植物組織培養(yǎng)

“植物的組織培養(yǎng)”實驗改進

——選自《生物·選修一·生物技術(shù)實踐》目錄1實驗原理

3優(yōu)化實驗4討論反思

5試題分析

2教材實驗分析

6參考文獻實驗原理細胞全能性植物體的根莖葉細胞一般具有全能性。在一定的營養(yǎng)和激素等條件下，可以脫分化形成愈傷組織。將愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有不同激素成分的培養(yǎng)基上，就可以誘導(dǎo)其再分化生成胚狀體或從芽，進而發(fā)育成完整的小植株。植物組織培養(yǎng)的全過程，證明了分化的植物細胞，仍具有形成完整植株所需要的全部基因。實驗原理植物細胞表現(xiàn)出全能性的條件：1）有一定營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件(如無菌、溫度、pH）。2）離體狀態(tài)。影響植物組織培養(yǎng)成功的因素外植體的選擇（植株種類、部位選?。┡囵B(yǎng)基種類濃度激素種類和濃度培養(yǎng)基的pH培養(yǎng)條件(包括通氣狀況、光照強度、日照時長、溫度)培養(yǎng)時間（移栽時間）材料處理（消毒方式、外植體大小）接種方式實驗原理1）根據(jù)培養(yǎng)材料不同分為：植株培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)的類型矮牽牛莖尖離體培養(yǎng)培養(yǎng)

牡丹成熟胚的離體培養(yǎng)與快速繁殖Matureembryocultureandrapidpropagationoftreepeony微型月季莖段離體培養(yǎng)花燭葉片離體快速繁殖實驗原理2）根據(jù)器官發(fā)生途徑分為：直接器官發(fā)生途徑：植物器官可以直接由外植體上誘導(dǎo)。間接器官發(fā)生途徑：成熟細胞經(jīng)過脫分化及再分化過程而形成新的組織和器官的過程。植物組織培養(yǎng)的類型直接器官發(fā)生間接器官發(fā)生體細胞胚胎發(fā)生教材實驗分析直接器官發(fā)生：菊花組織培養(yǎng)（浙科版）間接器官發(fā)生：胡蘿卜的組織培養(yǎng)（人教版）教材實驗分析（浙科版）實驗?zāi)康模?、進行菊花的組織培養(yǎng)

2、嘗試植物激素的應(yīng)用實驗設(shè)備及用品：100ml三角瓶或大口培養(yǎng)瓶、鑷子、超凈臺、滅菌鍋、封口膜和橡皮圈、有棉球的廣口瓶、

酒精燈、三角漏斗、培養(yǎng)皿實驗材料：1、MS培養(yǎng)基:由大量元素、微量元素和有機成分組成，配方如下表。也可將大量元素、微量元素和有機成分分別配成濃度為配方的5~10倍的母液，用時稀釋。大量元素mg/L微量元素mg/L微量元素mg/L有機成分mg/LNH4NO3KNO3CaCI2?2H2OMgSO4?7H2OKH2PO416501900440370170KIH3BO3MnSO4?4H2OZnSO4?7H2ONa2MoO4?2H2O0.836.222.38.60.025CuSO4?5H2OCoCI2?6H2ONa2ˉEDTAFeSO4?7H2O蔗糖（g/L）0.0250.02537.327.830肌醇煙酸鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素甘氨酸1000.50.50.12.0教材實驗分析（浙科版）2、萘乙酸NAA（少量0.1mol/L氫氧化鈉溶解），芐基腺嘌呤BA（少量0.1mol/L鹽酸溶解）3、發(fā)芽培養(yǎng)基：4、生根培養(yǎng)基：3000mlMS培養(yǎng)基+含1.5mgBA的溶液+含0.02mgNAA的溶液+30g蔗糖+40g瓊脂，再加蒸餾水至4000ml，混合均勻，加熱至瓊脂融化后，通過三角漏斗分裝至100ml三角瓶中，每瓶40ml，共100瓶。三角瓶加上封口膜后1kpa壓力下在滅菌鍋中滅菌20min。1000mlMS培養(yǎng)基+含0.38mgNAA的溶液+30g蔗糖+20g瓊脂，再加蒸餾水至2000ml，混合均勻，加熱至瓊脂融化后，通過三角漏斗分裝至100ml三角瓶中，每瓶40ml，共50瓶。三角瓶加上封口膜后1kpa壓力下在滅菌鍋中滅菌20min。實驗材料：助溶混勻分裝滅菌實驗培養(yǎng)基配制激素母液6-BA1ml1MKOH溶解適量的6-BA，然后加水定容，配制成濃度為0.5mg/ml的母液制作培養(yǎng)基（每10個人制500ml）A法依照中學(xué)教科書B法加入大約400ml蒸餾水，依次加入蔗糖15g，MS鹽2.5g，6-BA2ml，充分溶解，調(diào)節(jié)pH到5.8-6.0；每個組培瓶中稱取0.4g瓊脂，然后加入50ml的MS培養(yǎng)液。封口滅菌。作業(yè)：比較2種方法的優(yōu)缺點觀察滅菌后未凝固前培養(yǎng)基的顏色；培養(yǎng)基凝固程度跟什么有關(guān)教材實驗分析（浙科版）

