梨黑斑病的LAMP檢測方法

梨黑斑病的LAMP檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了梨黑斑病的LAMP檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于我省梨黑斑病檢測的組織和人員。2規(guī)范性引用文件下列文件中條款，通過在本規(guī)程的引用而成為本規(guī)程的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本規(guī)程，然而，鼓勵根據(jù)本規(guī)程達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本規(guī)程。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3梨黑斑病的基本信息梨黑斑病的病原菌，發(fā)病癥狀參見附錄A。4方法原理根據(jù)梨黑斑病病原菌的cytb序列設(shè)計的特異性引物進行LAMP檢測作為判斷梨黑斑病的依據(jù)。根據(jù)梨黑斑病菌的形態(tài)特征和對寄主造成的發(fā)病癥狀特征為依據(jù)。5儀器設(shè)備5.1高速離心機：轉(zhuǎn)速≤15000r/min5.2渦旋振蕩器5.3恒溫金屬浴5.4顯微鏡：物鏡頭10×~40×5.5光照培養(yǎng)箱：20℃~30℃5.6冰箱：4℃~-20℃、-80℃5.7高壓滅菌鍋5.8電泳儀5.9凝膠成像儀5.10可調(diào)移液器:1-10μL，10μL-100μL，100μL-1000μL5.11玻璃或一次性塑料培養(yǎng)皿5.12天平：精度0.001g5.13玻璃三角瓶5.14超級工作臺6試劑和培養(yǎng)基6.1CTAB提取液（參見附錄B）6.2BstDNA聚合酶6.3無水乙醇6.410%SDS6.5酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）6.6氯仿6.7異丙醇6.8TE（pH8.0）6.9TAE電泳緩沖液（pH8.5）6.10WA培養(yǎng)基（參見附錄B）6.11PDA培養(yǎng)基（參見附錄B）6.12甜菜堿6.13顯色劑SYBRGreenI除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑，實驗用水符合GB/T6682中三級水的標(biāo)準(zhǔn)。7梨黑斑病的LAMP檢測7.1病原菌分離與純化將梨病果用75%乙醇表面消毒后，于病健交界處取少量組織置于WA培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待長出菌絲后，切取一小塊放在PDA培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)7天左右，收集菌絲于4℃?zhèn)溆谩?.2供試DNA提取取少量菌絲粉，加入900μL2%CTAB提取液和90μL10%SDS，渦旋混勻，于60℃水浴1h，期間每隔10min上下顛倒幾次，常溫條件下12000rpm離心10min；取上清，加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），顛倒混勻，常溫條件下12000rpm離心5min；將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入等體積氯仿，輕輕顛倒混勻，常溫條件下12000rpm離心5min；上清轉(zhuǎn)移至新EP管中，加入1倍于上清體積的異丙醇，-20℃條件沉淀15min；常溫條件下12000rpm離心5min，傾去上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，37℃條件下待乙醇揮發(fā)干；加適量滅菌超純水或者TE（pH8.0）溶解沉淀（含20μg/mlRNase），37℃消解30min后電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆??；虿捎檬惺壅婢鶧NA提取試劑盒，按照相應(yīng)操作說明書提取DNA備用。7.3引物設(shè)計通過對GenBank中的序列信息進行比對分析，選擇cytb作為目標(biāo)基因，并通過在線網(wǎng)站（://primerexplorer.jp/e/）設(shè)計檢測梨黑斑病的LAMP檢測特異性引物組。