酶的菌株間傳播。此類MBL稱為天然來(lái)源的MBL，上述菌都是條件致病菌，除嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌和炭疽桿菌很少引起嚴(yán)重感染。20世紀(jì)90年代日本發(fā)現(xiàn)的金屬酶IMP1，由于其編碼基因位于可移動(dòng)的質(zhì)粒上，引起人們極大的重視［2］，隨后在肺炎克雷伯菌及黏質(zhì)沙雷菌中檢測(cè)到IMP1，在一些非發(fā)酵的腸桿菌中也發(fā)現(xiàn)有IMP1酶的產(chǎn)生，且產(chǎn)酶菌株比例逐漸上升。金屬酶基因的表達(dá)可以是誘導(dǎo)型也可以是非誘導(dǎo)型。含金屬酶基因的脆弱擬桿菌(約%～4%)表達(dá)水平大多很低，不引起產(chǎn)酶菌耐藥，也不被β內(nèi)酰胺酶類化合物誘導(dǎo)。當(dāng)啟動(dòng)子突變或啟動(dòng)子內(nèi)插入IS元件時(shí)可導(dǎo)致表達(dá)水平增高，引起產(chǎn)酶菌耐藥。含金屬酶基因嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、嗜水氣單胞菌和簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌均可被誘導(dǎo)表達(dá)［3］。由于其編碼基因位于質(zhì)粒上或Ⅰ類整合子的IMP和VIM型MBL，可通過(guò)各種方式或在其它細(xì)菌體內(nèi)得到表達(dá)。目前臨床上使用的所有β內(nèi)酰胺酶抑制劑對(duì)他們均無(wú)效，易造成廣泛傳播。目前為止，已發(fā)現(xiàn)30多種金屬酶，IMP類21種，VIM11種，還有SPM1和GIM。

2金屬β內(nèi)酰胺酶分類

關(guān)于β內(nèi)酰胺酶分類方法有兩類。一種是Ambler等［4］提出的根據(jù)β內(nèi)酰胺酶分子結(jié)果氨基酸序列差異，將β內(nèi)酰胺酶分為A、B、C、D等4種類型，金屬β內(nèi)酰胺酶屬于B類；另一種是1995年Bush等［1］提出的根據(jù)β內(nèi)酰胺酶的功能分類。根據(jù)底物和抑制劑不同，將其分為4個(gè)群，金屬β內(nèi)酰胺酶屬于第三類群。若根據(jù)金屬β內(nèi)酰胺酶的底物特征，又將其分為3a、3b和3c三個(gè)亞群。3a亞群金屬β內(nèi)酰胺酶包括B1和B3兩個(gè)亞類。B1亞類在蠟狀芽孢桿菌、脆弱擬桿菌、黏質(zhì)沙雷菌和銅綠假單胞菌等中發(fā)現(xiàn)，B3亞類在嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌中發(fā)現(xiàn)，其水解β內(nèi)酰胺類抗生素同B1亞類一樣廣泛［5～9］。3b亞群包括B2亞類，多來(lái)自氣單胞菌屬、黃桿菌屬和洋蔥伯克霍爾德菌屬等。特點(diǎn)是底物特異性高，優(yōu)先水解碳青霉烯類抗生素，弱水解青霉素和頭孢菌素，不水解頭孢噻吩。所以并不導(dǎo)致青霉素、頭孢菌素耐藥，屬于真正意義上的碳青霉烯酶。3c亞群主要產(chǎn)自戈氏軍團(tuán)菌，能高效水解頭孢菌素類和碳青霉烯類。

3嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌金屬β內(nèi)酰胺酶特點(diǎn)及作用

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素頭孢他啶、頭孢哌酮、亞胺培南/西司他丁鈉鹽和氨曲南的耐藥率80%，加酶抑制劑抗生素頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率較頭孢哌酮略低，但也提示ESBLs和MBL都參與了對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥。對(duì)產(chǎn)MBL的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌株進(jìn)行體外藥物活性比較，結(jié)果大多數(shù)β內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)產(chǎn)MBL株和非產(chǎn)MBL株敏感性相似，但產(chǎn)MBL株的對(duì)亞胺培南/西司他丁鈉鹽完全耐藥，對(duì)氨曲南的敏感性高于非產(chǎn)MBL株，這可能與MBL的酶學(xué)特性有關(guān)。

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌可產(chǎn)碳青霉烯水解酶，包括Bush分類為3類的金屬β內(nèi)酰胺酶L1酶和一種少見(jiàn)的頭孢菌素酶XMA型酶［10］。L1酶和L2酶的酶學(xué)特性及基因序列現(xiàn)已明確，兩者都為可誘導(dǎo)酶，亞胺培南和頭孢噻肟是誘導(dǎo)劑，L1酶是一種依賴鋅離子的存在而發(fā)揮催化活性的酶，種類多樣，結(jié)構(gòu)不同，等電點(diǎn)不同，產(chǎn)酶率較高，該酶為四聚體，含2個(gè)Zn2+，酶活性依賴Zn2+的存在。該酶以包括碳青霉烯類在內(nèi)的一大類β內(nèi)酰胺類抗生素為底物，其活性可被離子螯合物EDTA、菲咯啉或巰基類化合物所抑制，但不能被常見(jiàn)的β內(nèi)酰胺類抗生素如克拉維酸所抑制。卓超等［11］通過(guò)PCR擴(kuò)增出2株金屬β內(nèi)酰胺酶編碼基因，經(jīng)測(cè)序比較與國(guó)外報(bào)道的L1酶編碼基因(blaS)同源性為99%，對(duì)13株MBL陽(yáng)性株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的耐藥模式進(jìn)行分析，11種抗菌藥表現(xiàn)出8種耐藥模式，不僅不同基因可有不同的耐藥模式，同一種耐藥模式可表現(xiàn)為不同基因型，表明細(xì)菌耐藥模式和基因型之間也無(wú)明確相關(guān)性。可能的原因有：①耐藥基因通過(guò)質(zhì)?；蚱渌麢C(jī)制傳播，使不同的的基因型菌株獲得耐藥基因，產(chǎn)生相同的耐藥模式。Avison等［12］研究發(fā)現(xiàn)，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌攜帶的L1和L2酶編碼基因可位于同一個(gè)約200kb的質(zhì)粒上；②同一種基因型的菌株在外界因素作用下(如抗生素選者擇壓力)發(fā)生基因突變，影響其耐藥機(jī)制，而表現(xiàn)為不同的耐藥模式。經(jīng)接合傳遞的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的β內(nèi)酰胺酶具有IMP的誘導(dǎo)型表達(dá)，而且酶活性可被克拉維酸抑制，故可傳遞的耐藥性可能不是L1、L2酶所致，是由質(zhì)粒攜帶的可水解青霉素類及第三代β內(nèi)酰胺酶類抗生素的廣譜β內(nèi)酰胺酶。

以往對(duì)β內(nèi)酰胺酶L1、L2在共同的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)L1、L2不共同表達(dá)，但調(diào)控機(jī)制間有共同之處。根據(jù)基因序列，已發(fā)現(xiàn)L1有a、b、c、d和e型，L2也有a、c、d、e型，L1e最少見(jiàn)，與其它酶的水解活性明顯不同，可能與底物結(jié)合區(qū)的幾個(gè)非保守氨基酸不同有關(guān)。另外發(fā)現(xiàn)的三個(gè)新基因bl2c、bl2d、bl2e與bl2相比有4%、9%和25%的不同。L1、L2的DNA和氨基酸序列的株間變異均可達(dá)30%，二酶的異質(zhì)性為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌染色體酶所特有［12］，故L1、L2進(jìn)化相當(dāng)快，其進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)力可能與β內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物的選擇壓力有關(guān)。

4嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌金屬酶的檢測(cè)

PCR是檢測(cè)金屬酶最為準(zhǔn)確可靠的方法，特異性和靈敏度都很高。參照GenBank的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌所產(chǎn)生的MBL的全基因序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)保守性好的通用引物，P1：5′GTTTTACACCCTCGCCTTCGCCCT3′，P2：5′GCGGGTCCCGGCCGTTTCCCTGGCCAA3′。但PCR方法容易漏檢新型基因，技術(shù)要求較高，費(fèi)用較大，不利于實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)。用巰基化合物(2巰基丙酸，巰基乙酸)對(duì)金屬酶的抑制作用檢測(cè)金屬酶，易產(chǎn)生假陽(yáng)性［11］。采用亞胺培南乙二胺四乙酸鈉(IMPEDTA)增效試驗(yàn)［13］檢測(cè)金屬酶，與PCR方法有著同樣的準(zhǔn)確性，并且更簡(jiǎn)單實(shí)用。使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFEG)的方法可以進(jìn)行流行病學(xué)研究［14］。

5嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌與金屬β內(nèi)酰胺酶抑制劑的研究

因?yàn)榻饘佴聝?nèi)酰胺酶活性位點(diǎn)有鋅離子，因此克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦等抑制或滅活β內(nèi)酰胺酶絲氨酸位點(diǎn)的酶抑制劑，對(duì)金屬β內(nèi)酰胺酶沒(méi)有作用，并且由于金屬酶的存在，此類抑制劑甚至對(duì)A、C、D類的抑制活性也受到影響。

Denny等［15］發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物高良姜黃素能夠?qū)Σ糠謴氖塞溠抗佯B(yǎng)單胞菌中提出的金屬β內(nèi)酰胺酶起到抑制作用，抑制效果并不能被加入金屬離子ZnCl2而抑制，表明抑制作用與金屬螯合作用無(wú)關(guān)。黃酮類化合物五羥黃酮對(duì)該金屬β內(nèi)酰胺酶也有一定抑制作用。建立在該酶的晶體結(jié)構(gòu)上的分子模型顯示高良姜黃素在該金屬β內(nèi)酰胺酶的活性位點(diǎn)上有一定定向的作用。提示黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)金屬β內(nèi)酰胺酶有一定的影響。

Payne等［16，17］探討了巰基乙酸硫羥酸酯對(duì)金屬型(B)型β內(nèi)酰胺酶的抑制作用。SB214751(2)、SB213079(4)和SB216271(1)都顯示了對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌L1金屬酶極大的活性，并顯示為對(duì)蠟狀芽胞桿菌Ⅱ酶的不可逆的抑制作用。這些巰基乙酸硫羥酸酯衍生物也對(duì)不同金屬β內(nèi)酰胺酶具有抑制作用，對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌L1酶顯示最敏感的抑制活性，但對(duì)脆弱擬桿菌CfiA酶均無(wú)抑酶活性，這是因?yàn)檫@一抑制劑在蠟狀芽胞桿菌Ⅱ，嗜水氣單胞菌CphA和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞L1酶的活性位點(diǎn)與脆弱擬桿菌CfiA酶的活性位點(diǎn)不盡相同。

金屬酶作用機(jī)制復(fù)雜，沒(méi)有相應(yīng)的抑制劑投入，從以上的研究中可為研究抗金屬β內(nèi)酰胺酶的新藥研究提供方向和可能性。

6結(jié)語(yǔ)

盡管金屬β內(nèi)酰胺酶與其它絲氨酸β內(nèi)酰胺酶相比種類和數(shù)量較少，但其耐藥性更廣泛，另外，金屬酶的異質(zhì)性使研究專門(mén)針對(duì)于金屬酶的抑制劑很困難。因此對(duì)其進(jìn)一步深入研究并開(kāi)發(fā)出高效的金屬酶抑制劑是今后一個(gè)重要方向。

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