6、再轉(zhuǎn)移至土中培養(yǎng)（定植），即可長成植株并開花。離體植物組織的制備接種叢狀苗培養(yǎng)生根培養(yǎng)移栽定植實驗步驟1、在超凈臺中，取出一瓶已進行過無菌培養(yǎng)的菊花幼苗，在無菌培養(yǎng)皿上用無菌鑷子和無菌解剖刀切成幾片，每段至少有1張葉片。2、在酒精燈旁，將每段放入1瓶生芽培養(yǎng)基中，使莖的一部分插入培養(yǎng)基蓋上封口膜。每瓶也可放入2~3段幼莖切斷。3、在日光燈下保持18~25℃的溫度培養(yǎng)，每天的光照不少于14.5h。4、2~3周后將生長健壯的叢壯苗在無菌條件下一個個轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)。5、待生根后，將苗移至草炭土或蛭石中，用玻璃罩或塑料布保持80%以上的濕度，2~3天后打開玻璃罩逐漸降低濕度鍛煉，直到將罩全部打開處于自然濕度下為止。教材實驗分析（浙科版）1、實驗選材：無菌培養(yǎng)的菊花幼苗帶葉莖段(或自然生長的莖：70%乙醇+5%次氯酸鈉5min2次+超凈臺無菌水沖洗)優(yōu)點：無菌培養(yǎng)植株自身帶有病菌較少，省去消毒過程。

帶葉莖段，較葉根等部位更易在較短時間內(nèi)誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生。

不足：學(xué)生實驗植株需要量大，無菌苗獲取存在一定難度。

外植體消毒不在超凈工作臺中進行，消毒效果有待驗證,無菌水洗后未吸干水分。

未說明菊花具體品種，不利于實驗開展。

2、實驗步驟：（1）培養(yǎng)基配置：

優(yōu)點：先分裝后滅菌，省去倒板步驟，避免倒板過程中培養(yǎng)基污染并減少實驗前期準(zhǔn)備。不足：1）未調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值。定容后，根據(jù)文獻調(diào)節(jié)pH。2）NAA高溫滅菌易失活。建議使用過濾滅菌配制母液，再將之加入高溫滅菌的培養(yǎng)基中3）MS母液配制繁雜，表述存在歧義。購買市售MS粉末，根據(jù)說明書配制。

實驗分析及優(yōu)化教材實驗分析（浙科版）2、實驗步驟（2）接種操作:

不足：1）僅在酒精燈旁，無菌環(huán)境控制不嚴(yán)謹。建議在滅菌后的超凈工作臺中操作。2）在無菌培養(yǎng)皿上切取莖段，多次操作后，易造成交叉污染。建議滅菌濾紙片上進行操作，一輪

操作后，更換濾紙。3）刀具使用前后，未灼燒滅菌，易造成污染。建議在處理一枝莖段后，火焰灼燒滅菌。（3）煉苗土培:優(yōu)點：濕度逐漸降低，有助于試管苗適應(yīng)環(huán)境。不足：根部培養(yǎng)基未除盡，草炭土或蛭石未經(jīng)消毒處理。建議自來水沖凈根部培養(yǎng)基，草炭土或蛭石高

壓滅菌或烘烤滅菌。組培苗特點：生長細弱，角質(zhì)層不發(fā)達根系不發(fā)達，吸收功能弱葉片通常沒有表皮毛，甚至葉片上出現(xiàn)大量的水孔葉綠體光合性差氣孔數(shù)量、大小超過普通苗對環(huán)境的適應(yīng)性和抵抗能力差教材實驗分析（浙科版）3.思考題1)不同植物、不同組織的生根和生芽是否都可使用與本實驗相同的生長素和細胞分裂素？2)本實驗用人工合成的激素，而不用植物中存在的天然激素，為什么？3)如果在自然界取植物樣本進行組織培養(yǎng)，你認為應(yīng)采取什么措施保護樣本不被污染？不可以，不同植物、不同組織的生根和生芽對生長素和細胞分裂素濃度的需求是不一樣的。理論上每個細胞都具有全能性，實際表達難易程度卻隨植物種類、組織和細胞的不同而異。因此，不可貿(mào)然使用與本實驗相同的生長素和細胞分裂素濃度。創(chuàng)造無菌操作環(huán)境;設(shè)計合理的外植體消毒方式;操作快速，減少外植體接觸。人工合成的激素，在植物體內(nèi)沒有相應(yīng)的分解酶，所以作用和存在時間長，效果更明顯。植物中存在的天然激素，植物體內(nèi)有相應(yīng)使之分解酶，因此其在植物體內(nèi)作用和存在時間較短。教材實驗分析（人教版）實驗步驟：選材（胡蘿卜根）消毒取樣接種愈傷組織誘導(dǎo)試管苗誘導(dǎo)移栽教材實驗分析（人教版）1、實驗選材：胡蘿卜塊根形成層

