雞精液冷凍技術(shù)操作規(guī)程

雞精液冷凍技術(shù)規(guī)程1范圍2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。牛冷凍精液包裝、標(biāo)簽、儲(chǔ)存和運(yùn)輸GB/T30396牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1234家禽精液品質(zhì)檢測(cè)方法NY/T40473術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。4器具清洗與消毒重復(fù)使用的器皿，使用后立即用清水浸泡，其它操作按NY/T1234的規(guī)定執(zhí)行。5精液采集、稀釋（I液）與質(zhì)量檢測(cè)5.1提前2h將用到的稀釋液，從冷凍室置入冷藏室。5.2采用背腹部聯(lián)合按摩雙人或單人采精法，手握預(yù)熱含有0.2mL左右第一步稀釋液（簡(jiǎn)稱“I液”）的5mL離心管采集單只公雞精液，輕輕混勻后，置于2℃～5℃冷藏箱中（可以用冰水混合物）。依次采集完所有公雞精液后，立即運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。5.3將稀釋后精液轉(zhuǎn)移至2℃～5℃冷藏箱，從第一步稀釋后冷藏計(jì)時(shí)約30min。同時(shí)取10μL精液在32℃視屏恒溫顯微鏡下觀察，活力≥0.7（評(píng)定依據(jù)見附錄C），密度≥1.5×109/mL用于精液冷凍，眼觀密度評(píng)定見附錄C。一般稀釋比例為原精與稀釋液1：1，如果密度太高則再利用等溫I液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。5.4如果遠(yuǎn)距離運(yùn)輸原精制作凍精，用I液等比稀釋后存放于2℃～5℃冷藏箱，應(yīng)在4h內(nèi)進(jìn)行凍精制作。6冷凍保護(hù)液（II液）添加與細(xì)管精液制作6.1將已預(yù)冷或現(xiàn)配的第二步稀釋液即冷凍保護(hù)液（簡(jiǎn)稱“II”液），按精液與稀釋液比例1：1（含甘油濃度為12%）或者1：0.5（含甘油濃度為18%），加入到第一次稀釋平衡后的精液中，甘油終濃度為6%，并在2℃～5℃條件下平衡10min。6.2將細(xì)管（規(guī)格0.25mL）棉塞端朝上，插入第二次平衡后的稀釋精液中，吸取精液，細(xì)管中間段留約1cm空氣柱，用紙巾擦干細(xì)管外壁，再在封口粉中插入幾次，使細(xì)管端含粉2mm左右，再用紙巾擦干凈細(xì)管外壁，存放于2℃～5℃。封口粉事先分裝在2mL～5mL離心管中，根據(jù)一次封口的細(xì)管數(shù)量確定粉封裝量，分裝的封口粉只使用一次。7細(xì)管冷凍7.1液氮面距離法冷凍在細(xì)管開始冷凍前10min將液氮倒入泡沫箱，液氮面離箱底深度3cm～4cm。將細(xì)管鋪放在細(xì)管導(dǎo)板上，可以按家系，或者其它目的的分組，用無(wú)紡布醫(yī)用膠帶分段黏貼住棉塞端（粘貼強(qiáng)度根據(jù)解凍時(shí)拆卸細(xì)管難易程度調(diào)整），形成細(xì)管帶組，并用記號(hào)筆在膠帶上標(biāo)示組別。將高度為5cm～6cm泡沫框套入細(xì)管導(dǎo)板，將細(xì)管帶整體轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的泡沫框上，再將載有細(xì)管帶的泡沫框置于液氮面上，使細(xì)管帶離液氮面的距離為5cm～6cm，蓋上泡沫箱蓋，靜置5min，結(jié)束后細(xì)管帶立即浸入液氮中15min以上。7.2程序冷凍儀冷凍將細(xì)管帶置于冷凍室，以-7℃/min從5℃下降到-35℃，再以-60℃/min從-35℃下降到-140℃，結(jié)束后細(xì)管帶立即進(jìn)入液氮中。8細(xì)管解凍及活力檢測(cè)8.1在液氮中用兩把長(zhǎng)柄鑷子，將細(xì)管從細(xì)管帶中分離，迅速浸入5℃水浴解凍1min～3min，擦干表面水分，先剪掉粉封口端，插入2mL離心管，再用推針將棉塞下推擠出精液，或者剪掉棉塞端（精液自然流出，管內(nèi)余液可采用消毒餐巾紙遮蓋細(xì)管上端后再吹出，這種方法適合大批量細(xì)管解凍方式），并按照NY/T4047的規(guī)定檢測(cè)精子活力，活力≥0.4為合格。大批量解凍時(shí)，要注意細(xì)管浸入冰水混合物后，及時(shí)攪動(dòng)，避免細(xì)管外圍結(jié)冰影響解凍效果。8.2對(duì)所有待制作凍精公雞個(gè)體進(jìn)行抗凍性評(píng)價(jià)，重復(fù)3次，合格者進(jìn)行后續(xù)凍精制作。