淺論殼聚糖對肝癌和肺癌細胞株糖基化作用的影響

淺論殼聚糖對肝癌和肺癌細胞株糖基化作用的影響【摘要】目的：觀察中藥殼聚糖對肝癌和肺癌細胞株糖基轉(zhuǎn)移酶表達的影響,探討中藥多糖在腫瘤預防和治療的應用。方法：以濃度為50,100和200mg/L的殼聚糖分別作用于肝癌細胞株SMMC7721和肺癌細胞株A549,采用RTPCR方法檢測多肽：N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2和β3GalT7的表達水平。結(jié)果：肝癌細胞株中ppGalNAcT2和β3GalT7僅微弱表達,加藥后作用不明顯；肺癌細胞株中ppGalNAcT2和β3GalT7均有所表達，加入不同濃度的殼聚糖之后，ppGalNAcT2和β3GalT7的表達均受到抑制，且隨著殼聚糖濃度的增加，抑制作用越明顯。結(jié)論：肝癌細胞株SMMC7721和肺癌細胞株A549ppGalNAcT2和β3GalT7的表達不同，殼聚糖能夠抑制肺癌細胞株A549中的糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAcT2和β3GalT7的表達，從而抑制了糖基化作用，對肺癌的預防和治療具有一定的價值。

【關鍵詞】殼聚糖；肝癌；肺癌；糖基轉(zhuǎn)移酶

［Abstract］Objective:Toobservetheeffectofchitosantotheexpressionofdifferentglycosyltransferasesinlivercancercelllineandlungcancercelllineandtostudytheapplicationofchitosaninpreservationandtreatmentoftumor.Methods：DetecttheexpressionofppGalNAcT2andβ3GalT7inSMMC7721celllineandA549celllinebyRTPCRafterchitosanaddedtothecultureconcentrationofchitosanwas50，100，200mg/L.Results：ThemRNAexpressionofppGalNAcT2andβ3GalT7wasinlowleverinSMMC7721celllineandtheactionwasnotmRNAexpressionofppGalNAcT2andβ3GalT7inA549celllinewasdecreasedafterchitosanaddedtotheculturetheincreasedofconcentration,theinhibitionwasstronger.Conclusion：ThisstudyshowedthattheexpressionofppGalNAcT2andβ3GalT7inSMMC7721celllineandA549celllinewasglycosylationinA549cellswasinhibitedbythechitosanthroughinhibitingtheexpressionofppGalNAcT2andβwasgoodforpreservationandtreatmentoflungtumor.

［Keywords］chitosan；livercancer;lungcancer；glycosyltransferase

中藥多糖廣泛存在于植物、微生物(細菌和真菌)和海藻中,具有極大的醫(yī)學應用價值。殼聚糖是采用甲殼素作為原料,通過脫乙酰后制成的一種天然生物高分子,是生物界大量存在的線性氨基多糖,具有廣泛的藥理作用，譬如抑菌作用，調(diào)脂及調(diào)節(jié)血糖作用，抗凝血作用等等。近年來有文獻報道殼聚糖具有極佳的抗腫瘤作用，并且無毒副作用［1］。

腫瘤細胞糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)異常與腫瘤的生物學行為,如惡性轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移與浸潤等密切相關,而其基礎是糖基轉(zhuǎn)移酶的變化。因此,研究腫瘤細胞的糖基轉(zhuǎn)移酶變化,有助于了解腫瘤的生物學行為機制,利于腫瘤的治療和預防。本文觀察了不同濃度殼聚糖對肝癌和肺癌細胞株糖基轉(zhuǎn)移酶表達差異,以探討糖基轉(zhuǎn)移酶與腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移能力的關系,以及殼聚糖在腫瘤治療和預防中的作用。

1材料和方法

試劑

Trizol，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶,dNTPMIX,5×MMLV緩沖液，10×PCR緩沖液，MgCl2等均購自Invitrogen公司，六堿基隨機引物購自TaKaRa公司，TaqDNA酶購自上海捷瑞生物科技有限公司。

細胞培養(yǎng)及分組

肝癌細胞株SMMC7721和肺癌細胞株A549均為本室保存。殼聚糖膠囊由中科院大連化學物理研究所提供,溶于無血清的RPMI1640培養(yǎng)基,mm孔徑的濾膜過濾除菌,4℃放置備用。

SMMC7721和A549用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，生長至對數(shù)生長期時進行細胞分組。細胞分成4組，第1組，即對照組，加入1ml的培養(yǎng)基；第2組，加入等體積50mg/L的殼聚糖；第3組，加入等體積的100mg/L的殼聚糖；第4組，加入等體積的200mg/L的殼聚糖。然后加入相同體積的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。

RTPCR

RTPCR法檢測SMMC7721和A549細胞中ppGalNAcT2，β3GalT7的表達：將培養(yǎng)瓶中的細胞用PBS洗2次,1500r/min離心5min后棄上清,保留細胞,Trizol法提取總RNA。取總RNA2μg進行逆轉(zhuǎn)錄反應,再進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,圖像分析儀攝像并分析結(jié)果。PCR反應體系(50μl),反應條件：94℃預變性3min；循環(huán)：94℃變性45s,56℃復性1min,72℃延伸1min,循環(huán)數(shù)30；72℃延伸7min。引物設計采用Genetyx軟件,并經(jīng)GenBankBlast進行同源檢索后合成。引物由上海Invitrogen公司合成