優(yōu)點：實驗材料易獲取。

不足：以塊根為外植體，污染率較高。2、實驗步驟：（1）培養(yǎng)基配制：該步驟被省略，培養(yǎng)基濃度未做說明，不利于實驗準(zhǔn)備工作開展。（2）接種操作：

優(yōu)點：強調(diào)無菌操作。

不足：外植體消毒方案耗時過長。建議消毒方式：70%酒精30s+20%NaClO15min+灼燒12s（3）煉苗土培：煉苗被省略，移栽過程過于簡化，不利于教師參考實施。實驗分析及優(yōu)化外植體消毒：在超凈工作臺（或接種箱）上將胡蘿卜段用酒精溶液消毒30s后，立即用無菌水清洗2~3次，再用次氯酸鈉溶液處理30min后，立即用無菌水清洗2~3次。煉苗土培：培養(yǎng)一段時間后，生長良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時間后，胡蘿卜的愈傷組織就可以誘導(dǎo)出試管苗。然后將試管苗移栽到大田，培養(yǎng)成正常植株。優(yōu)化實驗——技術(shù)路線查閱文獻，確定選材（植株種類及部位：本氏煙葉片）明確實驗步驟用具購買清洗儀器高壓滅菌，烘干備用試劑配制（消毒劑、植物激素等）培養(yǎng)基配制（長芽培養(yǎng)基：MS+1mg/L6-BA、生根培養(yǎng)基：MS）外植體取材及預(yù)處理外植體消毒，無菌接種移栽，誘導(dǎo)生根煉苗，移栽土培觀察植記錄株變化情況，討論出現(xiàn)的問題撰寫實驗報告組培間環(huán)境：溫度（25±1）℃，光照時常：12h/d，光照強度:20001Lx大約6周后，愈傷組織分化形成幼芽。10-12d，幼芽基部形成白色幼根，25d后形成完整煙草植株。優(yōu)化實驗——實驗步驟1.材料與器材1）植物材料：本氏煙煙草葉片。（組培技術(shù)成熟、生長周期短，離體再生頻率高）2）實驗藥品：MS培養(yǎng)基、蔗糖、植物凝膠、6-BA、NaOH固體粉末、12mol/LHCl（分析純）、分析純NaClO

（10.5%，密度1.07g/mL）、多菌靈、75%酒精、去離子水、無菌水、蒸餾水。3）儀器設(shè)備：高壓滅菌鍋、光照培養(yǎng)箱、天平、PH計、超凈工作臺、烘箱。4）器械及用具：移液槍、移液槍槍頭、鑷子、剪刀、刀、濾紙、藥匙、濾紙、報紙、記號筆、酒精燈、打火機、

小鐵架、標(biāo)簽紙、塑料薄膜袋、盆土（碧糠灰、泥炭土和蛙石1：1：1混合）、6*6cm塑料缽。5）玻璃器皿：細口瓶、培養(yǎng)瓶、三角燒瓶、培養(yǎng)皿、量筒、容量瓶、玻璃棒、燒杯、膠頭滴管。優(yōu)化實驗——實驗步驟2.器皿洗滌1)新購置的玻璃器皿：1%HCl浸泡12h+洗潔精洗滌+清水沖洗+去離子水洗滌+晾干備用。2)已用過的玻璃器皿：洗潔精洗滌（培養(yǎng)瓶需浸泡24h）+清水沖洗+去離子水洗滌+晾干備用。3)新購置的塑料器皿：打開即用。4)已用過的塑料器皿：2%NaOH浸泡12h+清水沖洗+2%-5%鹽酸浸泡30min+清水沖洗+去離子水洗+晾干備用。5)金屬器皿：75%酒精擦洗+晾干備用。3.器皿滅菌處理晾干后的器具高壓滅菌箱121℃，20min滅菌處理，冷卻，烘箱烘干備用。需滅菌器皿：刀具（透明塑料袋分裝：鑷子、剪刀、刀）、濾紙（置于培養(yǎng)皿中，報紙包好）、培養(yǎng)瓶、

槍頭、50ml離心管、細口瓶優(yōu)化實驗——實驗步驟4.試劑配制：氫氧化鈉溶液的配制以0.1mol/LNaOH500ml為例1）計算：NaOH物質(zhì)的量＝0.1mol/L×0.5L＝0.05mol，NaOH摩爾質(zhì)量40g/mol，NaOH質(zhì)量=0.05mol×40g/mol=2g

（物質(zhì)的濃度=物質(zhì)的量/容量體積=物質(zhì)的質(zhì)量/摩爾質(zhì)量/容量體積）2）稱量：天平稱量2g。3）溶解：在燒杯中用100ml蒸餾水使之完全溶解，并用玻璃棒攪拌（不可在容量瓶中溶解）。4）轉(zhuǎn)移，洗滌：溶液移入500ml容量瓶，蒸餾水洗滌燒杯、玻璃棒二、三次，洗滌液注入容量瓶。輕輕振蕩容量瓶，