F3：5’-GGCTCCTTTGAATGGTAAC-3’；B3：5’-TGTCTTCAACCAAGCATCA-3’；FIP：5’-CGCTGCAAGTAATCTATAAATCGGATTCAATAGGCAAATGGGGA-3’；BIP：5’-AATGGATCAAGAACGTTCAACGAATTGGTTGTGGGGTACTC-3’。7.4LAMP檢測體系LAMP擴增反應(yīng)體系總體積為20μL，由下列濃度體積的組分組成：名稱濃度加入量F310μM0.6μLB310μM0.6μLFIP40μM0.6μLBIP40μM0.6μLMgCl225mM3.2μLBetaine4M1.6μLdNTPs10mM2.0μLBstDNA聚合酶8U/μL0.8μL10×ThermoPol2.5μLDNA模板40ng/μL1μL，用無菌雙蒸水補充擴增體系體積至20μL。LAMP擴增的反應(yīng)條件為：65℃保溫60min。8結(jié)果判定LAMP擴增反應(yīng)結(jié)束按照以下任意一種方式觀察結(jié)果：1）向擴增產(chǎn)物中加入顯色劑SYBRGreenI，輕晃混勻，觀察顏色變化；2）取擴增產(chǎn)物在3%X脂糖凝膠電泳中低壓電泳，觀察擴增條帶。如果LAMP擴增產(chǎn)物顯示黃綠色，電泳圖譜為梯狀條帶，表明含有鏈格孢菌；如果擴增產(chǎn)物為橙紅色，電泳圖譜無擴增條帶，表明不含有鏈格孢菌（參見附錄C）。同時，根據(jù)科赫氏法則，用分離的病原菌接種于健康梨葉或梨果誘導(dǎo)發(fā)病后，發(fā)病癥狀與田間梨黑斑病自然發(fā)病癥狀一致，且可分離出相同病原菌，則判定分離的病原菌為梨黑斑病致病菌。9樣品、菌株保存檢測鑒定后保存樣品，以備復(fù)驗、談判和仲裁。由鑒定人標(biāo)識確認、樣品管理員登記，置于超低溫冰箱保存。保存期滿，需經(jīng)滅菌后方可處理。

（資料性附錄）梨黑斑病的基本信息A.1梨黑斑病的病原菌梨黑斑病是由鏈格孢（Alternariaspp.）類真菌引起的，目前世界上已報道的從梨果實上分離到的鏈格孢共有9組，已命名的有9個種（張?zhí)煊睿?003；Roberts，1993；Roberts，2005；Roberts，2007）。在中國已報道的有6個種，分別是梨黑斑鏈格孢（AlternariagaisenK.Nagan）、鏈格孢（A.alternata（Fr.）Keissler）、細極鏈格孢（A.tenuissima）、侵染鏈格孢（A.infectoria）、鴨梨侵染鏈格孢（A.yaliinficiensR.G.Roberts）和（A.ventricosaR.G.Roberts）。其中A.gaisen既能侵染梨葉片也能侵染梨果實，被認為是我國梨黑斑病的主要致病種。而根據(jù)文獻報導(dǎo)以及我們近年來從XX酥梨果實上分離的梨黑斑病菌的結(jié)果表明，A.alternata是梨果實黑斑病上的主要病原菌。A.2梨黑斑病的病害癥狀該病主要危害果實、葉和新梢。葉部受害，幼葉先發(fā)病、褐至黑褐色圓形斑點，后逐漸擴大，形成近圓形或不規(guī)則形病斑，中心灰白至灰褐色，邊緣黑褐色，有時有輪紋。病葉即焦枯、畸形，早期脫落。天氣潮濕時，病斑表面產(chǎn)生黑色霉層。即病菌的分生孢子梗和分生孢子。果實受害，果面出現(xiàn)一至數(shù)個黑色斑點，漸擴大，顏色變淺，形成淺褐至灰褐色圓形病斑，略凹陷。發(fā)病后期病果畸形、龜裂，裂縫可深達果心，果面和裂縫內(nèi)產(chǎn)生黑霉，并常常引起落果。果實近成熟期染病，前期表現(xiàn)與幼果相似，但病斑較大黑褐色，后期果肉軟腐而脫落。新梢發(fā)病，病斑圓形或橢圓形、紡錘形、淡褐色或黑褐色、略凹陷、易折斷。西洋梨、日本梨、酥梨、雪花梨最易感病，發(fā)病嚴重時會引起早期落葉和嫩梢枯死，致使裂果和早期落果，嚴重削弱樹勢，降低樹體的生長勢和抗病能力，降低樹體的生長勢和抗病能力。A.3分布在中國主要梨區(qū)普遍發(fā)生。（資料性附錄）試劑和培養(yǎng)基B.12×CTAB提取液B.1.1100mmol/LTris-HCl（pH8.0）B.1.220mmol/LEDTAB.1.31.4mol/LNaClB.1.42%（w/v）CTABB.1.540mmol/L巰基乙醇（用時加入）B.2TE緩沖液B.2.110mmol/LTris-HCL（pH8.0）B.2.21mmol/LEDTAB.3TAE電泳緩沖液（pH8.5）配方（50x）B.3.1Tris242gB.3.2Na2EDTA·2H2037.5gB.3.3冰乙酸57.1mLB.3.4水1000mLB.4WA培養(yǎng)基：1000毫升體系B.4.1X脂粉20gB.4.2水1000mL注：121℃高壓滅菌30分鐘。B.5PDA培養(yǎng)基：1000毫升體系B.5.1馬鈴薯（去皮）200克B.5.2蔗糖（或葡萄糖）20克B.5.3X脂粉