淺論殼聚糖對(duì)肝癌和肺癌細(xì)胞株糖基化作用的影響

淺論殼聚糖對(duì)肝癌和肺癌細(xì)胞株糖基化作用的影響【摘要】目的：觀察中藥殼聚糖對(duì)肝癌和肺癌細(xì)胞株糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響,探討中藥多糖在腫瘤預(yù)防和治療的應(yīng)用。方法：以濃度為50,100和200mg/L的殼聚糖分別作用于肝癌細(xì)胞株SMMC7721和肺癌細(xì)胞株A549,采用RTPCR方法檢測(cè)多肽：N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2和β3GalT7的表達(dá)水平。結(jié)果：肝癌細(xì)胞株中ppGalNAcT2和β3GalT7僅微弱表達(dá),加藥后作用不明顯；肺癌細(xì)胞株中ppGalNAcT2和β3GalT7均有所表達(dá)，加入不同濃度的殼聚糖之后，ppGalNAcT2和β3GalT7的表達(dá)均受到抑制，且隨著殼聚糖濃度的增加，抑制作用越明顯。結(jié)論：肝癌細(xì)胞株SMMC7721和肺癌細(xì)胞株A549ppGalNAcT2和β3GalT7的表達(dá)不同，殼聚糖能夠抑制肺癌細(xì)胞株A549中的糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAcT2和β3GalT7的表達(dá)，從而抑制了糖基化作用，對(duì)肺癌的預(yù)防和治療具有一定的價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】殼聚糖；肝癌；肺癌；糖基轉(zhuǎn)移酶

［Abstract］Objective:Toobservetheeffectofchitosantotheexpressionofdifferentglycosyltransferasesinlivercancercelllineandlungcancercelllineandtostudytheapplicationofchitosaninpreservationandtreatmentoftumor.Methods：DetecttheexpressionofppGalNAcT2andβ3GalT7inSMMC7721celllineandA549celllinebyRTPCRafterchitosanaddedtothecultureconcentrationofchitosanwas50，100，200mg/L.Results：ThemRNAexpressionofppGalNAcT2andβ3GalT7wasinlowleverinSMMC7721celllineandtheactionwasnotmRNAexpressionofppGalNAcT2andβ3GalT7inA549celllinewasdecreasedafterchitosanaddedtotheculturetheincreasedofconcentration,theinhibitionwasstronger.Conclusion：ThisstudyshowedthattheexpressionofppGalNAcT2andβ3GalT7inSMMC7721celllineandA549celllinewasglycosylationinA549cellswasinhibitedbythechitosanthroughinhibitingtheexpressionofppGalNAcT2andβwasgoodforpreservationandtreatmentoflungtumor.

［Keywords］chitosan；livercancer;lungcancer；glycosyltransferase

中藥多糖廣泛存在于植物、微生物(細(xì)菌和真菌)和海藻中,具有極大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。殼聚糖是采用甲殼素作為原料,通過脫乙酰后制成的一種天然生物高分子,是生物界大量存在的線性氨基多糖,具有廣泛的藥理作用，譬如抑菌作用，調(diào)脂及調(diào)節(jié)血糖作用，抗凝血作用等等。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道殼聚糖具有極佳的抗腫瘤作用，并且無(wú)毒副作用［1］。

腫瘤細(xì)胞糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)異常與腫瘤的生物學(xué)行為,如惡性轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移與浸潤(rùn)等密切相關(guān),而其基礎(chǔ)是糖基轉(zhuǎn)移酶的變化。因此,研究腫瘤細(xì)胞的糖基轉(zhuǎn)移酶變化,有助于了解腫瘤的生物學(xué)行為機(jī)制,利于腫瘤的治療和預(yù)防。本文觀察了不同濃度殼聚糖對(duì)肝癌和肺癌細(xì)胞株糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)差異,以探討糖基轉(zhuǎn)移酶與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系,以及殼聚糖在腫瘤治療和預(yù)防中的作用。

1材料和方法

試劑

Trizol，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶,dNTPMIX,5×MMLV緩沖液，10×PCR緩沖液，MgCl2等均購(gòu)自Invitrogen公司，六堿基隨機(jī)引物購(gòu)自TaKaRa公司，TaqDNA酶購(gòu)自上海捷瑞生物科技有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)及分組

肝癌細(xì)胞株SMMC7721和肺癌細(xì)胞株A549均為本室保存。殼聚糖膠囊由中科院大連化學(xué)物理研究所提供,溶于無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基,mm孔徑的濾膜過濾除菌,4℃放置備用。

SMMC7721和A549用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分組。細(xì)胞分成4組，第1組，即對(duì)照組，加入1ml的培養(yǎng)基；第2組，加入等體積50mg/L的殼聚糖；第3組，加入等體積的100mg/L的殼聚糖；第4組，加入等體積的200mg/L的殼聚糖。然后加入相同體積的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。

RTPCR

RTPCR法檢測(cè)SMMC7721和A549細(xì)胞中ppGalNAcT2，β3GalT7的表達(dá)：將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用PBS洗2次,1500r/min離心5min后棄上清,保留細(xì)胞,Trizol法提取總RNA。取總RNA2μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,圖像分析儀攝像并分析結(jié)果。PCR反應(yīng)體系(50μl),反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；循環(huán)：94℃變性45s,56℃復(fù)性1min,72℃延伸1min,循環(huán)數(shù)30；72℃延伸7min。引物設(shè)計(jì)采用Genetyx軟件,并經(jīng)GenBankBlast進(jìn)行同源檢索后合成。引物由上海Invitrogen公司合成