使溶液充分混合。（轉(zhuǎn)移時玻璃棒引流）。5）定容：加水到接近刻度2-3厘米時，改用膠頭滴管加蒸餾水到刻度。溶液凹液面的最低處和刻度線相切，眼睛

視線與刻度線呈水平，不能俯視或仰視。6）搖勻：定容后的溶液濃度不均勻，要把容量瓶瓶塞塞緊，用食指頂住瓶塞，用另一只手的手指托住瓶底，把

容量瓶倒轉(zhuǎn)和搖動多次，使溶液混合均勻。7）把定容后的NaOH溶液搖勻。把配制好的溶液倒入試劑瓶中，蓋上瓶塞，貼上標(biāo)簽。優(yōu)化實驗——實驗步驟4.試劑配制：鹽酸溶液配制以250ml0.1mol/LHCl鹽酸為例1）計算：分析純鹽酸體積=0.1mol/L*0.25L/12mol/L=2.1ml。計算公式：稀釋前濃度×稀釋前體積=稀釋后濃

度×稀釋后體積。即:C1×V1=C2×V2。2）量取100ml蒸餾水，分析純鹽酸（12mol/L，密度1.19g/ml）2.1mL轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶中。3）洗滌量筒（3次及以上），洗滌液移入容量瓶中，轉(zhuǎn)移液體時需用玻璃棒引流。4）定容，搖勻。把配制好的溶液倒入試劑瓶中，蓋上瓶塞，貼上標(biāo)簽。注：完整組培實驗中需用到不同濃度NaOH及鹽酸溶液。實驗準(zhǔn)備時可根據(jù)需要濃度及用量帶入步驟1計算公式得到藥品用量，依據(jù)上述步驟進行配置。氫氧化鈉及鹽酸溶液用做器皿洗滌劑時為方便操作可用燒杯定容。優(yōu)化實驗——實驗步驟4.試劑配制：5%NaClO(密度1.07g/mL)配制：250ml為例1）計算：稀釋前后溶質(zhì)質(zhì)量不變，根據(jù)公式ρ1*v1*c1=ρ2*v2*c2可得分析純NaClO體積=250mL*1.0g/mL*5%/10.5%/1.17g/mL=120.16ml2）移液，定容：用移液槍移取120.16ml分析純NaClO溶液于滅菌細口瓶中，將無菌水倒入細口瓶中，液面最低

處與細口瓶刻度線相切。3）搖勻：輕輕搖勻，蓋上瓶塞，用錫紙將瓶身包住，貼上標(biāo)簽。注：5%NaClO溶液是本實驗的消毒劑，因此配制過程中需在超凈工作臺中操作。稀釋中用到的槍頭、細口瓶均需經(jīng)過高壓滅菌處理。NaClO易分解需遮光保存，最好現(xiàn)配現(xiàn)用不易久置。優(yōu)化實驗——實驗步驟4.試劑配制：無菌水制備：將去離子水倒入1000ml玻璃瓶中，溶液體積占瓶子容積的4/5左右。置于高壓滅菌鍋中121℃中，

滅菌20min，冷卻備用。（滅菌時，瓶蓋不可擰緊，避免瓶身炸裂）100mg/L6-BA(50ml)溶液制備1）稱量：用分析天平稱取5mg6-BA粉末。2）溶解：加入10ml1mol/LHCl助溶。3）定容：加入蒸餾水定容搖勻，置于已烘干滅菌的離心管保存。優(yōu)化實驗——實驗步驟5.培養(yǎng)基配制：均已以1L為例發(fā)芽培養(yǎng)基（MS+1mg/L6-BA）1）配制：取1000ml燒杯，稱取4.74gMS培養(yǎng)基粉末、25g蔗糖、2g植物凝膠于燒杯中，移液槍移取10ml100mg/L6-BA加水定容至1000ml，混合均勻，用2%NaoH及2%HCl調(diào)PH至5.8。2）分裝：分裝至25個100ml三角燒瓶中，每瓶約40ml溶液。3）滅菌：用牛皮紙包扎封口，放入滅菌鍋，121℃滅菌20min，冷卻備用。生根培養(yǎng)基(MS)1）配制：取1000ml燒杯，稱取4.74gMS培養(yǎng)基粉末、25g蔗糖、2g植物凝膠于燒杯中，加水定容至1000ml，

混合均勻，用2%NaoH及2%HCl調(diào)PH至5.8。2）分裝：分裝至25個100ml三角燒瓶中，每瓶約40ml溶液。3）滅菌：用牛皮紙包扎封口，放入滅菌鍋，121℃滅菌20min，冷卻備用。建議：配制得到的培養(yǎng)基放置3-4天后使用，排除制備過程已被污染的培養(yǎng)基。優(yōu)化實驗——實驗步驟7.無菌接種：（兩人一組為例）1)試驗用具和材料的準(zhǔn)備