9離心去甘油（III液、=4\*ROMANIV液）9.1冷凍離心機(jī)溫度調(diào)試將離心管中裝入一定量水置入離心機(jī)，根據(jù)環(huán)境溫度高低，設(shè)置離心機(jī)溫度-10℃～2℃，以600×g離心10min，運(yùn)行1輪～2輪，用線徑0.5mm熱電偶電子溫度計(jì)快速檢測(cè)離心管中水溫是否在5℃左右，如果過(guò)高則將離心機(jī)溫度設(shè)置更低后再運(yùn)行一輪。9.2解凍精液的稀釋解凍后的樣品置于2℃～5℃冷藏箱中，按解凍精液與清洗液（簡(jiǎn)稱“III液”）1:2的比例添加。分6次完成，每次加入III液后輕輕混勻，并間隔2min。即當(dāng)解凍后精液體積為1mL，則加入清洗液的體積依次為35μL（1:0.035）、90μL（1:0.09）、165μL（1:0.165）、300μL（1:0.3）、620μL（1:0.62）和790μL（1:0.79），添加清洗液總體積為2mL。9.3稀釋精液的離心與重懸將加入III液后精液置入離心機(jī)，使轉(zhuǎn)子內(nèi)離心管重量平衡，以600×g離心10min，棄上清；再用與解凍后精液等體積的重懸液（簡(jiǎn)稱“=4\*ROMANIV”液）重懸沉淀，混勻，再用600×g離心5min，棄上清，再用與解凍后精液等體積的=4\*ROMANIV液重懸沉淀，存放于2℃～5℃冷藏箱中，或者置于冰水混合物中，立即運(yùn)輸至雞舍。10輸精和冷凍精液受精率檢測(cè)10.1下午16:00以后，用1mL注射器吸取冷凍精液，每只母雞輸精體積約為0.2mL（有效精子數(shù)≥4.0×107個(gè)），輸精深度為4cm。10.2前2d每天輸精1次，第一次輸精后24h即開始收集種蛋（該天種蛋用于檢測(cè)是否受精率為零），隨后種蛋用于檢測(cè)受精率與受精蛋孵化率。11細(xì)管冷凍精液的保存11.1在泡沫箱液氮中，將浸入液氮的細(xì)管組用長(zhǎng)柄鑷子去掉膠帶，細(xì)管棉塞端置入拇指管底端，一般一管可置入25支0.25mL細(xì)管。11.2包裝、標(biāo)簽、儲(chǔ)存和運(yùn)輸參照GB/T30396的規(guī)定執(zhí)行。附錄A（資料性）器具與耗材清單1.液晶顯示屏恒溫顯微鏡（20倍物鏡）。2.2-5℃操作冷藏箱，采精精液冷藏箱（方便攜帶的小泡沫箱）。3.10uL、200uL、1mL移液槍；1mL、200uL槍頭。4.0.25mL細(xì)管；2mL、5mL、10mL離心管。5.載玻片、蓋玻片。6.自配稀釋液設(shè)備（購(gòu)買稀釋液則不需要）：滲透壓測(cè)定儀；酸度計(jì)；高壓滅菌鍋；超凈工作臺(tái)；磁力攪拌儀；石英蒸餾水器等。7.簡(jiǎn)易冷凍裝置泡沫箱，深度至少25cm，厚度4.5cm，長(zhǎng)、寬大于泡沫框即可。泡沫框，1cm3個(gè)，4cm1個(gè)；框14.5×25.0（外徑cm），厚度1.8cm8.商業(yè)化程序冷凍儀、便攜式程序冷凍儀。9.液氮罐2個(gè)，液氮。10.細(xì)管鋪放板、封口粉、醫(yī)用無(wú)紡?fù)笟饧埬z帶、布膠布。11.拇指管、拇指管袋、棉線。12.長(zhǎng)柄鑷子2把，中柄鑷子1把，剪刀1把，細(xì)管推針1根。13.標(biāo)簽紙，衛(wèi)生紙，記號(hào)筆，冰袋。14.便攜式冷凍離心機(jī)（5-10mL，1000g以下）。15.超低溫溫度計(jì)（直徑0.5mmT型熱電偶探頭）。16.精液稀釋液（自配或者購(gòu)買）。17.插線板1個(gè)。18.恒溫干燥箱。19.5mL、10mL離心管盒附錄B（資料性）參考稀釋液配方（100mL）中文試劑名英文用量葡萄糖（一水）Glucosemonohydrate0.53g檸檬酸鉀（一水）Potassiumcitratetribasicmonohydrate0.102gL-谷氨酸鈉（一水）L-Sodiumglutamate.H2O1.21g乙酸鎂（四水）Magnesiumacetatetetrahydrate0.064gBES（N，N-雙（2-羥乙基）-2-氨基乙磺酸）N，N-Bis（2-hydroxyethyl）-2-aminoethanesulphonicacid2.43gNaOH0.185gpH7.1滲透壓320mOsm/kg注：使用該配方時(shí)，代替正文中的“I-=4\*ROMANIV”液，其它操作方法相同。附錄C（資料性）精子密度估測(cè)法示例C.1精子密度估測(cè)法圖例a）精子密度40×108個(gè)/mLb）精子密度20×108個(gè)/mLc）精子密度10×108個(gè)/mLd）精子密度5×108個(gè)/mL圖C.1精子密度估測(cè)法