βactin引物為：F：5′CTCGTGCTACTCTCTCTTTC3′，R：5′CATGTCTCGATCCCACTTAAC3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為211bp。

ppGalNAcT2引物為：F：5′GAAAGAATTAGGAAGGGTCAGAAC3′，R：5′CTGTGTCAATGTAAACATAGCTC3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為668bp。

β3GalT7引物為：F：5′TATGTGCCCGAGTCCTTCTTCG3′，R：5′GCAGTTGTTTCCAGAGCCGAATG3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為303bp。

2結(jié)果

不同濃度殼聚糖對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC7721ppGalNAcT2和β3GalT7表達(dá)的影響

雖然肝癌細(xì)胞的βactin有所表達(dá)，但檢測(cè)不到ppGalNAcT2和β3GalT7表達(dá)，在加入不同濃度的殼聚糖之后，仍未見到ppGalNAcT2和β3GalT7的表達(dá)，可見殼聚糖對(duì)兩者的表達(dá)沒有促進(jìn)或者增強(qiáng)作用。見圖1。

不同濃度殼聚糖對(duì)肺癌細(xì)胞株A549ppGalNAcT2和β3GalT7表達(dá)的影響

肺癌A549細(xì)胞株中ppGalNAcT2和β3GalT7均有表達(dá)，且隨著殼聚糖濃度的增加，表達(dá)量均有所降低。說明殼聚糖對(duì)ppGalNAcT2和β3GalT7的表達(dá)有一定程度的抑制作用。見圖2，圖3。

3討論

所有生物的細(xì)胞表面均覆蓋著反映細(xì)胞種類和狀態(tài)的糖鏈。細(xì)胞癌變過程中總伴有糖鏈結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致構(gòu)成癌細(xì)胞膜的糖脂質(zhì)和糖蛋白改變，而糖鏈的改變又使細(xì)胞間的識(shí)別和聯(lián)系發(fā)生障礙。糖鏈?zhǔn)前匆欢樞蛴商腔D(zhuǎn)移酶合成的。腫瘤發(fā)生中許多糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平或活性都發(fā)生改變，從而影響細(xì)胞的周期調(diào)控和細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。糖基化是真核細(xì)胞蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾方式中的一種。這些糖蛋白與一系列的生物學(xué)功能有著廣泛的聯(lián)系，如細(xì)胞間的黏附，自我與非自我的識(shí)別，分子運(yùn)輸與清除，受體激活，細(xì)胞的內(nèi)吞作用等［2］。在腫瘤生物學(xué)中同樣對(duì)疾病表型和糖基化改變之間的相關(guān)性做了大量研究。在很多情況下，在正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞的過程中，一種或多種糖基轉(zhuǎn)移酶活性的改變與糖基化密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)顯示慢性淋巴細(xì)胞白血病B細(xì)胞表面低水平的BCR表達(dá)，與μ和CD79a鏈的糖基化和折疊損傷有關(guān)［3］。

多肽：N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶催化O聚糖合成的第一步是，將UDPGalNAc上的GalNAc轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)多肽鏈上特定序列中的Thr和Ser的羥基上而合成GalNAcαOSer／Thr多肽。β半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族是糖基轉(zhuǎn)移酶的一個(gè)家族，其β3GalT活性在動(dòng)物廣泛存在，用以形成半乳糖Gal和氨基己糖Hex(NAc)之間的α或β連接。ppGalNAcT2和β3GalT7作為O糖基化的關(guān)鍵酶，參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后糖基化修飾，其表達(dá)異?？稍斐杉?xì)胞表面某些糖蛋白出現(xiàn)缺陷，從而出現(xiàn)某些病理癥狀。

本研究中我們檢測(cè)到肝癌細(xì)胞株SMMC7721中ppGalNAcT2和β3GalT7表達(dá)較低或未表達(dá),加入殼聚糖后其表達(dá)變化并不明顯。而在加入殼聚糖之后，肺癌細(xì)胞株A549中ppGalNAcT2和β3GalT7的mRNA的表達(dá)均降低，且殼聚糖的濃度越高，對(duì)ppGalNAcT2和β3GalT7抑制作用越明顯。說明殼聚糖具有抑制糖基轉(zhuǎn)移酶的作用,從而抑制細(xì)胞表面糖基化，為腫瘤的預(yù)防和治療提供新的方案。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，肺癌細(xì)胞株A549較高程度地表達(dá)ppGalNAcT2和β3GalT7，推測(cè)這兩種糖基轉(zhuǎn)移酶參與了肺癌細(xì)胞的分化，與細(xì)胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)。加入殼聚糖后，ppGalNAcT2和β3GalT7的mRNA表達(dá)量降低，說明殼聚糖通過某種途徑抑制了ppGalNAcT2和β3GalT7的表達(dá)。由于腫瘤發(fā)生中許多糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平或活性都發(fā)生改變，從而影響細(xì)胞的周期調(diào)控和細(xì)胞的增殖能力，因此殼聚糖在腫瘤治療上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，糖基轉(zhuǎn)移酶只與極少數(shù)的糖相互作用，自然界的小分子是許多天然藥物的基礎(chǔ)，而許多天然小分子活性會(huì)因附加其上的糖分子而改變。經(jīng)過基因工程的改造，糖基轉(zhuǎn)移酶能夠用

［1］BerradaM,SerreqiA,DabbarhF，etnovelnontoxiccamptothecinformulationforcancerchemotherapy［J］.Biomaterials，2005，26:2115-2120

［2］OhtsuboK,Marthincellularmechanismsofhealthanddisease［J］.Cell,2006,126(5):855-867.

［3］VuillierF,DumasG,MagnacC,etlevelsofsurfaceBcellreceptorexpressioninchroniclymphocyticleukemiaareassociatedw