2)用75%酒精擦拭超凈工作臺，打開通風(fēng)，將實驗器具置于超凈工作臺中，然后打開超凈工作臺用

紫外燈殺菌30min。

（實驗用具：長芽培養(yǎng)基4個、刀具1副、小鐵架、酒精燈、打火機、廢液缸、75%酒精、2%NaClO、

濾紙、無菌水、空培養(yǎng)瓶。盡量避免重疊放置，以免降低滅菌效果。）

3)關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機，通風(fēng)30min。（開紫外燈及通風(fēng)時，實驗人員遠離超凈工作臺）

6.外植體取材及預(yù)處理：

選取健康本氏煙煙草葉片，采摘時保持葉片完整，置于潔凈培養(yǎng)皿中，軟刷刷去植株表面污物。自來水沖洗30min，置于無菌水中備用。優(yōu)化實驗——實驗步驟7.無菌接種：（兩人一組為例）4）用75％的酒精拭擦臺面并消毒雙手。將裝有煙草葉片的培養(yǎng)瓶表面酒精消毒后拿入超凈工作臺。點燃

酒精燈，所有接種操作都必須在酒精燈旁進行，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。

5）取外植體，分別在到有消毒酒精(75%，30s)、NaClO(5%,15min)培養(yǎng)瓶中浸泡消毒，無菌水洗3~4次，

置于裝有無菌水的培養(yǎng)瓶備用。6）裝有濾紙的培養(yǎng)皿置于酒精燈火焰下方打開，夾取葉片于濾紙上吸干水分，葉片剪去邊緣部分，處理為1.5*1.5矩形。7）左手持錐形瓶，右手拉開捆錐形瓶的瓶子。并將封口膜攥于右手手心，以避免封口膜接觸瓶口的一面被

污染。左手持瓶，使瓶口旋轉(zhuǎn)通過火焰；右手鑷子夾取葉片，將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，每3個一瓶，

灼燒鑷子放回鐵架臺，灼燒瓶口，牛皮紙封口，細繩包扎。

8）更換濾紙，用酒精擦洗工作臺和手，進行下一輪操作。優(yōu)化實驗——實驗步驟8.誘導(dǎo)生根（兩人一組為例）1）用75%酒精擦拭超凈工作臺，打開通風(fēng)，將實驗器具置于超凈工作臺中，打開超凈工作臺紫外燈殺菌30min。

（實驗用具：生根培養(yǎng)基4個、刀具1副、小鐵架、酒精燈、打火機、濾紙）

2）關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機，通風(fēng)30min。（開紫外燈及通風(fēng)時，遠離超凈工作臺）3）用75％的酒精拭擦臺面并消毒雙手。將裝有煙草小苗的培養(yǎng)瓶表面酒精消毒后拿入超凈工作臺。點燃酒精

燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。4）裝有濾紙的培養(yǎng)皿置于酒精燈火焰下方打開，切取約3～4cm長的無根健壯小苗。5）打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將小苗接種于培養(yǎng)基上，接種是注意方向，不可插倒，每瓶1

個，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，擰緊瓶蓋。

6）更換濾紙，用酒精擦洗工作臺和手，進行下一輪操作。優(yōu)化實驗——實驗步驟9.煉苗及移栽：1）煉苗處理：將已經(jīng)生根2cm的煙草置于白天最高溫度不超過30℃、夜間最低溫度不低于10℃的室內(nèi)2天。打開

瓶蓋，遮住一半瓶口，再相同環(huán)境中放置2天。之后完全移去瓶蓋在相同環(huán)境中放置2天，對組培苗

進行選壯去弱。2）盆土消毒：用沸水澆灌盆土進行燙土消毒殺菌，自然降溫至室溫備用。3）組培苗消毒清洗：煉苗處理后的煙草組培苗去除根部培養(yǎng)基，水洗2-3次，0.3~0.5%濃度的多菌靈消毒5~10分

鐘，水洗煙草植株出去多菌靈。4）移栽上盆：將消毒后的煙草組培苗移植盆土中。5）分株移栽：將移栽上盆后的煙草組培苗置于室內(nèi)通風(fēng)處，保持土壤濕潤，生長5~6周，待組培苗成活壯苗后，

進行分株移栽至未經(jīng)消毒的盆土中，同樣環(huán)境中成長4~5周，將盆土移植于室外遮陽處繼續(xù)生長3~5周，在將盆土移植于正常露天環(huán)境中，按常規(guī)澆水、施肥管理。優(yōu)化實驗——課程安排查閱文獻，確定選材（植株種類及部位）明確實驗步驟用具購買清洗儀器高壓滅菌，烘干備用試劑配制（消毒劑、植物激素等）培養(yǎng)基配制（長芽培養(yǎng)基：MS+1mg/L6-BA、生根培養(yǎng)基：MS）外植體取材及預(yù)處理外植體消毒、無菌接種移栽，誘導(dǎo)生根煉苗，移栽土培觀察記錄植株變化情況，討論出現(xiàn)的問題撰寫實驗報告前期準(zhǔn)備第一課時第二課時第三課時注：考慮課程時長及植物組培周期，實驗時學(xué)生進行接種、生根及煉苗實驗時可使用教師提前準(zhǔn)備好的實驗材料。消毒處理時教師進行演示實驗。優(yōu)化實驗——植株階段性變化第一周：植株葉片出現(xiàn)明顯地卷曲彎折，葉片部分區(qū)域厚度明顯增加。葉片在激素誘導(dǎo)下脫分化，

