鴿子性別鑒定的PCR方法

I鴿子性別鑒定的PCR方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴿子性別鑒定的PCR操作方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各種品類、各日齡鴿子的性別鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求NY/T541—2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范試劑或材料除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水均符合GB/T6682二級(jí)水規(guī)定。肝素鈉：配制方法見(jiàn)附錄A.1。TAE電泳濃縮緩沖液：配制方法見(jiàn)附錄A.2。X脂糖：配制方法見(jiàn)附錄A.3。雄性鴿子對(duì)照、雌性鴿子對(duì)照均為已知性別的鴿子全血DNA作為模板，-20℃保存。儀器設(shè)備4℃冰箱（溫控范圍2℃～8℃）。離心管（1.5mL～2mL）。PCR儀。電泳儀（電壓90V～120V）。凝膠成像儀。高壓滅菌鍋（滅菌溫度：105℃～135℃；工作壓力：≤0.35MPa）。微量移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）及配套吸頭。樣品采集、儲(chǔ)存及運(yùn)輸按NY/T541—2016規(guī)定進(jìn)行采樣。用無(wú)菌針頭于鴿子爪處刺破皮膚，吸取20μL全血并與3μL～5μL肝素鈉（參見(jiàn)附錄A.1）混合，編號(hào)。樣品采集和樣品處理應(yīng)戴一次性手套，不得交叉污染。采集的樣品儲(chǔ)存和運(yùn)輸，參見(jiàn)NY/T541—2016。試驗(yàn)步驟本實(shí)驗(yàn)具體實(shí)驗(yàn)操作符合GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求。引物參照參考文獻(xiàn)（劉宏祥等，2013），合成針對(duì)鴿子雌雄性別染色體CHD基因的一對(duì)引物（A1/A2）作為鴿子性別鑒定的引物，引物序列參見(jiàn)附錄B。PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為25μL，引物為A1/A2，模板為采集的鴿子抗凝全血，PCR反應(yīng)體系參見(jiàn)附錄C。PCR反應(yīng)條件為95℃5min、55℃5min循環(huán)2次裂解紅細(xì)胞，釋放DNA，然后94℃預(yù)變性5min，94℃40s、50℃30s、72℃40s，循環(huán)擴(kuò)增31次，最后72℃延伸7min。同時(shí)設(shè)立雄性和雌性鴿子的DNA為對(duì)照。PCR產(chǎn)物電泳取8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1.2%的X脂糖凝膠電泳（120V，30min～50min）。電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果，拍照并做好試驗(yàn)記錄。結(jié)果判定試驗(yàn)成立條件雄性對(duì)照的PCR產(chǎn)物電泳后，在600bp的位置出現(xiàn)一條特異性的擴(kuò)增條帶，雌性對(duì)照PCR產(chǎn)物電泳后在450bp和600bp處均有擴(kuò)增條帶，試驗(yàn)結(jié)果成立。否則試驗(yàn)結(jié)果不成立。（見(jiàn)附錄D）結(jié)果判定雄性：檢測(cè)樣品PCR產(chǎn)物電泳后，僅有600bp的一條帶，則鴿子性別為雄性。雌性：檢測(cè)樣品PCR產(chǎn)物電泳后，有450bp和600bp的兩條帶，則鴿子性別為雌性。

（規(guī)范性附錄）

溶液配制肝素鈉抗凝劑150mg肝素鈉粉末（150U/mg）與100mL生理鹽水混合溶解。TAE電泳緩沖液使用時(shí)將50倍TAE電泳濃縮緩沖液用去離子水50倍稀釋即可。50倍TAE電泳濃縮緩沖液配制方法為：取Tris堿242g去離子水溶解，加入冰醋酸57.1mL、0.5mol/LEDTA100mL，用5mol/L的NaOH調(diào)pH至8.0，定容至1000mL。1.2%X脂糖凝膠稱取1.2gX脂糖，加入100mLTAE緩沖液中加熱溶解，最后加入適量核酸染料。2×TaqMasterMix成分TaqDNAPolymerase

0.1U/μLMgCl23mMdNTPs0.4mM2×PCR反應(yīng)緩沖液

（規(guī)范性附錄）

PCR引物序列PCR引物序列見(jiàn)表B.1。PCR引物序列引物（primer）序列（sequence）A15'-AGTGCATTGCAGAAGCAATATT-3'A25'-GCCTCCTGTTTATTATAGAATTCAT-3'

（資料性附錄）

PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表C.1。PCR反應(yīng)體系組分體積（μL）水10.32×Mix12.5上游引物（25μmoL/L）1.0下游引物（25μmoL/L）1.0模板0.2總體積