βactin引物為：F：5′CTCGTGCTACTCTCTCTTTC3′，R：5′CATGTCTCGATCCCACTTAAC3′，預期擴增產(chǎn)物長度為211bp。

ppGalNAcT2引物為：F：5′GAAAGAATTAGGAAGGGTCAGAAC3′，R：5′CTGTGTCAATGTAAACATAGCTC3′，預期擴增產(chǎn)物長度為668bp。

β3GalT7引物為：F：5′TATGTGCCCGAGTCCTTCTTCG3′，R：5′GCAGTTGTTTCCAGAGCCGAATG3′，預期擴增產(chǎn)物長度為303bp。

2結(jié)果

不同濃度殼聚糖對肝癌細胞株SMMC7721ppGalNAcT2和β3GalT7表達的影響

雖然肝癌細胞的βactin有所表達，但檢測不到ppGalNAcT2和β3GalT7表達，在加入不同濃度的殼聚糖之后，仍未見到ppGalNAcT2和β3GalT7的表達，可見殼聚糖對兩者的表達沒有促進或者增強作用。見圖1。

不同濃度殼聚糖對肺癌細胞株A549ppGalNAcT2和β3GalT7表達的影響

肺癌A549細胞株中ppGalNAcT2和β3GalT7均有表達，且隨著殼聚糖濃度的增加，表達量均有所降低。說明殼聚糖對ppGalNAcT2和β3GalT7的表達有一定程度的抑制作用。見圖2，圖3。

3討論

所有生物的細胞表面均覆蓋著反映細胞種類和狀態(tài)的糖鏈。細胞癌變過程中總伴有糖鏈結(jié)構(gòu)的改變，導致構(gòu)成癌細胞膜的糖脂質(zhì)和糖蛋白改變，而糖鏈的改變又使細胞間的識別和聯(lián)系發(fā)生障礙。糖鏈是按一定順序由糖基轉(zhuǎn)移酶合成的。腫瘤發(fā)生中許多糖基轉(zhuǎn)移酶的表達水平或活性都發(fā)生改變，從而影響細胞的周期調(diào)控和細胞的增殖能力，促進腫瘤的發(fā)展。糖基化是真核細胞蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾方式中的一種。這些糖蛋白與一系列的生物學功能有著廣泛的聯(lián)系，如細胞間的黏附，自我與非自我的識別，分子運輸與清除，受體激活，細胞的內(nèi)吞作用等［2］。在腫瘤生物學中同樣對疾病表型和糖基化改變之間的相關性做了大量研究。在很多情況下，在正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞的過程中，一種或多種糖基轉(zhuǎn)移酶活性的改變與糖基化密切相關。實驗顯示慢性淋巴細胞白血病B細胞表面低水平的BCR表達，與μ和CD79a鏈的糖基化和折疊損傷有關［3］。

多肽：N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶催化O聚糖合成的第一步是，將UDPGalNAc上的GalNAc轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)多肽鏈上特定序列中的Thr和Ser的羥基上而合成GalNAcαOSer／Thr多肽。β半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族是糖基轉(zhuǎn)移酶的一個家族，其β3GalT活性在動物廣泛存在，用以形成半乳糖Gal和氨基己糖Hex(NAc)之間的α或β連接。ppGalNAcT2和β3GalT7作為O糖基化的關鍵酶，參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后糖基化修飾，其表達異?？稍斐杉毎砻婺承┨堑鞍壮霈F(xiàn)缺陷，從而出現(xiàn)某些病理癥狀。

本研究中我們檢測到肝癌細胞株SMMC7721中ppGalNAcT2和β3GalT7表達較低或未表達,加入殼聚糖后其表達變化并不明顯。而在加入殼聚糖之后，肺癌細胞株A549中ppGalNAcT2和β3GalT7的mRNA的表達均降低，且殼聚糖的濃度越高，對ppGalNAcT2和β3GalT7抑制作用越明顯。說明殼聚糖具有抑制糖基轉(zhuǎn)移酶的作用,從而抑制細胞表面糖基化，為腫瘤的預防和治療提供新的方案。

我們的實驗結(jié)果還顯示，肺癌細胞株A549較高程度地表達ppGalNAcT2和β3GalT7，推測這兩種糖基轉(zhuǎn)移酶參與了肺癌細胞的分化，與細胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)的改變密切相關。加入殼聚糖后，ppGalNAcT2和β3GalT7的mRNA表達量降低，說明殼聚糖通過某種途徑抑制了ppGalNAcT2和β3GalT7的表達。由于腫瘤發(fā)生中許多糖基轉(zhuǎn)移酶的表達水平或活性都發(fā)生改變，從而影響細胞的周期調(diào)控和細胞的增殖能力，因此殼聚糖在腫瘤治療上具有重要的應用價值。同時，糖基轉(zhuǎn)移酶只與極少數(shù)的糖相互作用，自然界的小分子是許多天然藥物的基礎，而許多天然小分子活性會因附加其上的糖分子而改變。經(jīng)過基因工程的改造，糖基轉(zhuǎn)移酶能夠用

［1］BerradaM,SerreqiA,DabbarhF，etnovelnontoxiccamptothecinformulationforcancerchemotherapy［J］.Biomaterials，2005，26:2115-2120

［2］OhtsuboK,Marthincellularmechanismsofhealthanddisease［J］.Cell,2006,126(5):855-867.

［3］VuillierF,DumasG,MagnacC,etlevelsofsurfaceBcellreceptorexpressioninchroniclymphocyticleukemiaareassociatedw