細胞分裂增殖而導(dǎo)致葉片厚度增加。由于不同區(qū)域增殖速率不同，使葉片出現(xiàn)彎折現(xiàn)象。第三周：葉片進一步彎折，植物激素誘導(dǎo)下，脫分化的葉片細胞持續(xù)增殖，導(dǎo)致葉片厚度增幅明顯，

同時出現(xiàn)淺綠色愈傷組織。由于葉片細胞自身增殖能力不同及與培養(yǎng)基接觸面積差異而導(dǎo)

致細胞增殖速率不同。第五周：愈傷組織不斷增殖，其上出現(xiàn)淺黃綠色芽點。細胞分裂素誘導(dǎo)愈傷組織不斷增殖，并誘

導(dǎo)脫分化細胞形成芽。優(yōu)化實驗——植株階段性變化生根培養(yǎng)10-12天后幼芽基部產(chǎn)生白色幼根，25天后煙草完整植株形成。生根2cm的煙草，煉苗5天選壯去弱，去除根部培養(yǎng)基，多菌靈消毒，移栽上盆。5-6周后，待組培苗成為壯苗后分株移栽。優(yōu)化實驗——實驗注意事項1)實驗所使用的器材要嚴(yán)格滅菌，注意無菌操作，避免因染菌導(dǎo)致實驗失??；2)接種時在近火焰處打開牛皮紙（瓶蓋），使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中；3)整個接種操作應(yīng)在近火焰處進行，且動作要迅速；4)接種過程中盡可能達到懸空要求；5)接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口；6)接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生；7)刀具及鑷子在灼燒后稍待冷卻后，方可進行操作避免鑷子及刀具過燙，而燙傷植物組織；8)材料脫毒時不要在酒精或升汞中停留過長時間，以免植物細胞被殺死；9)選取葉片時，應(yīng)選取新鮮且活力較強的葉片組織進行培育。防止污染優(yōu)化實驗——實驗注意事項正確錯誤整個接種操作應(yīng)在近火焰處進行，且動作要迅速。優(yōu)化實驗——實驗注意事項正確錯誤接種過程中盡可能達到懸空要求，植株不接觸瓶壁。優(yōu)化實驗——實驗注意事項

正確錯誤瓶蓋朝下放，接種完畢后立即蓋好瓶口。優(yōu)化實驗——常見問題及處理方案褐化：細胞受脅迫條件或其他不利條件影響而死亡或細胞發(fā)生自然死亡。材料傷口

分泌的酚類物質(zhì)，在多酚氧化酶作用下氧化為醌類物質(zhì)形成的。原因：外植體、培養(yǎng)基、pH值、其他培養(yǎng)條件不合適。處理：葉片已經(jīng)失活，因此必須重新實驗，同時調(diào)整實驗環(huán)境。（降低細胞分裂素濃度、培養(yǎng)基PH、植物凝膠量）污染：在葉片周圍出現(xiàn)白色粘液狀細菌或絨毛狀霉菌污染，且隨著時間推移，菌不

斷繁殖，最終完全奪取葉片營養(yǎng)導(dǎo)致葉片死亡。原因：真菌污染（消毒方案不當(dāng)）、細菌污染（主要是不規(guī)范操作造成）處理：取出植物組織重新消毒，接種于新培養(yǎng)基。褐化細菌污染真菌污染優(yōu)化實驗——常見問題及處理方案

玻璃化：試管苗呈半透明狀外觀形態(tài)異常的現(xiàn)象。植株內(nèi)源激素失調(diào)，能量代謝

受阻，蛋白質(zhì)的正常合成受抑，使分化難以順利啟動，細胞發(fā)育異常而致。

原因：植體材料差異、環(huán)境濕度、碳源、無機鹽、外源激素、溫度、光照、培養(yǎng)基pH值及其添加物等不適宜造成。

處理：玻璃化試管苗難以回到正常狀態(tài)，需要重新實驗，調(diào)整培養(yǎng)環(huán)境。1）培養(yǎng)基的硬度。提高瓊脂濃度。2）培養(yǎng)基成分。提高培養(yǎng)基的碳氮比，降低NH4+濃度或及時轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，在

其中加入適量的根本苷、活性炭或聚乙烯醇和青霉素G鉀等添加物。3）合適的培養(yǎng)環(huán)境。適當(dāng)提高光照強度，保持適宜溫度，降低濕度。4）適當(dāng)降低細胞分裂素的濃度和細胞分裂素與生長素的比例。討論反思1.前期準(zhǔn)備工作繁雜，準(zhǔn)備時間較長，需提前2-3個月準(zhǔn)備實驗材料以供生根，煉苗實驗使用。

2.實驗安排較為緊湊，人員輪換頻率高，無菌操作過程中易出現(xiàn)交叉污染。

3.學(xué)生僅嘗試部分操作，對于完整植物組織實驗認識不足。

查找文獻，尋找生長周期較短的植株。操作時注意濾紙更換，刀具灼燒消毒。人員輪換時，注意雙手消毒。依據(jù)學(xué)校實際情況及地方特色，開設(shè)組培選修課，學(xué)生能夠參與完整實驗過程。植物的組織培養(yǎng)課時安排次序?qū)嶒瀮?nèi)容課時安排備注1植物組織培養(yǎng)實驗室參觀及安全指導(dǎo)1（第一周）/2植物激素及消毒液的配制和保存1（第二周）需在超凈工作臺中進行配置，教師需提前1小時進行紫外通風(fēng)工作。3培養(yǎng)基配制及滅菌1（第三周）滅菌后教師（或安排同學(xué)）將培養(yǎng)基從高壓滅菌后拿出，置于組培間，靜置備用，取出時需輕拿輕放。4外植體消毒、接種1（第四周）接種需在無菌環(huán)境中進行，教師需提前滅菌實驗用具，并將其置于超凈工作中。實驗前1小時完成紫外通風(fēng)工作。5植物組織培養(yǎng)理論講解3（第五--七周）學(xué)生每三天觀察、記錄植物組織變化，撰寫實驗報告。6小組報告，課堂交流，探討實驗出現(xiàn)問題，分析實驗結(jié)果2（第八--九周）結(jié)合課堂交流，小組完善實驗報告。7實驗器材清洗、處理1（第十周）實驗垃圾分類處理。開設(shè)學(xué)期：春學(xué)期試題解析——生物競賽2017年全國中學(xué)生生物學(xué)聯(lián)賽試題50.

在植物組織培養(yǎng)中，理論上下列哪種激素的配方有利于芽的形成：

B

A.

6-BA

:IAA=1:1

B.

6-BA

:IAA

=3:1

C.

6-BA

:IAA

=1:351.

細胞分裂素的特異效應(yīng)表現(xiàn)在：

D

A.

促進不定根的形成

B.

抑制側(cè)芽生長

C.

延遲開花

D.

促進愈傷組織分化不定芽（叢芽）39.在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中，可以通過珠心組織培養(yǎng)獲得無病毒植株，這是因為A

A.珠心組織與維管組織沒有直接聯(lián)系

B.珠心組織與分泌組織沒有直接聯(lián)系

C.珠心組織與分生組織沒有直接聯(lián)系

D.珠心組織與保護組織沒有直接聯(lián)系2016年全國中學(xué)生生物學(xué)聯(lián)賽試題試題解析——生物競賽2017年浙江省高中生物競賽試卷33.將某種植物種子放在黑暗中萌發(fā)，并在生長狀況相同的一些胚芽鞘分別對應(yīng)截取三種切段即S1、S2、S3。然后把這三種切段分別放在不含IAA和赤霉素、含赤霉素、含IAA三種相同濃度的溶液中，培養(yǎng)3天后，測量切段長度，結(jié)果如下圖DA.若從幼根獲取相應(yīng)切段進行處理，結(jié)果與上圖無明顯差異B.不同種類激素對同一器官不同年齡細胞的作用無明顯差異C.該實驗證明赤霉素促進切段伸長的效果顯著優(yōu)于IAAD.該實驗無法證明赤霉素和IAA共同作用的效果試題解析——高考生物(1)利用植物愈傷組織獲得再生植株主要有兩條途徑:一是由愈傷組織的細胞先分化產(chǎn)生芽和根后再形成一個完整植株的器官發(fā)生途徑,二是由愈傷組織細胞產(chǎn)生胚狀體后再萌發(fā)形成完整植株的胚胎發(fā)生途徑。另外也可不通過愈傷組織階段而直接采用腋芽帶的莖段培養(yǎng)成叢狀苗,再誘導(dǎo)生根獲得再生植株,其原因是腋芽中存在分生組織。(2)利用植物克隆培育新品種,一方面可利用帶有目的基因的農(nóng)桿菌侵染植株，或通過顯微注射的方法導(dǎo)入植物細胞、組織、器官獲得轉(zhuǎn)基因，另一方面利用異源植株的原生質(zhì)體進行融合產(chǎn)生雜種植株,或利用異源因植株在試管內(nèi)進行受精,對其產(chǎn)生的胚進行培養(yǎng)產(chǎn)生雜種植株。(3)下列屬于植物克隆和動物克隆共有培養(yǎng)方法是（A）A懸浮培養(yǎng)、器官培養(yǎng)B.貼壁培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)C.器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)D.原生質(zhì)體培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)32、【加試題】回答與植物克隆和動物克隆有關(guān)的問題:2017年11月浙江省普通高校招生選考生物科試卷試題解析——高考生物32．【加試題】（二）某小組欲進行煙草原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)的研究，請回答：（1）原生質(zhì)體的分離：在無菌條件下，取煙草無菌苗的葉片，放入含有0.5mol/L的甘露醇（維持較高滲透壓）的果膠酶和纖維素酶混合液處理，經(jīng)過離心純化后獲得原生質(zhì)體。（2）原生質(zhì)體的培養(yǎng)：將原生質(zhì)體進行培養(yǎng)，重新長出細胞壁，形成胚性細胞，此時，應(yīng)該降低培養(yǎng)基中甘露醇的濃度，以利于胚性細胞繼續(xù)培養(yǎng)形成細胞團，然后經(jīng)兩次途徑形成再生植株。途徑一：細胞團形成球胚、心形胚和胚狀體，最好發(fā)育成植株。途徑二：細胞團增殖為愈傷組織，然后在發(fā)芽培養(yǎng)基上又到出芽，切割芽經(jīng)過生根后形成完整植株。上述發(fā)芽培養(yǎng)基中含量相對較高的激素是細胞分裂素、胚性細胞的主要特點是D

。（A.液泡小、細胞核小B.液泡大、細胞核大C.液泡大、細胞核小D.液泡小、細胞核大）（3）為了對煙草的某些性狀進行改良，分離得到兩種煙草的原生質(zhì)體，通過原生質(zhì)體融合方法將它們的遺傳物質(zhì)組合在一起，經(jīng)培養(yǎng)獲得具有新性狀的再生植株，提取再生植株的DNA，采用PCR技術(shù)擴增相關(guān)基因，來鑒定遺傳物質(zhì)是否成功重組。2016年10月浙江省普通高校招生選考科目考試生物試題在進行外植體消毒時，消毒效果最好的消毒液是———，實驗中經(jīng)常用的是下面哪些激素經(jīng)常被用于誘導(dǎo)叢生芽參考文獻[1]陳芝娟.RNA沉默介導(dǎo)的本氏煙抗ORSV/CymMV病毒株的研究[D].杭州師范大學(xué),2013.[2]馬璐琳,王祥寧,王繼華,等.一種提高煙草K326組培苗移栽成活率的煉苗過渡方法:,CN104920048A[P].2015.[3]潘娟,李先源,李名楊.植物組織培養(yǎng)過程中常見問題及解決方法[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(6):2392-2394.[4]周健博.基于選修教材的“植物組織培養(yǎng)”課程開發(fā)[J].生物學(xué)教學(xué),2013,38(9):17-18.[5]姚曉惠,張峰,等.植物組織培養(yǎng)課程實驗教學(xué)改革的探討[J].商丘師范學(xué)院學(xué)報,2007,23(6):125-127.[6]田士林,李莉.植物激素對愈傷組織形成和根芽分化的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(14):4132-4132.[7]吳映明,關(guān)見留,龔玉蓮.植物組織培養(yǎng)實驗的幾點問題及其改進方法[J].廣東第二師范學(xué)院學(xué)報,2003,23(2):74-77.[8]譚潔敏,黃勝琴,許德成.“胡蘿卜的組織培養(yǎng)”消毒方法的優(yōu)化[J].生物學(xué)通報,2016,51(7):50-52.[9]邱豐艷,徐前杰,林小燕.《生物學(xué)教學(xué)論》綜合設(shè)計性實驗探索與實踐——胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)實驗的探究[J].龍巖學(xué)院學(xué)報,2010,28(2):113-116.參考文獻[10]羅文俊.胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)試驗及改進[J].文理導(dǎo)航,2015(26):63-63.[11]黃元國.因陋就簡開展胡蘿卜組織培養(yǎng)實驗[J].生物學(xué)教學(xué),2009,34(10):39-40.[12]倫君,張元國,徐香梅,等.菊花的組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程[J].北方園藝,2011(9):151-151.[13]吳相鈺,劉恩山.生物學(xué),選修1,生物技術(shù)實踐[M].浙江科學(xué)技術(shù)出版社,2005.[14]吳相鈺,劉恩山.生物學(xué),教師教學(xué)用書,選修三[M].浙江科學(xué)技術(shù)出版社,2007.[15]生物課程教材研究中心.生物:生物技術(shù)實踐[M].人民教育出版社,2007.[16]生物課程教材研究中心.生物:現(xiàn)代生物科技專題[M].人民出版社,2007.[17]李浚明,朱登云.植物組織培養(yǎng)教程[M].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2005.[18]曾艷玲,張黨權(quán),譚曉風(fēng),等.《植物組織培養(yǎng)》理論與實踐教學(xué)模式改革探討[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(社會科學(xué)版),2013,7(4):168-170.一、植物組織培養(yǎng)實驗室的結(jié)構(gòu)及